西蘭花芽提取物體外抗腫瘤活性及作用機制研究

毛佳奇，游海曦，孫瑜陽，劉軍，劉海杰*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

癌癥是一種慢性非傳染性疾病，病死率高[1]，在全球近100個國家中，癌癥被列為過早死亡的最主要原因[2]。據(jù)估計，全世界范圍內(nèi)患癌風險約為40%，這一趨勢還在繼續(xù)增加[3]。結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的癌癥，也是世界上第三大常見癌癥[4]。肝癌也是最常見的前六大癌癥之一，其中肝細胞癌占原發(fā)性肝癌的85%～90%[5]。因此，結(jié)腸癌和肝癌的預防對人體健康十分重要。1981年到2014年，美國批準的175種小分子抗癌藥物中，有49%的抗癌藥物來源于天然產(chǎn)物[6]。此外，有研究表明，一些植物性食物，如紅棗、藍莓、十字花科蔬菜、辣木等，對腫瘤的預防和治療具有有益作用[7-10]。

西蘭花是十字花科蕓薹屬一年到兩年生植物，含有豐富的維生素、花色苷、硫代葡萄糖苷和芥子酸[11]等生物活性成分。硫代葡萄糖苷，簡稱硫苷，是一類含硫和氮的陰離子親水性植物次生代謝產(chǎn)物[12]，目前在西蘭花中已經(jīng)檢測到16種硫苷。蘿卜硫苷是西蘭花中含量最高的硫苷，約占總硫苷的50%[13]。植物組織受到破壞或在腸道微生物的作用下，蘿卜硫苷被黑芥子酶催化發(fā)生水解反應，生成蘿卜硫素[14]。蘿卜硫素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗癌作用最強的天然植物活性成分，在西蘭花種子及芽苗中含量較多[15]。西蘭花芽已被證明具有多種不同的生理活性，在抑菌[16-17]、抗氧化[18]、抗腫瘤[19-20]、預防高血壓和動脈粥樣硬化等疾病[21-22]方面發(fā)揮重要作用。因此，西蘭花芽具有用作功能食品原料的潛力，對其抗腫瘤活性進行深入研究可以為西蘭花芽提取物的研究和西蘭花功能食品的開發(fā)提供參考。

前期已探索出西蘭花芽富集生物活性物質(zhì)的發(fā)芽條件，發(fā)現(xiàn)電解水處理后西蘭花芽中蘿卜硫素前體物質(zhì)和提取率得到明顯提高[23]。結(jié)腸癌細胞株Caco-2和肝癌細胞株HepG2是結(jié)腸癌和肝癌體外實驗研究最常用的細胞模型[24-26]。因此，本文以CaCl2電解水處理的西蘭花芽為研究對象，選擇Caco-2和HepG2兩種細胞株，評價西蘭花芽提取物對結(jié)腸癌和肝癌細胞的增殖抑制作用，并對其促進結(jié)腸癌細胞凋亡的機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“中青12號”西蘭花種子：中蔬種業(yè)科技有限公司；結(jié)腸癌Caco-2細胞、肝癌HepG2細胞：西北農(nóng)林科技大學食品營養(yǎng)與健康研究室。

比色試劑：日本KRK笠原理化工業(yè)株式會社；MEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基：美國Hyclone公司；噻唑藍[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]：美國 sigma 公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒（JC-1）：北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PRX-450C智能人工氣候箱：寧波賽福實驗儀器有限公司；RC-3F高濃度有效氯素計：日本KRK笠原理化工業(yè)株式會社；MP523型pH測量儀：上海三信儀器儀表有限公司；CyFlow Cube 6型流式細胞儀：德國PARTEC公司；LS-CO150型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Scientific公司；SpectraMax M2型多功能微孔板檢測儀：Molecular Devices公司；IX71倒置熒光顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 西蘭花芽制備

CaCl2電解水的配制：稱取一定量無水CaCl2，使用自來水（tap water，TW）溶解并定容。將溶液倒入實驗室自制電解槽中，電流恒定為3 A，電解（28.88±1.55）s后，使用比色試劑和高濃度有效氯素計檢測電解水的有效氯濃度（available chlorine concentration，ACC），得到含有20 mmol/L CaCl2的電解水溶液。不同處理液的理化指標如表1所示。

表1 不同處理液的理化指標Table 1 The parameter of different solutions

發(fā)芽參照Li等[23]的方法并稍作修改。稱取6 g西蘭花種子，加入90 mL上述制備好的CaCl2電解水，25℃黑暗條件下靜置3 h。浸種后均勻播種于鋪有紗布的長方形盤中，發(fā)芽盤下層倒入制備好的上述電解水，以TW組作為陰性對照。發(fā)芽溫度設(shè)為25℃，相對濕度設(shè)為80%，光照強度為100%，每天噴淋3次，每隔2 d換一次水。培養(yǎng)6 d后收芽，西蘭花芽經(jīng)過48 h凍干，研磨，過80目篩，儲存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 西蘭花芽提取物的制備

稱取1 g西蘭花芽凍干粉，加入4 mL蒸餾水，25℃水解8 h，在離心管中加入5 g氯化鈉和3.75 g無水硫酸鈉。加入4 mL二氯甲烷，混勻，100%功率超聲輔助提取30min，以5000r/min在4℃離心15min，無水硫酸鈉過濾，重復上述提取步驟3次。將上清液在30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入二甲基亞砜復溶至樣品終濃度為200mg/mL，得到TW和20 mmol/L CaCl2電解水處理的西蘭花芽提取物（簡稱為TW組和CaCl2組）。使用前用無血清培養(yǎng)基將提取液稀釋至工作濃度。

1.3.3 細胞培養(yǎng)

Caco-2細胞使用DMEM培養(yǎng)基，HepG2細胞使用MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入1%青霉素-鏈霉素。完全培養(yǎng)基需加入10%胎牛血清，配制好后密封，儲存于4℃冰箱備用。細胞置于37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，胰蛋白酶收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞，每隔2 d換液，每隔2 d～4 d傳代。

1.3.4 形態(tài)學觀察

細胞生長面積達到80%～90%時，制備單細胞懸液，使用血球計數(shù)板計數(shù)，將Caco-2和HepG2細胞濃度分別調(diào)整至5×104個/mL和1×105個/mL，每孔加入2 mL細胞懸液。貼壁培養(yǎng)12 h后，更換為1.8 mL無血清培養(yǎng)基，加入200 μL濃度為0.045、0.180 mg/mL的西蘭花芽提取物，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。加入樣品48 h后，放大100倍觀察細胞形態(tài)。

1.3.5 細胞增殖抑制率測定

采用MTT法檢測西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞的增殖抑制率[27]。在96孔板中加入調(diào)整濃度后的細胞懸液，使得Caco-2細胞為5 000個/孔，HepG2細胞為1×104個/孔，邊緣孔加入PBS。培養(yǎng)12 h后，更換為90 μL無血清培養(yǎng)基，每孔加入10 μL西蘭花芽提取物，樣品最終濃度分別為0.006、0.011、0.023、0.045、0.090、0.180 mg/mL，每個處理設(shè) 6 個復孔，以無血清培養(yǎng)基和0.01 mg/mL 5-FU為對照。加入提取物培養(yǎng)24 h后移除培養(yǎng)基，避光加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT溶液。37℃孵育4 h，將MTT溶液更換為二甲基亞砜溶液，37℃避光振蕩15 min，測定490 nm處吸光值。按照下列公式計算西蘭花芽提取物對Caco-2細胞和HepG2細胞的抑制率，并采用Graphpad Prism 7.0計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：OD對照為對照組吸光值；OD樣品為樣品組吸光值。

1.3.6 細胞凋亡率的測定

細胞培養(yǎng)12 h后，將Caco-2細胞的濃度調(diào)整為1×105個/mL，在6孔板中加入1.8mL細胞懸液和200μL濃度為0.180 mg/mL的西蘭花芽提取物，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液收集至離心管中，加入1 mL胰酶消化貼壁細胞，搖勻，吸出800 μL胰酶，待細胞間隙增大時終止消化，收集細胞至之前的離心管中，1 000 r/min離心5 min。按照試劑盒說明書染色，設(shè)置Annexin V-FITC和PI單染組，避光放置15 min，混勻后上機檢測。

1.3.7 ROS水平測定

使用2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽作為熒光探針測定細胞ROS水平[28]。調(diào)整Caco-2細胞濃度為1×105個/mL，接種細胞至6孔板中培養(yǎng)12 h，各孔中分別加入 1.8 mL的完全培養(yǎng)基、200 μL濃度為 0.045、0.180 mg/mL的西蘭花芽提取物，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，移除培養(yǎng)液，加入1 mL稀釋后的2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽，混勻，孵育 30 min，無血清培養(yǎng)基洗滌3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。

1.3.8 MMP測定

使用線粒體特異性親脂陽離子熒光染料JC-1測定MMP[27]。調(diào)整Caco-2細胞濃度為5×104個/mL，培養(yǎng)12 h后，加入濃度為0.045、0.180 mg/mL的西蘭花芽提取物，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細胞，加入完全培養(yǎng)基和稀釋后的JC-1染色液，混勻，培養(yǎng)箱中靜置30 min。用緩沖液洗滌2次，加入無血清培養(yǎng)基，隨后將6孔板置于顯微鏡下，放大100倍觀察紅綠熒光。定量檢測方法操作步驟同上，在96孔板中培養(yǎng)細胞12 h，加入西蘭花芽提取物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后加入JC-1染色液，使用熒光酶標儀檢測綠色熒光和紅色熒光，計算二者比值。

1.3.9 統(tǒng)計與分析

所有試驗均進行3次重復試驗，數(shù)據(jù)采用SPSS 26軟件進行單因素ANOVA分析，采用Duncan多重比較，p<0.05，表示差異顯著，采用Graphpad Prism 7.0繪制圖形，結(jié)果以平均值±標準誤差表示，Annexin-VITC/PI雙染色結(jié)果采用FlowJo軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞形態(tài)的影響

西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞形態(tài)的影響見圖1。

圖1 西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞形態(tài)的影響（100 x）Fig.1 Effects of broccoli sprouts extracts on the morphology of Caco-2 and HepG2 cells（100 x）

如圖1所示，經(jīng)過不同濃度的西蘭花芽提取物處理后的Caco-2和HepG2細胞形態(tài)明顯不同。對照組Caco-2和HepG2細胞緊貼培養(yǎng)皿，生長良好，Caco-2細胞緊密相連，呈不規(guī)則多邊形，HepG2細胞呈梭形。0.045 mg/mL西蘭花芽提取物作用48 h后，細胞密度下降，部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞內(nèi)空泡開始增多，表明細胞貼壁性減弱，出現(xiàn)死細胞跡象；與TW組相比，CaCl2組Caco-2細胞中空泡細胞增多，HepG2細胞圓點增多。提取物濃度增加至0.180 mg/mL時，細胞數(shù)量進一步減少，細胞明顯變圓縮小。結(jié)果表明，不同濃度的西蘭花芽提取物可使Caco-2和HepG2細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

2.2 西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞增殖的影響

西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞增殖的影響見圖2。

圖2 西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞增殖的影響Fig.2 Effects of broccoli sprouts extracts on the proliferation of Caco-2 and HepG2 cells

由圖2可知，西蘭花芽提取物使Caco-2和HepG2細胞生長受到抑制，且呈濃度依賴效應。與TW組相比，CaCl2組西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞的抑制作用增強。TW組對Caco-2和HepG2細胞的IC50值分別為（0.053±0.004）、（0.060±0.003）mg/mL，而CaCl2組的 IC50值分別為（0.030±0.002）、（0.043±0.004）mg/mL。對照組5-FU對Caco-2和HepG2細胞的抑制率分別為33.14%和26.27%，抗增殖效果優(yōu)于同濃度西蘭花芽提取物。Pako等[29]研究凍干西蘭花和西蘭花芽對肝癌HepG2細胞和結(jié)直腸癌SW480細胞的毒性，結(jié)果表明1 mg/mL～2.5 mg/mL西蘭花芽和西蘭花均顯著降低了HepG2和SW480的細胞活力，且對前者的作用更明顯。Le等[18]研究表明西蘭花芽乙醇提取物可以抑制A549（肺癌細胞）、HepG2和Caco-2細胞增殖，且IC50值分別為0.117、0.168、0.189 mg/mL。此外，Xu等[30]從西蘭花中分離純化出水溶性多糖，當西蘭花水溶性多糖濃度為2 mg/mL時，可抑制肝癌HepG2細胞、宮頸癌Siha細胞和乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，本研究所用西蘭花芽提取物對Caco-2和HepG2細胞具有更低的IC50值。

2.3 西蘭花芽提取物對Caco-2細胞凋亡率的影響

西蘭花芽提取物對Caco-2細胞凋亡率的影響見圖3。

圖3 高濃度西蘭花芽提取物對Caco-2細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of high concentration broccoli sprouts extracts on apoptosis of Caco-2 cells

采用Annexin-VITC/PI雙染色法對處于凋亡各階段的細胞進行定量檢測。如圖3所示，經(jīng)過西蘭花芽提取物處理后，西蘭花芽提取物顯著誘導Caco-2細胞發(fā)生凋亡，TW和CaCl2組凋亡細胞的比例分別為46.63%和82.95%，此外，晚期凋亡細胞數(shù)量高于早期凋亡細胞。Pako等[29]研究2.5 mg/mL西蘭花和西蘭花芽甲醇提取物對結(jié)直腸癌SW480細胞和肝癌HepG2細胞的影響，發(fā)現(xiàn)西蘭花芽提取物對SW480細胞具有顯著的促凋亡（77.4%）作用，對HepG2細胞毒性作用較大（壞死50%，凋亡20.9%）。與其不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)西蘭花芽提取物濃度在0.180 mg/mL時顯著促進Caco-2細胞凋亡。

2.4 西蘭花芽提取物對Caco-2細胞ROS水平的影響

西蘭花芽提取物對Caco-2細胞ROS水平的影響見圖4。

圖4 中高濃度西蘭花芽提取物誘導Caco-2細胞產(chǎn)生ROSFig.4 Medium and high concentration broccoli sprouts extracts induce Caco-2 cells to produce ROS

ROS水平已被證明是影響細胞死亡和存活的因素，ROS代謝紊亂時可能導致細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA損傷并引發(fā)神經(jīng)退行性疾病[31]。研究表明，ROS可以激活腫瘤抑制蛋白p53，下調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL、IAPs和survivin[32]，上調(diào)促凋亡因子，增強線粒體膜的通透性[33]。通過熒光染色的方法檢測西蘭花芽提取物作用后胞內(nèi)ROS的水平。如圖4所示，與對照組相比，加入西蘭花芽提取物后，胞內(nèi)ROS生成增多，且呈濃度依賴效應；與TW組相比，CaCl2組誘導Caco-2細胞產(chǎn)生的綠色熒光增強，結(jié)果表明，西蘭花芽提取物可能通過誘導Caco-2細胞產(chǎn)生ROS來抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。

2.5 西蘭花芽提取物對Caco-2細胞線粒體膜電位的影響

西蘭花芽提取物對Caco-2細胞線粒體膜電位的影響見圖5。

圖5 中高濃度西蘭花芽提取物對Caco-2細胞線粒體膜電位的影響Fig.5 Effects of medium and high concentration broccoli sprouts extracts on mitochondrial membrane potential of Caco-2 cells

線粒體膜電位下降是細胞線粒體早期損傷的特征之一，由于呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移，大多數(shù)ROS產(chǎn)生于線粒體中[34]，ROS與線粒體調(diào)控凋亡通路的激活密切相關(guān)。線粒體來源的ROS可使線粒體mtDNA氧化損傷，mtDNA損傷會損害電子傳遞鏈相關(guān)蛋白的mtRNA轉(zhuǎn)錄，損傷呼吸鏈功能，進一步增加ROS的產(chǎn)生，引起線粒體膜電位改變，造成ATP合成受損，從而導致細胞凋亡[35]。

由圖5A可知，隨著西蘭花芽提取物濃度升高，綠色熒光細胞增多，紅色熒光細胞減少；高濃度樣品組分布著發(fā)綠光的細胞，與對照組相比，幾乎不出現(xiàn)紅色熒光，且細胞數(shù)量減少，與形態(tài)學觀察結(jié)果一致。如圖5B所示，與對照組相比，中高濃度TW組綠色熒光/紅色熒光比值顯著提高1.14倍和1.57倍（p<0.05），即線粒體膜電位降低，線粒體出現(xiàn)功能損傷。CaCl2組西蘭花芽提取物可進一步顯著降低線粒體膜電位，綠色熒光/紅色熒光比值分別提高1.23倍和1.66倍。該結(jié)果表明，西蘭花芽提取物可通過誘導Caco-2細胞線粒體出現(xiàn)功能損傷來抑制細胞增殖，誘導細胞發(fā)生凋亡。

3 結(jié)論

本試驗研究了西蘭花芽提取物對結(jié)腸癌Caco-2細胞和肝癌HepG2細胞的影響，觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，0.180 mg/mL西蘭花芽提取物可使Caco-2和HepG2細胞貼壁性減弱，細胞密度下降，并呈現(xiàn)死細胞跡象。西蘭花芽提取物作用24 h后，可顯著抑制Caco-2和HepG2細胞增殖，TW組對Caco-2和HepG2細胞的IC50值分別為（0.053±0.004）、（0.060±0.003）mg/mL，而CaCl2組為（0.030 ± 0.002）、（0.043 ± 0.004）mg/mL。細胞凋亡結(jié)果顯示，CaCl2組細胞發(fā)生凋亡的比例為82.95%。此外，結(jié)腸癌Caco-2細胞對西蘭花芽提取物敏感，西蘭花芽提取物通過誘導細胞產(chǎn)生ROS，降低線粒體膜電位，可造成細胞線粒體功能損傷，激活線粒體凋亡途徑，最終導致Caco-2細胞凋亡。綜上所述，西蘭花芽提取物具有顯著抑制結(jié)腸癌Caco-2細胞和肝癌HepG2細胞增殖及促進Caco-2細胞凋亡的作用，西蘭花芽可以作為具有抗癌作用的植物性食品，用于功能食品的開發(fā)。