茶多酚對大鼠糖脂代謝的影響及保護(hù)肝臟作用

黃蘇萍， 楊柳媛， 曾淑華， 許陸達(dá)， 林 歡

( 福建中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合研究院， 福建 福州 350122 )

0 引言

糖尿病是胰島素絕對或相對不足引起的以血糖升高為特征的代謝性疾病。 全球糖尿病地圖(第9 版)顯示， 2019 年全球有4.63 億糖尿病患者(20～79 歲)， 我國是全球糖尿病患病人數(shù)最多的國家， 成年糖尿病患者(20 ～79 歲)人數(shù)達(dá)到1.164 億[1]。 茶多酚是茶浸出液多酚類物質(zhì)的總稱， 由表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、 表兒茶素沒食子酸酯((-)-epicatechin gallate，ECG)、 表兒茶素(L-epicatechin，EC)和表沒食子兒茶素((-)-gallocatechin，EGC)等單體組成[2]。 體內(nèi)外研究證實茶多酚具有抗氧化、 抗炎、 降血糖、 抗癌等作用， 對糖尿病、 心血管疾病、 癌癥及神經(jīng)系統(tǒng)疾病能起到預(yù)防或治療作用[3]。 有研究指出茶多酚對糖尿病的治療作用可能涉及多條途徑: 降低葡萄糖外源性吸收和內(nèi)源性轉(zhuǎn)化[4]， 促進(jìn)肌肉和脂肪組織攝取并利用葡萄糖， 改善胰島素受體底物功能和胰島素抵抗， 抗氧化及抗炎[5]， 降低脂質(zhì)的吸收和內(nèi)源性生成， 提高脂質(zhì)的排泄等[6]。本研究旨在探討茶多酚對糖脂代謝紊亂大鼠糖脂代謝的影響以及其是否對肝臟具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠45 只， 質(zhì)量(280 ± 15)g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供， 許可證號: SCXK(滬)2012-0002。 以5 只/籠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心， 許可證號:SYXK(閩)2009-0001。 普通飼料由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供； 高糖高脂飼料由閩侯縣上街厚積實驗動物工作室提供， 經(jīng)高溫消毒和輻射照射處理后使用。

1.1.2 實驗試劑

鏈脲佐菌素、 烏拉坦、 二甲苯(美國Sigma 化學(xué)公司)， 鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司)， 茶多酚(上海源葉生物公司)， 血糖測試碟(德國Bayer 公司)， 4%多聚甲醛、 Cole 氏蘇木素染色液、 伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司)， 總膽固醇(TC)、 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測試盒等(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)， 無水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司)。

1.1.3 實驗儀器

酸度計(意大利哈納HANNA 公司HI 3221)，臺式高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司Thermo Electron LED GmbHD-37520 Osterode)，超低溫冰箱(德國艾本德股份公司F570-86)， 生物顯微鏡55i(日本尼康公司150312)， 生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司SHP-250)， 生物組織攤烤片機、 石蠟包埋機(孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司YB-7LF)， 半自動石蠟切片機(德國MICROM 公司RM340 E)， 生物顯微鏡(日本尼康公司ECLIPSE E200MVRS)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立模型

6 周齡SD 大鼠45 只， 剔除2 只糖耐量異常大鼠后， 按隨機數(shù)表法隨機分為正常組9 只和造模組34 只。 正常組喂養(yǎng)普通飼料， 造模組喂養(yǎng)高糖高脂飼料， 為期30 d。 隨后， 造模組大鼠兩次空腹注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)， 間隔48 h， 用量為25 mg/(kg·d)。 對造模組大鼠進(jìn)行兩次空腹血糖(FBG)檢測， 兩次血糖值均≥11.1 mmol/L 視為糖脂代謝紊亂大鼠模型造模成功。 造模過程中， 4 只造模失敗予以剔除。

1.2.2 分組干預(yù)

將30 只造模成功大鼠按體質(zhì)量、 血糖水平進(jìn)行分組， 分組方法如下: 30 只大鼠按體質(zhì)量從大到小排序， 每3 只1 層， 分成10 層， 每1層按血糖水平從大到小排列， 隨機分到模型組、二甲雙胍組和茶多酚組。 分組完成后， 模型組、二甲雙胍組、 茶多酚組各10 只， 隨后進(jìn)行120 d藥物灌胃干預(yù)。 正常組喂養(yǎng)普通飼料， 用生理鹽水灌胃； 模型組喂養(yǎng)高糖高脂飼料， 用生理鹽水灌胃； 二甲雙胍組喂養(yǎng)高糖高脂飼料， 用鹽酸二甲雙胍水溶液灌胃； 茶多酚組喂養(yǎng)高糖高脂飼料， 用茶多酚水溶液灌胃。 一次灌胃體積統(tǒng)一設(shè)定成10.25mL/kg。 根據(jù)預(yù)實驗， 二甲雙胍用量是10.42mg/(kg·d)，茶多酚用量是400mg/(kg·d)。

1.2.3 一般指標(biāo)觀察

每日觀察大鼠活力、 運動狀態(tài)、 毛發(fā)光澤及糞便狀態(tài)， 記錄異常情況。 每14 d 監(jiān)測大鼠血糖、 體質(zhì)量、 飲食量、 飲水量。 在大鼠飼料盒加入充足飼料的前提下， 測量當(dāng)日各籠的飼料加入量和剩余量， 飼料加入量減去剩余量， 即為各籠的總飲食量； 飲水量測量采用完好的250 mL 鼠用飲水瓶， 每籠1 瓶， 每次換水時分別量取每瓶中剩余水量， 計算出各籠的總飲水量； 按照一籠5 只的規(guī)格， 每只大鼠的飲食量(飲水量)＝總飲食量(總飲水量)/5。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測

(1)血糖: 禁食8 h 后， 用酒精棉球清潔大鼠尾部， 采血針尾靜脈采血后， 采用血糖儀和血糖試紙測定FBG。

(2)血脂、 肝功能: 藥物干預(yù)完成后， 禁食12 h， 采用20%烏拉坦水溶液麻醉， 用量為5 mL/kg。 麻醉起效后， 腹主動脈取血， 促凝管中靜置后離心取上清用于檢測。 采用相應(yīng)測試盒，通過酶標(biāo)儀比色法檢測TC， 采用微板法檢測肝功能(AST、ALT)。

1.2.5 HE 染色觀察肝臟形態(tài)

迅速剝離大鼠肝臟， 取肝右葉并剪切為多個1 cm×1 cm×1 cm 的組織塊， 放入4%多聚甲醛內(nèi)固定。 肝臟組織在梯度酒精中脫水后， 在二甲苯中浸泡使組織呈琥珀色。 隨后浸蠟、 包埋、 切片， 攤片。 將載玻片放在烤箱中37℃烘烤2 h，隨后放入二甲苯脫蠟， 再經(jīng)梯度酒精脫水。 先后放入蘇木素染色液中15 min、 伊紅染色液30 s 進(jìn)行染色。 將玻片吹干后， 滴上中性樹膠， 加蓋玻片封片， 風(fēng)干后顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 25.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理， 所有數(shù)據(jù)類型均屬于計量資料， 用(±s)表示。 滿足正態(tài)分布的， 各組間均值比較采用單因素方差分析， 方差同質(zhì)性檢驗后若方差齊采用LSD-t法， 方差不齊則采用Games-Howell法； 不滿足正態(tài)分布的， 各組間均值比較采用非參數(shù)秩和檢驗。 檢驗水準(zhǔn)按P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況觀察

正常組大鼠皮毛色澤光亮， 精神和運動狀態(tài)良好， 飲食飲水量較低； 模型組大鼠皮毛色澤較暗沉， 精神欠佳， 運動狀態(tài)欠靈活， 飲食飲水量和排便排尿量明顯增加。 茶多酚干預(yù)可改善糖脂代謝紊亂大鼠情況， 與模型組大鼠相比， 茶多酚組大鼠皮毛色澤、 運動和精神狀態(tài)有所改善， 飲食飲水量降低， 排便排尿量降低。 灌胃過程中，模型組、 茶多酚組各有1 只因操作不當(dāng)死亡， 模型組另有2 只因病情發(fā)展死亡。

(1)對干預(yù)前大鼠體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn): 與正常組相比較， 模型組、 二甲雙胍組和茶多酚組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.05)； 模型組、二甲雙胍組和茶多酚組兩兩間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 見表1。

(2)對干預(yù)后大鼠體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn): 與正常組相比較， 模型組、 二甲雙胍組、 茶多酚組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P＜0.05)； 與模型組比較， 二甲雙胍組和茶多酚組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P＜0.05)； 二甲雙胍組與茶多酚組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 見表1。

表1 干預(yù)前后各組大鼠體質(zhì)量比較

2.2 干預(yù)前后各組大鼠FBG 比較

(1)對干預(yù)前大鼠FBG 進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn):與正常組相比較， 模型組、 二甲雙胍組和茶多酚組FBG 顯著升高(P＜0.05)， 模型組、 二甲雙胍組和茶多酚組兩兩間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 見表2。

表2 干預(yù)前后各組大鼠FBG 比較

(2)對干預(yù)后大鼠FBG 進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn):與正常組相比較， 模型組、 二甲雙胍組和茶多酚組FBG 顯著升高(P＜0.05)； 與模型組比較， 二甲雙胍組和茶多酚組FBG 顯著降低(P＜0.05)；二甲雙胍組與茶多酚組比較， FBG 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 見表2。

2.3 干預(yù)后各組大鼠TC 比較

與正常組相比較， 模型組、 茶多酚組TC 顯著升高(P＜0.05)； 與模型組相比較， 二甲雙胍組和茶多酚組TC 顯著降低(P＜0.05)； 與二甲雙胍組比較， 茶多酚組TC 顯著升高(P＜0.05)。見表3。

表3 干預(yù)后各組大鼠TC 比較

2.4 干預(yù)后各組大鼠肝功能比較

與正常組相比較， 模型組AST、 ALT 顯著升高(P＜0.05)， 二甲雙胍組和茶多酚組ALT 顯著升高(P＜0.05)； 與模型組相比較， 二甲雙胍組AST、 ALT 顯著降低(P＜0.05)， 茶多酚組AST顯著降低(P＜0.05)但ALT 差異無統(tǒng)計學(xué)意義；二甲雙胍組與茶多酚組比較， AST、 ALT 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 見表4。

表4 干預(yù)后各組大鼠AST 和ALT 比較

2.5 干預(yù)后各組大鼠肝臟形態(tài)比較

正常組: 肝小葉結(jié)構(gòu)完整， 無脂肪空泡， 肝細(xì)胞排列規(guī)則。 模型組: 肝小葉結(jié)構(gòu)不可見， 大量脂肪空泡， 肝細(xì)胞排列欠規(guī)則。 二甲雙胍組和茶多酚組: 脂肪空泡降低， 肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞排列較規(guī)則。 見圖1。

圖1 干預(yù)后各組大鼠肝臟HE 染色圖(×200)

3 討論

茶多酚組分包括兒茶素類化合物、 黃酮類化合物、 花青素和酚酸等， 兒茶素類化合物為其主要活性成分。 茶多酚抗糖尿病的機制可能涉及多條途徑。 茶多酚可降低糖脂在腸道的吸收， 對胰脂肪酶具有抑制作用[7]； 可增大乳化顆粒體積、減少乳化顆粒的相對表面積以降低糖脂消化[8]；通過螯合作用將膽固醇排出體外。 降低糖脂的內(nèi)源性生成也是茶多酚抗糖尿病的重要機制， 有研究指出: 茶多酚可通過AMPK 和PI3K/AKT 等通路調(diào)劑下游的脂質(zhì)生成關(guān)鍵酶ACC、 FAS 和HMGCR， 降低脂質(zhì)的生成； 抑制PEPCK 和G-6-Pase 活性， 降低糖類的生成， 減少糖脂在肝臟、 腎臟、 胰腺等臟器的蓄積， 抵抗糖尿病性改變[9]。

肝臟是糖脂代謝的關(guān)鍵場所: 肝臟是甘油三脂、 脂肪酸、 膽固醇合成的主要場所， 也是脂肪酸氧化、 糖代謝的重要場所； 肝臟與糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)， 高糖狀態(tài)、 脂質(zhì)沉積以及炎癥激活都會引起纖維化等肝損害， 肝星狀細(xì)胞也與上述過程相關(guān)[10]。 茶多酚能保護(hù)肝臟， 改善脂質(zhì)代謝。 Xia 等通過油紅O 染色法檢測高脂飲食大鼠的肝組織， 結(jié)果顯示茶多酚干預(yù)后可減少脂滴數(shù)量和體積[11]。 Bose 等發(fā)現(xiàn)增加EGCG 攝入可降低高脂飲食大鼠肝臟大小、 脂肪肝發(fā)生率以及肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡數(shù)量[12]。 茶多酚對糖脂代謝紊亂大鼠的肝臟保護(hù)作用可能通過多種機制:1) 減少糖脂的沉積， 肝脂肪沉積與AST、 ALT數(shù)值升高具有一定的關(guān)聯(lián)[13-14]； 2) 抗炎作用，茶多酚可上調(diào)抗氧化酶并下調(diào)炎癥因子， 下調(diào)肝臟指數(shù)， 減少肝損害[15]； 3) 抗氧化作用， 茶多酚可通過降低SOD、 GSH-Px 和CAT 的活性以及增加谷胱甘肽的含量來減輕氧化應(yīng)激[16]。

EGCG 治療可改善高脂肪飲食小鼠肝臟脂肪變性， 降低肝臟甘油三酯、 血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度， 改善肝臟病理[11，17]。 本研究結(jié)果顯示: 與模型組相比， 茶多酚組大鼠皮毛色澤及運動狀態(tài)顯著改善， 體質(zhì)量增加， 多飲多食多尿癥狀明顯改善； FBG 明顯降低， 高血糖狀態(tài)明顯改善；TC 顯著降低； AST 降低， 肝臟形態(tài)有明顯改善。這表明茶多酚干預(yù)可改善糖脂代謝紊亂大鼠的一般情況， 降低血糖、 血脂， 改善肝功能， 保護(hù)肝臟。 通過對茶多酚組與二甲雙胍組的比較， 說明茶多酚能夠預(yù)防和輔助治療糖脂代謝紊亂疾病。

總而言之， 茶多酚可以改善高糖高脂飲食引發(fā)的糖脂代謝紊亂狀態(tài)， 日常生活中攝入茶葉制品能起到一定的預(yù)防及保健作用。 AMPK 信號通路作為調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵通路， 茶多酚如何通過AMPK 作用于其下游脂質(zhì)生成關(guān)鍵酶從而調(diào)控糖脂代謝， 有待進(jìn)一步研究。