熊果酸-茶氨酸共無(wú)定型復(fù)合物的制備和水溶性測(cè)定

楊仲平， 吳 琦， 楊雅琴， 洪燕萍*

( 1.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 福建 龍巖 364000；2.福建省生物技術(shù)與預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 龍巖 364000 )

0 引言

口服給藥是目前常見(jiàn)的給藥途徑之一， 口服藥在體內(nèi)的吸收主要包括兩個(gè)過(guò)程， 即藥物的溶解溶出過(guò)程和滲透過(guò)程。 熊果酸(ursolic acid)是存在于天然植物中的五環(huán)三萜類(lèi)化合物， 具有抗炎、 抗氧化、 抗癌、 調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、 抗骨骼肌肉萎縮， 以及保護(hù)肝臟、 心臟和神經(jīng)等作用[1]， 被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品中。 但熊果酸在水中的溶解性和滲透性極差， 屬于生物藥劑分類(lèi)系統(tǒng)(biopharmaceutics clas-sification system，BCS)Ⅳ類(lèi)藥物， 需要通過(guò)制劑技術(shù)提高其生物利用度[2]。 較高純度的熊果酸為白色粉末， 在乙醇中為白色針狀結(jié)晶， 除溶解度低外， 還存在口服吸收外排、 生物利用度低、 體內(nèi)代謝速度快等生物藥劑學(xué)問(wèn)題[3]。 研究如何通過(guò)制劑技術(shù)提高BCS Ⅳ類(lèi)藥物的生物利用度并了解其中的機(jī)制， 對(duì)熊果酸等許多藥物和天然產(chǎn)物的實(shí)際利用都有很大的意義。

藥物的無(wú)定形態(tài)比晶態(tài)具有更高的溶解度，可以促進(jìn)吸收， 提高口服生物利用度。 固體分散體制劑可以使藥物由晶體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定形態(tài)，并使藥物維持較穩(wěn)定的無(wú)定形態(tài)， 提高溶解度和溶出速率， 改善生物利用度， 但也存在一些問(wèn)題。 如常見(jiàn)的聚合物固體分散體(polymeric amorphous solid dispersion， PASD)可以改善溶解性， 但由于藥物在聚合物中的溶解性差， 通常會(huì)導(dǎo)致大量聚合物的加入， 增加最終劑型的體積，從而限制它們的使用， 特別是對(duì)于高劑量的藥物。 此外， 大多數(shù)聚合物具有吸濕性， 可能會(huì)導(dǎo)致藥物-聚合物相位分離和結(jié)晶， 降低其穩(wěn)定性；還有藥物-載體不相容、 粉碎困難、 流動(dòng)性差和可壓縮性差等問(wèn)題。 這些問(wèn)題通常會(huì)抵消非晶體系的溶解性?xún)?yōu)勢(shì)， 甚至?xí)巩a(chǎn)品不安全且無(wú)效。共無(wú)定型藥物系統(tǒng)(co-amorphous systems， CAM)是由藥物和小分子物質(zhì)組成的二元無(wú)定型系統(tǒng)， 是一種新型的固體分散體制劑， 可以改善難溶藥物的溶解性， 并可以克服前述缺點(diǎn)， 較之于PASD 具有較大的優(yōu)勢(shì)[4-5]， 為潛在的藥物傳遞系統(tǒng)[6]。

藥物-藥物共無(wú)定型系統(tǒng)由2 個(gè)活性藥物組成， 可能兼具兩種藥物的藥效， 同時(shí)藥物之間還有可能通過(guò)分子間作用， 實(shí)現(xiàn)無(wú)定型狀態(tài)的穩(wěn)定化。 共無(wú)定型復(fù)合物常用的制備方法各有優(yōu)缺點(diǎn): 淬火冷卻法在加熱過(guò)程中可能會(huì)破壞藥物本身的結(jié)構(gòu)； 球磨法與低溫研磨法可以保持藥物性質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定， 但操作時(shí)間較長(zhǎng)； 溶劑法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、 時(shí)間短， 在快速減壓蒸干的過(guò)程中會(huì)使無(wú)定型更完全， 是一種較為可行的方法。 CAM中小分子物質(zhì)主要為氨基酸[7]、 有機(jī)酸[8]或其他小分子藥物等， 茶氨酸(theanine， THE)水溶性良好， 具有降血壓、 增強(qiáng)免疫力、 鎮(zhèn)靜等作用， 是茶葉功能性成分開(kāi)發(fā)利用的研究熱點(diǎn)之一[9]， 可作為共無(wú)定型復(fù)合物的配體[4，10]。 本論文以茶氨酸為配體， 采用藥物-藥物共無(wú)定型復(fù)合物方法來(lái)改善熊果酸的水溶解性， 為提高熊果酸的生物利用度提供一種方案。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

東京理化N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 上海美普達(dá)UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)， 荷蘭帕納科X'PertX 射線衍射儀， 美國(guó)賽默飛尼高力Nicolet iS10 紅外光譜儀。

熊果酸(純度98%， 產(chǎn)品編號(hào)U118635，CAS 號(hào)77-5-21)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司， 茶氨酸(純度≥98%， 產(chǎn)品編號(hào)319C024， CAS號(hào)3081-61-6)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 熊果酸-茶氨酸共無(wú)定型復(fù)合物制備

溶劑法制備: 熊果酸與茶氨酸分別按照摩爾比1 ∶2、 1 ∶5、 1 ∶10、 1 ∶20 取樣， 熊果酸采用無(wú)水乙醇水浴加熱至完全溶解， 茶氨酸以蒸餾水溶解。 在茶氨酸水溶液中加入熊果酸乙醇溶液攪拌10 min， 減壓濃縮至溶劑揮干， 所得固體粉末即為共無(wú)定型復(fù)合物(下文簡(jiǎn)稱(chēng)“溶劑法復(fù)合物”)， 密封保存?zhèn)溆谩?/p>

物理研磨法制備: 取樣量同溶劑法， 將熊果酸與茶氨酸固體混合， 加入少量無(wú)水乙醇濕法研磨2 h， 所得固體粉末即為共無(wú)定型復(fù)合物(下文簡(jiǎn)稱(chēng)“研磨法復(fù)合物”)， 密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熊果酸溶解度測(cè)定

采用香草醛-冰醋酸法測(cè)定熊果酸含量。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作: 配制0.1 g/L 熊果酸乙醇溶液， 取一定體積標(biāo)準(zhǔn)品溶液水浴揮干溶劑， 加入5%的香草醛-冰醋酸0.5 mL， 高氯酸1.2 mL， 60℃水浴中加熱15 min 后取出冰浴5 min， 加入乙酸乙酯4 mL 搖勻， 測(cè)定550 nm 下吸光度， 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品水溶解度測(cè)定: 參考祁雯等[11]的方法， 取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品用含0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)、 pH 值為6.8 磷酸鹽緩沖液(0.2%SDS-PBS)， 于37℃恒溫?fù)u床中振蕩24 h(振蕩頻率110 r/min)， 微孔濾膜過(guò)濾， 量取濾液1 mL 水浴揮干， 同上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，采用香草醛-冰醋酸法測(cè)定含量。

共無(wú)定型復(fù)合物中熊果酸水溶解度測(cè)定: 分別取溶劑法復(fù)合物與研磨法復(fù)合物各0.1 g， 同上法測(cè)定復(fù)合物中熊果酸水溶解度。 重復(fù)測(cè)定3次， 計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差， 并采用SPSS18 進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.3 粉末X 射線衍射(PXRD)圖譜分析

選取Cu 靶(40 kV， 40 mA)， 2θ角步進(jìn)掃描0.026°/步， 掃描范圍5.00°～80.00°， 每步停留時(shí)間36.465 s， 掃描速率4°/min， 分別檢測(cè)熊果酸單體、 茶氨酸單體和溶劑法復(fù)合物。

1.2.4 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析

采用KBr 壓片法測(cè)定FTIR， 將樣品與KBr在干燥環(huán)境下混合制片后， 分辨率為32 cm-1，4 000～400 cm-1全譜掃描， 分別檢測(cè)熊果酸單體、茶氨酸單體和溶劑法復(fù)合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶解度測(cè)定結(jié)果

香草醛-冰醋酸法測(cè)定熊果酸含量， 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝5.718x＋0.1547(r＝0.996)， 測(cè)定熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在蒸餾水中的溶解度為2.15 mg/L，0.2%SDS-PBS 水溶液中溶解度為23.38 mg/L(祁雯等[11]測(cè)定結(jié)果分別為1.7 和23.3 mg/L)。 熊果酸在蒸餾水中的溶解度低， 用分光光度法較難測(cè)定， 因此參考祁雯等[11]模擬腸溶液的條件，將溶劑法復(fù)合物和研磨法復(fù)合物用0.2%SDSPBS 水溶液溶解， 得到復(fù)合物的過(guò)飽和溶液， 取濾液用香草醛-冰醋酸法測(cè)定溶液中熊果酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同比例熊果酸-茶氨酸共無(wú)定型復(fù)合物中熊果酸溶解度

表1 顯示， 熊果酸和茶氨酸的比例在1 ∶5的時(shí)候， 熊果酸水溶解度最高， 茶氨酸的加入可以提高熊果酸的水溶解度， 但過(guò)多的茶氨酸反而不利于熊果酸的溶解。 推測(cè)是由于過(guò)多的茶氨酸溶解于水， 在水中形成離子， 這些離子的存在，影響了復(fù)合物在水中的溶解度， 導(dǎo)致熊果酸水溶解度下降。

對(duì)溶劑法復(fù)合物與研磨法復(fù)合物中熊果酸的水溶解度進(jìn)行對(duì)比可以看出， 最佳比例制備的溶劑法復(fù)合物中熊果酸的溶解度遠(yuǎn)高于熊果酸單體的溶解度， 而研磨法復(fù)合物中熊果酸的水溶解度雖然有所提高， 但沒(méi)那么明顯。 由此可見(jiàn)， 在熊果酸與茶氨酸共無(wú)定型復(fù)合物制備中， 溶劑法較之物理研磨法對(duì)熊果酸水溶解度的提高效果更好。 分析其原因， 推測(cè)可能是研磨程度不夠， 茶氨酸和熊果酸分子間并沒(méi)有充分的碰撞， 手動(dòng)研磨效果有限， 今后可以嘗試采用球磨機(jī)進(jìn)行制備。

2.2 PXRD 圖譜分析

熊果酸單體、 茶氨酸單體、 溶劑法復(fù)合物的相應(yīng)PXRD 圖譜見(jiàn)圖1。 熊果酸單體與茶氨酸單體均有多個(gè)較強(qiáng)的結(jié)晶衍射峰， 而溶劑法復(fù)合物的圖譜中， 雖然也存在少數(shù)的結(jié)晶衍射峰， 但是與熊果酸、 茶氨酸二者對(duì)應(yīng)的幾個(gè)明顯衍射峰消失； 熊果酸(A)與茶氨酸(B)中沒(méi)有， 但溶劑法復(fù)合 物(C) 新 出 現(xiàn) 的 特 征 峰 有5.4°、 8.3°、10.8°、 14.8°和21.7°； 熊果酸(A)與(或)茶氨酸(B)中具備的， 但溶劑法復(fù)合物(C)中未觀察到的特征峰有13.4°(A、 B)、 25.1°(A、 B)、32.1°(B)、 34.5°(B)、 36.9°(B)， 復(fù)合物中26.9°(C)為28.2°(A)與27.4°(B)融合成的一個(gè)特征峰， 說(shuō)明熊果酸與茶氨酸可能形成非晶型狀態(tài)共存。

圖1 單體及溶劑法復(fù)合物樣品的PXRD 圖譜

2.3 FTIR 分析

FTIR 掃描結(jié)果如圖2 所示， 熊果酸單體中2個(gè)游離—OH 訊號(hào)出現(xiàn)在3 448 cm-1處， 1 個(gè)—C＝O 訊號(hào)出現(xiàn)在1 716 cm-1處， —C ＝C—的特征峰在1 701 cm-1處， 9 組—CH2訊號(hào)出現(xiàn)在2 952 cm-1處； 茶氨酸單體掃描結(jié)果顯示， 2 個(gè)—C ＝O訊號(hào)出現(xiàn)在1 650 cm-1處， —OH 訊號(hào)出現(xiàn)在3 330cm-1處、 —NH 特征峰在1 580 cm-1處， 3 組—CH2與1 組—CH3訊號(hào)出現(xiàn)在2 890 cm-1處， —NH2的特征峰在1 650 cm-1處。 但3 300 ～3 350 cm-1雙峰信號(hào)可能因?yàn)闇y(cè)試樣品含水， 被3 400～3 500 cm-1的水峰覆蓋。 熊果酸-茶氨酸共無(wú)定型復(fù)合物(1 ∶5)掃描結(jié)果顯示， 1 650 cm-1的峰明顯往左移至近1720 cm-1處， 推測(cè)-NH2參與了氫鍵的連結(jié)而發(fā)生變化， 而原有-OH 的3 300～3 400 cm-1訊號(hào)右移至2 950 cm-1附近， 推測(cè)—OH 也參與了氫鍵的改變。

圖2 單體及溶劑法復(fù)合物樣品的FTIR 掃描圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)溶劑法和物理研磨法進(jìn)行熊果酸-茶氨酸共無(wú)定型復(fù)合物的制備， 以提高熊果酸的水溶解度。 確定最佳的熊果酸與茶氨酸摩爾比為1 ∶5， 此時(shí)溶劑法復(fù)合物中熊果酸在0.2%SDS-PBS 中溶解度最高為63.13 mg/L， 是單體熊果酸的2.70 倍， 而研磨法復(fù)合物中熊果酸溶解度為32.70 mg/mL， 說(shuō)明溶劑法優(yōu)于物理研磨法。

PXRD 和FTIR 圖譜分析結(jié)果顯示， 熊果酸與茶氨酸兩分子間是通過(guò)氫鍵結(jié)合形成共無(wú)定型狀態(tài)， 說(shuō)明溶劑法可以制備熊果酸-茶氨酸共無(wú)定型復(fù)合物。

熊果酸對(duì)人體有很重要的藥理作用， 但是因?yàn)槠湓谒腥芙庑詷O低， 導(dǎo)致其很難被人體吸收， 降低了其生物利用度。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究熊果酸與茶氨酸形成的共無(wú)定型復(fù)合物， 為提高熊果酸在人體內(nèi)溶解度提供了一條途徑。