黑果花楸酒中風(fēng)味成分分析

王玉超，劉思琪，楊定寬，辛晶，段翠翠，李曉磊，李丹

（長春大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工吉林省普通高等學(xué)校重點實驗室，吉林 長春 130022）

黑果花楸別名黑果，又名不老莓。系薔薇科腺肋花揪屬種之一，落葉灌木。原產(chǎn)于美國東北部，在歐洲已有100多年引種栽培歷史，我國于20世紀90年代由朝鮮引入，定植在遼寧西部地區(qū)。黑果花楸喜濕潤和透氣性良好的土壤，是漿果植物中喜陽的植物之一；樹高1.5 m～2.5 m，叢狀樹形；樹皮光滑，花為完全花，白色；葉片互生，大小為3 cm×5 cm。秋天時，黑果花楸的葉色變?yōu)闋N爛的紅紫混合色，種子千粒重為4.6 g。該樹種子可在春秋進行播種，亦可采用分根、壓條、插條方式進行栽培[1-4]。

黑果有多種功效成分，主要物質(zhì)是多酚類化合物[5]，其中花青素（單寧縮合物）占主要地位，新鮮果實中花青素含量最高，約占總酚的25%[6-7]，是主要呈澀味和呈色的物質(zhì)[8-9]。黑果花楸還含有豐富的多糖[10]、有機酸[11]等多種活性成分，在護肝[12]、抑制腫瘤生長[13]、保護胃黏膜[14]、調(diào)節(jié)免疫力水平[15]等方面可起到一定的作用。但其產(chǎn)品的研究還處于起步階段。尤其對果酒的研究，主要集中在發(fā)酵工藝及其基本理化指標(biāo)測定[16]、降酸[17]、澄清處理[18]等方面，而對其主要風(fēng)味成分的研究相對較少。而風(fēng)味往往是直接評價果酒味道好壞最直觀的指標(biāo)。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，具有檢測靈敏度高、操作快速等特點，而且有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫可供檢索，能夠較好地分析黑果花楸酒中風(fēng)味成分。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 法是目前分析有機酸常用的技術(shù)手段，能夠?qū)Χ喾N有機酸實現(xiàn)更好的分離，具有方便快捷高效等優(yōu)點。本文采用這兩種方法，對黑果花楸酒主要風(fēng)味成分進行分析研究，為其產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果花楸果酒：大連北國莊園酒業(yè)；氯化鈉（化學(xué)純）：上海晶純生化科技股份有限公司；甲基磺酸（色譜純）：德國CNW公司；硫酸鈉、草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丙酸（均為色譜純）：德國sigma-aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP-2010氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本shimadzu公司；Pb680高效液相色譜儀；德國Dionex公司；15mL頂空進樣瓶、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；DB-5MS（60 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱、DB-WAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱：美國 Agilent公司；Acclaim OA（4 cm×250 mm，5 μm）色譜柱：美國 Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 有機酸測定

參考王珍珍等[19]測定植物酵素12種有機酸方法，并稍作改動。

1.3.1.1 樣品處理

準(zhǔn)確吸取2 mL樣品，用流動相（100 mmol/L Na2SO4溶液）定容到10 mL，吸取2 mL樣品于離心管中，10 000 r/min高速離心10 min，吸取上清液過0.22 μm微孔濾膜，用于有機酸檢測。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制

分別準(zhǔn)確稱取一定量的草酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、丙酸標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相（100 mmol/L Na2SO4溶液）配制成 1、5、10、20、20、99mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次稀釋成 0.083、0.830、1.670、0.520、1.670、8.520 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于有機酸含量分析。

1.3.1.3 測定條件

流動相A：配制100 mmol/L Na2SO4溶液，并用甲基磺酸調(diào)pH值至2.65±0.10；流速：0.5 mL/min；進樣量：5μL；等度洗脫；檢測器：紫外檢測器，檢測波長210nm；柱溫：30℃。

1.3.1.4 有機酸測定

采用單點校正法進行定量分析，計算公式如下。

式中：X為有機酸樣品的質(zhì)量濃度，g/L；A為測得有機酸樣品的峰面積；A0為測得有機酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；c為有機酸標(biāo)品的質(zhì)量濃度，g/L。

1.3.1.5 香氣輪分析

將檢測到的風(fēng)味化合物進行香氣活性值（aroma activity value，OAV）計算并作雷達圖。

1.3.2 揮發(fā)性物質(zhì)測定

參考蓋禹含等[20]不同酵母發(fā)酵的藍莓酒香氣成分分析，并稍作改動。

1.3.2.1 樣品前處理

取酒樣2.5 mL加入到15 mL頂空進樣瓶，加入0.75g氯化鈉，加轉(zhuǎn)子密封，于40℃條件下平衡10 min，萃取纖維萃取40 min，質(zhì)譜解析5 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 檢測條件

色譜條件：程序升溫為40℃保持7min，以7℃/min升到150℃，以8℃/min升到200℃，以8℃/min升到250℃保持5 min；進樣口溫度250℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；載氣流速1.85 mL/min；分流進樣。

質(zhì)譜條件：電離方式（electron impact ion source，EI）；電子能量70 eV；傳輸線280℃；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～550。1.3.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)分析

定性分析：采用保留指數(shù)和譜庫檢索比對進行定性，譜庫比對時要求與系統(tǒng)自帶的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫（NIST-11）匹配度大于 800[21]。

定量分析：采用氣相色譜峰面積歸一化法定量計算出各香氣成分相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 2016對樣本所得數(shù)據(jù)進行整理計算，利用Origin 2018軟件對黑果花楸酒中風(fēng)味化合物進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和香氣輪作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機酸含量、閾值、OAV值及風(fēng)味特征描述

按照試驗1.3.1中有機酸測定方法得到數(shù)據(jù)結(jié)果，見表1。

表1 有機酸濃度、閾值、OAV值及風(fēng)味特征描述Table 1 Description of organic acid concentration，threshold，OAV value and flavor characteristics

由表1可知，黑果花楸酒共檢測出6種有機酸，其中乳酸和蘋果酸含量較高，分別為7.981 g/L和2.218 g/L。研究表明，乳酸和蘋果酸共有呈味特征為稍有澀感，且呈味時間較長，這可能與黑果花楸酒釀造工藝有關(guān)[22，24-25]。有機酸含量受成分調(diào)整時添加的酸以及發(fā)酵過程中酵母菌代謝產(chǎn)生酸的綜合影響[26]。

2.2 有機酸風(fēng)味主成分分析

閾值是某種物質(zhì)能被人體感官所能聞到或品嘗到的最低濃度。物質(zhì)的閾值越低，則其呈味能力越大。為評價有機酸對風(fēng)味的影響，OAV值可作為評價其影響大小的標(biāo)準(zhǔn)[27]。研究表明，OAV值大于1的物質(zhì)對該樣品呈現(xiàn)出的整體香氣有貢獻[28]。因此結(jié)合OAV值對香氣成分做主成分分析，進行綜合評價。通過因子負荷矩陣旋轉(zhuǎn)后的結(jié)果見表2。

表2 有機酸主成分旋轉(zhuǎn)后的因子負荷矩陣Table 2 Factor loading matrix of principal components of organic acids after rotation

由表2可知，PC1與乳酸呈正相關(guān)，因此第一個因子主要解釋這1個變量。PC2與蘋果酸、乳酸和丙酸正相關(guān)，因此第二個因子主要解釋這3個變量。以PC1為橫坐標(biāo)，PC2為縱坐標(biāo)繪制載荷圖見圖1。

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圖1 有機酸風(fēng)味成分載荷圖Fig.1 Loading diagram of flavor components of organic acids

由圖1可知，PC1和PC2分別代表了總體信息的75.61%和23.90%，兩個主成分共代表了總體信息的99.51%，主成分分析能較好地代表樣品有機酸風(fēng)味總體信息。PC1與乳酸呈正相關(guān)，PC2與蘋果酸、乳酸和丙酸呈正相關(guān)。草酸、檸檬酸和酒石酸分布較集中，三者含量分別占總酸含量的1.32%、2.59%和2.62%，對風(fēng)味貢獻較小。乳酸、蘋果酸和丙酸對果酒風(fēng)味貢獻較大，其中乳酸貢獻最大，其次為蘋果酸和丙酸，三者含量占總酸的91.25%，這可能是黑果花楸酒呈現(xiàn)出香氣微弱、酸澀感較強的原因之一。

2.3 香氣輪分析

為進一步分析主要呈香特征，對OAV值大于1的有機酸進行香氣輪分析，見圖2。

圖2 有機酸香氣輪圖Fig.2 Aroma profiles of organic acids

由圖2可知，黑果花楸酒以香氣微弱、稍感澀味、酸味柔和為主要特征，氣味強度接近500，其次為略帶些爽快苦澀味，氣味強度較其它氣味略高。這可能與果酒原料所含花青素（單寧縮合物）占主導(dǎo)地位有關(guān)。

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)成分分析

按照試驗1.3.2中揮發(fā)性物質(zhì)測定方法得到總離子流色譜圖見圖3。

圖3 果酒中揮發(fā)性物質(zhì)總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile substances in the fruit wine

由圖3可以看出，由于色譜柱極性不同，其揮發(fā)性物質(zhì)的峰形表現(xiàn)出明顯差異，這樣可以比較全面地分析出黑果花楸酒中揮發(fā)性物質(zhì)，果酒中揮發(fā)性物質(zhì)相對含量及風(fēng)味特征描述見表3。

表3 果酒中揮發(fā)性物質(zhì)相對含量及其風(fēng)味特征描述Table 3 Relative content and flavor characteristics of volatile substances in the fruit wine

續(xù)表3 果酒中揮發(fā)性物質(zhì)相對含量及其風(fēng)味特征描述Continue table 3 Relative content and flavor characteristics of volatile substances in the fruit wine

續(xù)表3 果酒中揮發(fā)性物質(zhì)相對含量及其風(fēng)味特征描述Continue table 3 Relative content and flavor characteristics of volatile substances in the fruit wine

由表3可知，通過DB-5MS和DB-WAX色譜柱分析，共檢出64種揮發(fā)性化合物，酯類26種、醇類13種、酮醛類12種、酸類7種、酚類3種、其它類3種，其中共有化合物為28種，包括醇類9種、酯類12種、酮醛類4種、酸類3種。兩種色譜柱中揮發(fā)性物質(zhì)都以醇類為主，含量占比分別為61.92%和84.62%。酯類為第二類含量較高的物質(zhì)，含量占比分別為31.27%和6.98%。其它物質(zhì)占揮發(fā)性物質(zhì)總量比例較低。

香氣成分是衡量果酒風(fēng)味品質(zhì)的主要指標(biāo)[29]，能賦予葡萄酒典型香味的醇類物質(zhì)是一些高級醇[30]。在黑果花楸酒中共檢出高級醇類物質(zhì)12種，酯類物質(zhì)26種，是兩種相對含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)，這與王家梅等[31]研究的結(jié)果一致。

高級醇類物質(zhì)，在DB-5MS與DB-WAX色譜柱中分別檢出為11種和10種，其中2-乙基己醇和2-甲基丁醇在DB-5MS色譜柱有檢出，相對含量分別為0.04%和5.87%。丙醇在DB-WAX色譜柱有檢出，相對含量為0.08%。異丁醇、正丁醇、2-戊醇、異戊醇、2，3-丁二醇、葉醇、正己醇、苯甲醇、苯乙醇9種物質(zhì)在兩種色譜柱中均有檢出，但在DB-5MS色譜柱中相對含量較高。國田等[32]研究發(fā)現(xiàn)，帶渣發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)較多，可能是果渣底物種類的多樣性，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的醇類物質(zhì)。黑果花楸酒中異戊醇、異丁醇含量較高可能與此有關(guān)。苯乙醇具有花香味，嗅聞強度較高，是藍莓酒及柑橘果酒主要香氣活性物質(zhì)[33-34]，本研究中，異戊醇是黑果花楸酒主要揮發(fā)性物質(zhì)，這可能與原料種類、釀造方式等有關(guān)。

酯類物質(zhì)在DB-5MS色譜柱中保留較好，種類最多，其中乙酸乙酯相對含量最高，占比為20.82%。是果酒主要的揮發(fā)性物質(zhì)。乳酸乙酯在DB-WAX色譜柱中有檢出，相對含量為0.44%。研究表明，乙酸乙酯、乳酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸異戊酯是重要的呈香物質(zhì)，這些物質(zhì)賦予果酒水果香氣[35]。

酮醛類物質(zhì)含量較低，這可能與酮醛類在萃取過程中容易被還原成醇類等物質(zhì)有關(guān)[36]。在DB-5MS與DB-WAX色譜柱中，苯甲醛、癸醛和4-羥基-2-戊酮均有檢出，苯甲醛相對含量較高，分別為0.93%和0.30%。3，5-庚二烯-2-酮和3-戊烯-2-酮在DB-WAX色譜柱中有檢出，壬醛等7種酮醛類物質(zhì)只在DB-5MS色譜柱中有檢出。研究表明，壬醛和癸醛具有柑橘、花香、青檸和肥皂味，對果酒香氣貢獻較大[37]。

酸類物質(zhì)含量微少。在DB-5MS與DB-WAX色譜柱中，山梨酸、乙酸和癸酸均有檢出，其中山梨酸相對含量較高，占比分別為3.99和2.23%，乙酸次之，占比分別為3.31%和1.15%。異戊酸、己酸和辛酸在DBWAX色譜柱中有檢出，相對含量較低。其它種類化合物檢出較少，含量低。

2.5 揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析

為確定果酒中主要揮發(fā)性物質(zhì)，采用主成分分析法，對28種共檢出揮發(fā)性物質(zhì)進行綜合分析。通過因子負荷矩陣旋轉(zhuǎn)后的結(jié)果見表4。

表4 揮發(fā)性主成分旋轉(zhuǎn)后的因子負荷矩陣Table 4 Factor loading matrix of volatile principal components after rotation

由表4可知，PC1與異丁醇、異戊醇、苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸和山梨酸呈正相關(guān)，因此第一個因子主要解釋這7個變量；PC2與苯甲醇、苯乙醇、丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸、癸酸、山梨酸、苯甲醛呈正相關(guān)，因此第二個因子主要解釋這8個變量。

以PC1為橫坐標(biāo)，PC2為縱坐標(biāo)繪制載荷圖見圖4。

圖4 果酒揮發(fā)性主成分載荷圖Fig.4 Loading diagram of volatile principle components in the fruit wine

由圖4可以看出，PC1和PC2分別代表了總體信息的94.58%和5.42%，兩個主成分共代表了總體信息的100%，因此可以用總成分代表總體數(shù)據(jù)。28種揮發(fā)性物質(zhì)在PC1正半軸分布較散亂，在PC2負半軸分布較集中。其中異戊醇和乙酸乙酯對PC1貢獻較大，苯甲醇和苯乙醇對PC2貢獻較大。結(jié)合表4可以看出，酒體的特征香氣成分有10種，醇類有4種，異戊醇含量最高，其次為苯甲醇、苯乙醇和異丁醇。異戊醇和苯乙醇，都是果酒發(fā)酵中酵母的代謝產(chǎn)物，給酒體帶來宜人的果香和花香[38]。酯類有3種，其中乙酸乙酯含量最高，提供了愉快果香氣味[39]。有機酸為乙酸和癸酸2種，雖然酸類物質(zhì)味道不佳，但其可與醇類物質(zhì)發(fā)生發(fā)應(yīng)，形成酯類，使酒體香氣更加協(xié)調(diào)、平衡[40]。羰基類化合物只有苯甲醛，含量微弱，它使櫻桃酒具有特殊的苦杏仁氣息和焦糖氣味[41]。其余化合物分布比較集中，對果酒氣味有一定的影響。綜上所述，基本確定了這10種物質(zhì)構(gòu)成了酒體主要的揮發(fā)性成分，其中對酒體氣味貢獻較大的物質(zhì)為乙酸乙酯、異戊醇、苯甲醇和苯乙醇。

雖然對其主要風(fēng)味成分進行了試驗分析，但是特征香氣還需要專業(yè)人體嗅覺和感官評價等方法做進一步研究，為黑果花楸酒研究提供更多的理論參考。

3 結(jié)論

經(jīng)過對黑果花楸酒中有機酸成分的香氣輪分析，顯示香氣特征為香氣微弱、酸味柔和，略帶些爽快苦澀味，構(gòu)成上述風(fēng)味特征主要物質(zhì)可能是乳酸、檸檬酸和丙酸。共鑒定出64種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酯類26種、醇類13種、酮醛類12種、酸類7種、酚類3種、其它類3種。酯類和醇類物質(zhì)相對含量較高，乙酸乙酯、異戊醇、苯甲醇和苯乙醇對酒體氣味貢獻較大。