強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及臨床意義

陳溶微 謝文靜 江裕 馬國斌

【摘要】 目的 探討強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis， AS）患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的變化及臨床意義，為其臨床診治提供參考。

方法 選擇福州市第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科及骨科在2018年10月至2021年3月收治的80例AS患者作為研究對(duì)象，根據(jù)Bath AS疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（BASDAI）不同將患者分為非活動(dòng)組（n=50，BASDAI<4）和活動(dòng)組（n=30，BASDAI≥4）兩組，另取同期體檢的50名健康者作為對(duì)照組。比較各組受試者相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)變化，觀察各組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28+Tc、CD8+CD28-Treg及CD8+CD28+/CD8+CD28-值差異，采用Pearson法對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28+ Tc、CD8+CD28-Treg及CD8+CD28+/CD8+CD28-與BASDAI、血沉（ESR）、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）的相關(guān)性進(jìn)行分析。

結(jié)果 活動(dòng)組的BASDAI分級(jí)評(píng)分高于非活動(dòng)組，活動(dòng)組和非活動(dòng)組的血清hs-CRP、ESR水平均明顯高于對(duì)照組，且活動(dòng)組高于非活動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?；顒?dòng)組和非活動(dòng)組的外周血CD8+CD28+/CD8+CD28-、CD8+CD28+Tc細(xì)胞值及血清IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IL-6水平均明顯高于對(duì)照組，外周血CD8+CD28-Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg均明顯低于對(duì)照組，且活動(dòng)組上述指標(biāo)變化更為顯著（P<0.05）。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，CD4+CD25+Foxp3+Treg與BASDAI分級(jí)、ESR及hs-CRP均呈負(fù)相關(guān)（P<0.001），CD8+CD28+Tc及CD8+CD28+/CD8+CD28-值與BASDAI分級(jí)均呈正相關(guān)（P<0.05）。

結(jié)論 外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)異常，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中作用顯著，且與AS疾病BASDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，具有一定的臨床參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 強(qiáng)直性脊柱炎;活動(dòng)度;CD4+CD25+Foxp3+;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R593.23?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.04.007

Changes and clinical significance of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in peripheral blood of patients with ankylosing spondylitis

CHEN Rongweia， XIE Wenjinga， JIANG Yua， MA Guobinb▲

（a. Department of Laboratory Medicine， b. Department of Cardiology， The Second Hospital of Fuzhou City， Fuzhou 350007， Fujian， China）

【Abstract】 Objective To investigate the changes and clinical significance of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells （Treg） in peripheral blood of patients with ankylosing spondylitis （AS）， so as to provide references for clinical diagnosis and treatment.

Methods 80 AS patients admitted to the Department of Rheumatology and Immunology and Orthopedics of The Second Hospital of Fuzhou City from October 2018 to March 2021 were selected as research objects. According to the Bath AS disease activity index score （BASDAI）， patients were divided into inactive group （n=50， BASDAI<4） and active group （n=30， BASDAI≥4）. In addition， 50 healthy people who received physical examination during the same period were selected as control group. The changes of relevant serum indexes of subjects in each group were compared， and the differences of CD4+CD25+Foxp3+Treg， CD8+CD28+Tc， CD8+CD28-Treg and CD8+CD28+/CD8+CD28- values in peripheral blood of each group were observed. In addition， Pearson method was used to analyze the correlation between CD4+CD25+Foxp3+Treg， CD8+CD28+Tc， CD8+CD28-Treg， CD8+CD28+/CD8+CD28- and BASDAI， erythrocyte sedimentation rate（ESR）， and hypersensitive C-reactive protein（hs-CRP）.

Results The BASDAI grading score of the active group was significantly higher than that of the inactive group， the levels of serum hs-CRP and ESR in the active group and the inactive group were significantly higher than those in the control group， and those of the active group were higher than those in the inactive group， and difference was statistically significant （P<0.05）. The CD8+CD28+/CD8+CD28- and CD8+CD28+Tc cell values in peripheral blood and serum IL-17A， IFN-γ， TNF-α， IL-6 levels of the active group and the inactive group were significantly higher than those of the control group， while the? CD8+CD28-Treg and CD4+CD25+Foxp3+Treg in peripheral blood were significantly lower than those in the control group， and the changes in the above indicators in the active group were more significant（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that CD4+CD25+Foxp3+Treg was negatively correlated with BASDAI grading， ESR and hs-CRP（P<0.001）， CD8+CD28+Tc and CD8+CD28+/CD8+CD28-values were positively correlated with BASDAI grading（P<0.05）.

Conclusion The abnormal expression of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in peripheral blood plays a significant role in the development of the disease， and it is negatively correlated with the BASDAI score of AS disease， which has certain clinical reference value.

【Key words】 AS; mobility; CD4+CD25+Foxp3+; regulatory T cells

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis， AS）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，臨床主要特征為關(guān)節(jié)強(qiáng)直，椎間盤纖維環(huán)及其附近的結(jié)締組織骨化、纖維化，脊柱和骶髂關(guān)節(jié)附著點(diǎn)炎癥[1]。在我國AS的患病率為0.3%左右，且病程相對(duì)較長，多以男性為主，具有較高的致殘率[2]。目前關(guān)于AS的發(fā)病機(jī)制及病因尚未有權(quán)威性說明，相關(guān)研究顯示，AS的發(fā)生發(fā)展與淋巴細(xì)胞亞群功能異常、比例失衡、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂以及T細(xì)胞異常激活關(guān)系較為密切[3]。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一類CD4+T細(xì)胞亞群，具有一定的免疫負(fù)調(diào)節(jié)功能，可通過抑制細(xì)胞間接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子等途徑，對(duì)炎癥細(xì)胞因子分泌、活化以及效應(yīng)T細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制，從而達(dá)到對(duì)自身免疫耐受進(jìn)行維持，發(fā)揮抗炎的效果[4]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種在胸腺合成、分化及成熟的具有免疫功能的細(xì)胞亞群[5]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，多種自身免疫性疾病存在Treg功能和數(shù)量上的平衡失調(diào)[6～7]。但不同表型的Treg細(xì)胞在AS體內(nèi)的表達(dá)異常情況，以及與病情活動(dòng)度的關(guān)系尚未解釋清楚。故本文探討AS患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的變化及臨床意義，為其臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院風(fēng)濕免疫科及骨科在2018年10月至2021年3月收治的80例AS患者作為研究對(duì)象，根據(jù)Bath AS疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（BASDAI）不同將患者分為非活動(dòng)組（n=50，BASDAI<4）和活動(dòng)組（n=30，BASDAI≥4）兩組。其中非活動(dòng)組患者男43例，女7例，年齡18～50歲，平均（30.76±4.09）歲，病程0.2～30年，平均（6.57±4.18）年;活動(dòng)組患者男27例，女3例，年齡16～50歲，平均（30.40±5.09）歲，病程0.3～30年，平均（6.76±5.10）年。另取同期在我院體檢的50名健康者作為對(duì)照組，其中男41人，女9人，年齡19～48歲，平均（29.32±4.47）歲。各組受試者在年齡、性別等一般資料方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P>0.05）。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合1984年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的關(guān)于AS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];②疾病活動(dòng)度符合2009年國際脊柱關(guān)節(jié)炎協(xié)會(huì)（ASAS）制定新AS病情活動(dòng)度評(píng)分中的相關(guān)規(guī)定[9];③經(jīng)本院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施（180612）;④所有受試者均簽署知情協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并炎癥疾病、自身免疫性疾病及風(fēng)濕病者;②合并嚴(yán)重的心肝腎功能障礙者;③妊娠哺乳期者;④近期經(jīng)過糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑治療者;⑤腫瘤、感染引發(fā)的關(guān)節(jié)疼痛者;⑥合并高熱、肺部或肝膽道感染、嚴(yán)重的上呼吸道感染及敗血癥者;⑦合并周圍血管栓塞性疾病或者周圍血管疾病者;⑧依從性差，中途退出者。

1.3 方法

1.3.1 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀為BD公司生產(chǎn)的FACScaibur型號(hào);低速離心機(jī)購于上海手術(shù)器械廠;微型旋渦混合器購于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠的WXH型號(hào)。FACSTM Lysing solution紅細(xì)胞裂解液、磷酸緩沖液（PBS）、HLA-B27試劑盒、PE-CY7-鼠抗人CD3抗體、APC-鼠抗人CD25、PE-鼠抗人CD28、PE-鼠抗人CD127、FITC-鼠抗人CD4、FITC-鼠抗人CD8及Foxp3試劑盒均購于美國BD公司。

1.3.2 外周血Treg水平檢測

取所有受試者清晨8～9點(diǎn)的2 mL空腹靜脈全血，抗凝采用EDTA-K2處理。取4支流式檢測管，將上述處理好的50 μL抗凝靜脈全血置于其中，并編號(hào)1、2、3、4，之后分別向檢測管1和3中加入APC-鼠抗人CD25、PE-鼠抗人CD127、FITC-鼠抗人CD4以及與此相對(duì)應(yīng)的同型抗體，之后再在檢測管2和4中加入PE-CY7-鼠抗人CD3抗體、PE-鼠抗人CD28、FITC-鼠抗人CD8以及與此相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體，每種抗體的用量5 μL，渦旋對(duì)上述檢測管進(jìn)行混勻處理，之后在室溫條件下，進(jìn)行30 min的避光孵育，再將2 mL的10紅細(xì)胞裂解液加入其中，混勻后在避光室溫條件下進(jìn)行10 min的孵育，直到紅細(xì)胞全部溶解以后，再將3 mL的PBS加入其中，3000 rpm條件下進(jìn)行5 min的離心，棄去上清液，重復(fù)上述操作1次，再將PBS重懸細(xì)胞500 μL加入其中，之后通過流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測。通過側(cè)向散射角和前向散射角對(duì)門圈進(jìn)行設(shè)置，將淋巴細(xì)胞取出，再分別利用CD8和側(cè)向散射角、CD4和側(cè)向散射角對(duì)門圈進(jìn)行設(shè)置，將CD8+和CD4+淋巴細(xì)胞取出，對(duì)CD8+淋巴細(xì)胞上的CD28和CD4+淋巴細(xì)胞上的CD127、CD25表達(dá)情況進(jìn)行測定，并計(jì)算CD8+CD28-Treg占總淋巴細(xì)胞比例、CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+淋巴細(xì)胞比例。每次獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞10 000個(gè)以上，F(xiàn)lowjo和Diva軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，F(xiàn)oxp3的檢驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書執(zhí)行。

1.3.3 相關(guān)臨床指標(biāo)測定

采集5 mL的外周靜脈血，將其置于干燥管中，之后3000 rpm條件下離心10 min，取上清液，-80℃條件下保存待用。血清超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）采用散射免疫比濁法進(jìn)行檢測，血清血沉（ESR）采用魏氏法進(jìn)行測定。

1.3.4 血清炎癥因子水平

采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)血清白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素17A（IL-17A）進(jìn)行測定，試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司，操作方法嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料描述為（±s），多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較行χ2檢驗(yàn);采用Pearson法對(duì)相關(guān)性進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 各組受試者相關(guān)臨床指標(biāo)變化

活動(dòng)組的BASDAI分級(jí)評(píng)分高于非活動(dòng)組，活動(dòng)組和非活動(dòng)組的血清hs-CRP、ESR水平均明顯高于對(duì)照組，且活動(dòng)組高于非活動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表1。

2.2 各組受試者血清炎癥因子水平變化

活動(dòng)組和非活動(dòng)組的血清IL-17A、TNF-α及IL-6水平均明顯高于對(duì)照組，且活動(dòng)組上述血清炎癥因子升高更為顯著（P<0.05）;而活動(dòng)組IFN-γ水平高于對(duì)照組，非活動(dòng)組IL-2則高于對(duì)照組（P<0.05）。見表2。

2.3 各組受試者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28+Tc、CD8+CD28-Treg及CD8+CD28+/CD8+CD28-值變化

活動(dòng)組和非活動(dòng)組的外周血CD8+CD28+/CD8+CD28-、CD8+CD28+Tc細(xì)胞值均明顯高于對(duì)照組，CD8+CD28-Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg均明顯降低，且除CD8+CD28-Treg外，活動(dòng)組上述T細(xì)胞變化更為顯著（P<0.05）。見表3。

2.4 CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28-Treg與BASDAI、ESR、hs-CRP相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，CD4+CD25+Foxp3+Treg與BASDAI分級(jí)、ESR及hs-CRP均呈負(fù)相關(guān)（P<0.001）。見表4。

2.5 CD8+CD28+Tc及CD8+CD28+/CD8+CD28-值與BASDAI、ESR、hs-CRP相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，CD8+CD28+Tc及CD8+CD28+/CD8+CD28-值與BASDAI分級(jí)均呈正相關(guān)（P<0.05）。見表5。

3 討? 論

AS是以骶髂關(guān)節(jié)、中軸脊柱受累為主的一種炎癥性和慢性自身免疫性疾病，伴有不同程度的外周關(guān)節(jié)癥狀，嚴(yán)重者可致使關(guān)節(jié)強(qiáng)直和脊柱畸形[10]。目前對(duì)于其發(fā)病機(jī)制和病因尚未有權(quán)威性說明，但機(jī)體免疫功能異常，尤其是T細(xì)胞免疫功能異常對(duì)AS的發(fā)病作用顯著[11]。Treg是一類T細(xì)胞亞群，可對(duì)體內(nèi)自身免疫反應(yīng)進(jìn)行控制，按照來源的不同可將其分為誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，按照免疫表型的不同，可將其分為NKT、CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+、CD8+CD28-細(xì)胞[12]。其中CD4+CD25+Treg的功能和數(shù)量異常是人類出現(xiàn)炎性疾病或者自身免疫性疾病的重要因素。多項(xiàng)研究也表明多種疾病的發(fā)生發(fā)展與不同表型Treg的異常表達(dá)關(guān)系密切[13～14]。HAN等[15]研究顯示，與健康者相比，AS患者外周血CD8+CD28-Treg水平明顯升高，CD4+CD25+Treg水平明顯降低。也有研究顯示[16]，與正常組相比，多發(fā)性硬化癥患者外周血CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞水平明顯降低。但目前臨床上對(duì)于不同表型Treg，尤其是CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞與AS患者之間關(guān)系的研究報(bào)道相對(duì)較少。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，活動(dòng)期的AS患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg水平均明顯降低。且相關(guān)性分析顯示，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg水平與BASDAI、ESR、hs-CRP均呈負(fù)相關(guān)，與以往研究結(jié)果相符合[17]。表明CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞水平可以較好地反映AS患者病情嚴(yán)重程度及病情活動(dòng)度。另外，關(guān)于CD8+CD28-Treg相關(guān)結(jié)果表明，在AS患者中，CD8+CD28-Treg的占比相對(duì)較低，對(duì)CD8+CD28+Tc細(xì)胞的抑制作用也會(huì)相對(duì)降低，致使CD8+CD28+Tc細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)的增殖和活化，這兩種細(xì)胞之間的平衡被打破可能在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用。這可能是由于CD28分子可與CD86或者CD80相結(jié)合，形成活化T細(xì)胞所必須的一種信號(hào)因子，根據(jù)細(xì)胞膜對(duì)CD28分子的表達(dá)情況，可以將其分為CD8+CD28-Treg和CD8+CD28+Tc（殺傷性）細(xì)胞。其中CD8+CD28+Tc可特異性識(shí)別體內(nèi)的抗原，執(zhí)行相應(yīng)的免疫功能，而CD8+CD28-Treg可通過下調(diào)和上調(diào)共刺激分子和APCs表面的抑制性受體的表達(dá)，從而達(dá)到降低T細(xì)胞活化，抑制免疫功能的效果[18]。在不同細(xì)胞因子的作用下，初始CD4+T細(xì)胞可以分化成Th17、Th2、Th1細(xì)胞，其中Th17細(xì)胞可分泌IL-17等細(xì)胞因子;Th2細(xì)胞分泌IL-6等因子，可對(duì)體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生介導(dǎo)作用，從而促進(jìn)細(xì)胞活化;Th1細(xì)胞可分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等炎癥因子，對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生介導(dǎo)效果。文中關(guān)于血清炎癥因子水平的結(jié)果表明，Treg細(xì)胞數(shù)量的減少會(huì)相應(yīng)降低其自身免疫抑制作用，增強(qiáng)Th細(xì)胞的功能性，致使自身免疫淋巴細(xì)胞過度增殖，從而產(chǎn)生大量的自身抗體和炎癥因子，機(jī)體免疫功能失調(diào)，進(jìn)而致使自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)異常，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中作用顯著，且與AS的BASDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，具有一定的臨床參考價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-02-11 修回日期：2022-03-29）

（編輯：潘明志）