大連日本對蝦5種流行病原體的調(diào)查

任雪，陳文博，丁勇，張賽賽，曾范雙，韓雨哲，任同軍*

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 大連 116023）

日本對蝦（）俗稱花蝦、竹節(jié)蝦等，對蝦科（Penaeidae）、對蝦屬（），是一種適溫性廣、生長迅速、營養(yǎng)豐富的重要養(yǎng)殖品種。隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的日漸龐大，對蝦病害頻發(fā)，嚴(yán)重威脅對蝦養(yǎng)殖業(yè)。

對蝦血細(xì)胞虹彩病毒（SHIV）是一種易致病、高致死的新型虹彩病毒。受其感染的對蝦出現(xiàn)空胃、空腸、肝胰腺發(fā)白和甲殼變軟等癥狀，嚴(yán)重時(shí)死亡。白斑綜合征病毒（WSSV）具有極強(qiáng)的傳染性，極易感染蝦類等甲殼動(dòng)物，在對蝦被感染后的3～7 d內(nèi)，累計(jì)病死率可達(dá)100%。傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV），感染后對蝦的典型癥狀表現(xiàn)為生長緩慢和表皮畸形等，病死率極高，現(xiàn)已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）收錄為甲殼類重要疫病之一。急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌（AHPND,VP）最初被稱為早期死亡綜合征（EMS），典型癥狀為肝胰腺萎縮發(fā)白、空胃空腸、甲殼變軟和活力喪失等。蝦肝腸胞蟲（,EHP）是一種主要寄生于對蝦肝胰腺中的專性細(xì)胞內(nèi)的微孢子蟲，病蝦感染后出現(xiàn)生長緩慢甚至停滯、肌肉渾濁發(fā)白的癥狀，即“棉花蝦”，還會(huì)增加細(xì)菌繼發(fā)感染的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，我國已有諸多省市開展了對蝦易感病原體的調(diào)查，然而鮮有關(guān)于大連地區(qū)日本對蝦病原體的報(bào)道?，F(xiàn)對大連地區(qū)日本對蝦病原的分布及檢出情況進(jìn)行了調(diào)查，可為研究制定大連市對蝦養(yǎng)殖業(yè)的病害綜合防控措施、推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年9月，在遼寧省大連市日本對蝦主要養(yǎng)殖區(qū)域（圖1）（瓦房店沙山、瓦房店仙浴灣、金州杏樹屯、普蘭店城子坦、金州石河、莊河大鄭、莊河打拉腰和莊河青堆）采集成蝦樣本。依據(jù)隨機(jī)采樣的原則，從每個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域中隨機(jī)采集的20尾日本對蝦樣本用液氮冷藏，并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室?；蚪MDNA（gDNA）提取試劑盒等均來自廣州艾基生物技術(shù)有限公司。

圖1 大連市日本對蝦主要養(yǎng)殖區(qū)域分布

1.2 方法

在無菌條件下，將對蝦的鰓絲和肝胰腺研磨制成勻漿液，隨后轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，保存于-20℃冰箱內(nèi)。按照gDNA提取試劑盒的操作方法提取對蝦組織DNA，利用Nanodrop 2000檢測其濃度，并保存于-20℃冰箱內(nèi)。

1.3 PCR檢測

分別以SHIV、WSSV、IHHNV、VP和EHP檢測結(jié)果呈陽性的DNA和無菌去離子水為模板，進(jìn)行陽性對照和陰性對照擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，陽性產(chǎn)物送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的基因序列進(jìn)行比對，進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.1 SHIV檢測

采用套式PCR法檢測樣本。第一輪PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×Pro Taq Master Mix 5μL，待檢DNA模板1.0μL，上下游引物（10 mmol/L）各2.0μL（表1），加滅菌水補(bǔ)足至50.0μL；第二輪PCR反應(yīng)體系：將第一步擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，再次進(jìn)行擴(kuò)增。第1輪擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保溫。第2輪擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，59℃30 s，72℃20 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保溫。

表1 PCR擴(kuò)增體系引物序列

續(xù)表

1.3.2 WSSV檢測

采用《白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分：套式PCR檢測法》（GB/T 28630.2—2012）檢測樣本。PCR反應(yīng)體系與SHIV檢測相同。第1輪擴(kuò)增程序：90℃預(yù)變性2 min；94℃4 min，55℃1 min，72℃2 min，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保溫。第2輪擴(kuò)增程序：90℃預(yù)變性2 min；94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保溫。

1.3.3 IHHNV檢測

采用《對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）檢測PCR法》（GB/T 25878—2010）檢測樣本。PCR反應(yīng)體系與SHIV檢測中的第一輪PCR反應(yīng)體系相同。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保溫。

1.3.4 VP檢測

采用OIE 2.2.1（2018版）AP4套式PCR方法檢測樣本。PCR反應(yīng)體系與SHIV檢測中的第一輪PCR反應(yīng)體系相同。第1輪擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保溫。第2輪擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃20 s，55℃20 s，72℃20 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 s，4℃保溫。

1.3.5 EHP檢測

采用套式PCR法檢測樣本。PCR反應(yīng)體系與SHIV檢測中的第一輪PCR反應(yīng)體系相同。第1輪擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，68℃45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min，4℃保溫。第2輪擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，64℃30 s，68℃20 s，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；68℃延伸5 min，4℃保溫。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本對蝦5種病原體的總體檢出情況

從160尾日本對蝦中獲得157份鰓絲、肝胰腺樣本（余下3份對蝦提取組織DNA未成功）。其中用于檢測SHIV、WSSV的樣本取自日本對蝦的鰓絲，IHHNV、VP、EHP的樣本取自日本對蝦的肝胰腺。檢測結(jié)果見表2。由表2可見，WSSV是5種病原體中檢出率最高的一種。

表2 8個(gè)地區(qū)日本對蝦樣本中SHIV、WSSV、IHHNV、VPAHPND和EHP的檢測結(jié)果

2.2 不同地區(qū)日本對蝦5種病原體檢出情況

大連不同地區(qū)日本對蝦SHIV和WSSV檢出情況見表3，IHHNV、VP和EHP檢出情況見表4。表中樣本數(shù)為每20個(gè)樣本能夠提取DNA的樣本數(shù)。

2.2.1 SHIV

由表3可見，除金州區(qū)杏樹屯外，其余7個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖的日本對蝦體內(nèi)均有SHIV檢出。瓦房店沙山和莊河青堆陽性檢出率最高，均為10.00%，其余5個(gè)地區(qū)檢出率約5.00%。

2.2.2 WSSV

由表3可見，8個(gè)地區(qū)均有WSSV檢出。莊河大鄭的陽性檢出率最高，為20.00%。

表3 大連不同地區(qū)日本對蝦SHIV和WSSV檢出情況

2.2.3 IHHNV

由表4可見，瓦房店仙浴灣的IHHNV陽性檢出率最高，金州石河和莊河大鄭次之，普蘭店城子坦未見陽性樣品檢出，其余4個(gè)地區(qū)的陽性檢出率約5.00%。

2.2.4 VP

由表4可見，莊河大鄭、金州杏樹屯和莊河青堆3個(gè)地區(qū)有VP陽性檢出結(jié)果，陽性率分別為10.00%，5.26%和5.00%；其余5個(gè)地區(qū)則未見陽性樣品檢出。

2.2.5 EHP

由表4可見，EHP陽性檢出率最高的地區(qū)為瓦房店沙山，高達(dá)25.00%，瓦房店仙浴灣和莊河大鄭次之，其余5個(gè)地區(qū)的陽性率約5.00%。

表4 大連不同地區(qū)日本對蝦IHHNV，VPAHPND和EHP檢出情況

續(xù)表

3 討論

3.1 SHIV防控措施

本次日本對蝦病原體檢出結(jié)果顯示，SHIV檢出率雖然不高，但在大連各日本對蝦養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)依然廣泛存在。SHIV自2017年首次發(fā)現(xiàn)至今，感染原因、作用機(jī)制、治療手段等方面尚未完全成熟，因此目前仍以預(yù)防為主。大連地區(qū)對蝦養(yǎng)殖者應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）選購有檢疫合格證或直營場的健康苗種；（2）加強(qiáng)對養(yǎng)殖水質(zhì)的監(jiān)控，水溫、氨氮、機(jī)械刺激等都是誘發(fā)SHIV的重要因素，需定期為水體消毒，保證水體健康且穩(wěn)定；（3）實(shí)時(shí)監(jiān)控養(yǎng)殖對蝦的狀態(tài)，及時(shí)撈出病、死蝦，同時(shí)采取有效措施防止其繼續(xù)擴(kuò)散。

3.2 WSSV防控措施

調(diào)查結(jié)果顯示，各病原體中，WSSV陽性檢出率最高。雖然對WSSV的研究已經(jīng)深入到分子水平，但在我國各地均有檢出，且無特效的治療藥物，這就要求養(yǎng)殖業(yè)者進(jìn)行科學(xué)的管理。（1）對池塘、濾水、進(jìn)排水設(shè)施等進(jìn)行全面消殺，保證良好的養(yǎng)殖環(huán)境；（2）實(shí)時(shí)監(jiān)控溫度、溶解氧、氨氮和鹽度等物理指標(biāo)，保證水質(zhì)穩(wěn)定；（3）適當(dāng)應(yīng)用免疫刺激劑、疫苗等以增強(qiáng)對病毒的抗性，從而提高抗病力；（4）加強(qiáng)對WSSV的監(jiān)測與防控，了解并掌握其流行特點(diǎn)及發(fā)生規(guī)律等。

3.3 IHHNV防控措施

調(diào)查結(jié)果顯示，IHHNV存在但檢出率普遍不高。IHHNV可通過垂直、水平2種傳播方式擴(kuò)散感染，感染后終生帶毒，而且能感染任何生長階段的對蝦。目前，病毒性體疾病仍以預(yù)防為主，要結(jié)合大連當(dāng)?shù)貙ξr病原體的流行情況，選育、繁育真正的無特定病原體對蝦，將對蝦、餌料和水質(zhì)這三者平衡在一個(gè)相對穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)，改善IHHNV檢測技術(shù)，努力實(shí)現(xiàn)更加快速且精確檢測的目標(biāo)。

3.4 VPAHPND防控措施

調(diào)查結(jié)果顯示，8個(gè)采樣點(diǎn)中只有3個(gè)有陽性檢出，總體上表現(xiàn)出較好的態(tài)勢，但其仍會(huì)長期影響我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，對VP的綜合防控主要有以下幾個(gè)措施：（1）在對蝦飼料中添加有機(jī)酸、植物或植物提取物、疫苗等，以保護(hù)對蝦肝胰腺、幫助其抵御寒冷以及提高其對抗副溶血弧菌的免疫力等；（2）改善對蝦養(yǎng)殖環(huán)境，包括合理控制放養(yǎng)密度、實(shí)時(shí)監(jiān)控水質(zhì)、適當(dāng)添加益生菌以及充分的曝氣等，文獻(xiàn)[22]表明，增加向池塘注水的頻率可以降低對蝦感染的概率；（3）將微生物管理策略和生態(tài)學(xué)理論充分應(yīng)用于VP的預(yù)防上，把池塘微生物作為一個(gè)整體進(jìn)行研究，而不是單單關(guān)注某一病原體，并把重點(diǎn)放在如何消除VP感染上，而不是如何控制其感染。

3.5 EHP防控措施

本次調(diào)查中，瓦房店沙山的EHP陽性檢出率最高，達(dá)25.00%。感染EHP的對蝦雖不致死，但會(huì)使對蝦出現(xiàn)明顯的生長遲緩、質(zhì)量不均等現(xiàn)象。目前尚無有效的治療方法，主要以預(yù)防為主。（1）務(wù)必加強(qiáng)對親蝦的檢驗(yàn)檢疫力度，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，從源頭上降低對蝦感染EHP的風(fēng)險(xiǎn)；（2）放養(yǎng)前一定要做好徹底消殺，以殺滅一些有害的病原體，并對進(jìn)排水設(shè)施以及排出的尾水進(jìn)行全面消毒；（3）嚴(yán)格把控水質(zhì)和放養(yǎng)密度，及時(shí)處理病死蝦；（4）對鮮活的餌料進(jìn)行消毒處理；（5）可通過適當(dāng)添加微生態(tài)制劑等來提高對蝦的抗病力與免疫力等，以確保對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié)論

2020年9月，大連地區(qū)養(yǎng)殖日本對蝦的最主要流行病原體為WSSV，其次為EHP、IHHNV、SHIV、VP。此外，瓦房店沙山和莊河青堆的SHIV檢出率最高，莊河大鄭的WSSV和VP檢出率最高，瓦房店仙浴灣和瓦房店沙山的IHHNV和EHP檢出率最高。廣大對蝦養(yǎng)殖者，應(yīng)在疫病源頭上做好綜合防控，避免水體污染、交叉感染、環(huán)境脅迫和病害大面積暴發(fā)等。