枇杷等果樹中苦杏仁甙的提取檢測(cè)及生化機(jī)理研究進(jìn)展

林 旺 ， 林素英 ， 陳 宇 ， 吳錦程 *

( 1.莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院， 福建 莆田 351100；2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 莆田 351100 )

0 引言

傳統(tǒng)中藥苦杏仁為薔薇科植物山杏(Prunus armeniacavar.ansu)、 西伯利亞杏(P.sibirica)、 東北杏(P.mandshurica) 或杏(P.armeniaca) 的干燥成熟種子。 苦杏仁作為中藥最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》， 后被《中華人民共和國(guó)藥典》 所收載。 苦杏仁中起主要藥理作用的物質(zhì)為苦杏仁甙(Amygdalin)， 苦杏仁甙是芳香族中氰甙類化合物的一種， 又名維生素B17， 卻不屬于B 族維生素[1]， 而屬于β-型糖苷， 由龍膽二糖和苦杏仁腈組成， 其結(jié)構(gòu)式如圖1 所示[2]。 藥理學(xué)研究表明， 苦杏仁甙具有抗腫瘤、 抗纖維化、 抗菌消炎、 止咳鎮(zhèn)痛、 調(diào)節(jié)免疫力和抗氧化等作用， 但對(duì)于其生化機(jī)理尚不明確[3]。 有關(guān)苦杏仁甙的研究可追溯至19 世紀(jì)初， 早在1803 年， Schrader首次發(fā)現(xiàn)了苦杏仁甙； 1830 年， Robiqret 等從苦杏仁中提取出苦杏仁甙[4]。 本文綜合近年來研究成果， 就枇杷及薔薇科其他一些果樹中苦杏仁甙的提取、 檢測(cè)及其生化機(jī)理研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述， 并展望了未來研究方向和苦杏仁甙的開發(fā)應(yīng)用前景。

圖1 苦杏仁甙的結(jié)構(gòu)式

1 苦杏仁甙在枇杷及薔薇科其他一些果樹中含量分析

苦杏仁甙不單存在于山杏中， 在其他一些薔薇科果樹， 如枇杷、 桃、 山楂、 李等的種仁、 果肉、 根、 花、 葉等器官中， 也廣泛存在， 但其含量在不同薔薇科果樹、 不同產(chǎn)地、 不同器官、 不同組織中均存在差異。 以枇杷為例， 根據(jù)周春華等研究表明， 枇杷果肉的苦杏仁甙含量很低， 而種仁中則含量較高， 一般可達(dá)2% ～ 3%固重(dw)[5]， 與花、 根相當(dāng)， 但它們均明顯低于葉片， 且不同品種及發(fā)育階段的枇杷果仁苦杏仁甙含量差別較大[6]。 筆者綜合了近幾年的文獻(xiàn)記載， 截至2021 年9 月， 有關(guān)從枇杷等薔薇科果樹中提取苦杏仁甙的部分文獻(xiàn)見表1。

表1 從枇杷等薔薇科果樹中提取苦杏仁甙的相關(guān)文獻(xiàn)介紹

2 苦杏仁甙檢測(cè)技術(shù)

2.1 樣品前處理

在檢測(cè)前， 需對(duì)樣品進(jìn)行前處理。 待測(cè)樣品往往雜質(zhì)較多且待測(cè)組分含量較低， 前處理是指待測(cè)樣品在進(jìn)樣檢測(cè)前所進(jìn)行的提取、 濃縮、 凈化等過程， 可使待測(cè)組分純化、 富集， 以利于后續(xù)的定性、 定量分析[16-17]。 樣品的前處理在分析檢測(cè)中至關(guān)重要且非常耗時(shí)， 對(duì)整個(gè)檢測(cè)的效率有著決定性的影響， 前處理的好壞直接影響檢測(cè)結(jié)果。 如田士林等在對(duì)薔薇科植物種仁中的苦杏仁甙進(jìn)行提取時(shí)， 前處理的時(shí)間達(dá)48 h 之久[10]；而張瑾等[11]、 沈廷明等[12]在對(duì)枇杷花中的苦杏仁甙進(jìn)行提取時(shí)， 前處理時(shí)間為2～3 h。

傳統(tǒng)的苦杏仁甙的提取通常采用水浸提法[18]， 此法需用大量的水高溫浸泡， 耗時(shí)長(zhǎng)，且苦杏仁甙在浸泡過程中部分水解， 給后續(xù)的提純帶來了一定干擾。 在浸泡液中加入一定濃度的乙醇可以提高提取效率[19]， 但操作繁復(fù)且存在燃爆風(fēng)險(xiǎn)。 后續(xù)人們?cè)诮莘ǖ幕A(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)， 采用不同功率的超聲波輔助來提高對(duì)苦杏仁甙的提取速率[20]， 但超聲功率需精準(zhǔn)控制， 否則易造成苦杏仁甙降解； 同時(shí)， 如何控制高能耗是有待進(jìn)一步解決的問題。 利用加壓的方式可進(jìn)行閃式提取， 但閃式提取不利于產(chǎn)率的提高， 原料浪費(fèi)現(xiàn)象較嚴(yán)重。 此外， Kawahito 等利用超臨界萃取法提取苦杏仁甙[21]， 該方法的缺點(diǎn)是危險(xiǎn)性較高、 成本昂貴。

2.2 檢測(cè)分析技術(shù)

2.2.1 間接法

在加熱、 酶或酸性環(huán)境下， 苦杏仁甙會(huì)在一些酶類(如苦杏仁甙酶及櫻葉酶等)的作用下分解為氫氰酸、 苯甲醛和葡萄糖， 間接檢測(cè)方法是對(duì)苦杏仁甙分解后所產(chǎn)生的氫氰酸進(jìn)行標(biāo)定的一種方法。 通過化學(xué)分析法標(biāo)定氫氰根的方法有多種， 常見的有銀量法、 中國(guó)藥典法、 化學(xué)發(fā)光法、 電化學(xué)法等。 如夏其樂等在弱酸性條件下，加入氯胺-T 和吡啶-巴比妥酸使其變色， 再測(cè)其吸光度[22]。 間接法不需要大型精密儀器， 但是所測(cè)結(jié)果精度較低， 且過程繁瑣， 不適合用于產(chǎn)品的批量檢測(cè)。

2.2.2 直接法

直接法是目前使用較為廣泛、 分析技術(shù)較成熟的一種方法， 多用于天然產(chǎn)物的分析檢測(cè)。 在苦杏仁甙的檢測(cè)與分析中使用較多的包括薄層掃描法(TLCS)、 高效液相色譜法(HPLC)和二階導(dǎo)數(shù)光譜法(D2S)等。 TLCS 又名薄層色譜掃描法(QTLC)， 它是利用各波段的光掃射薄層板， 對(duì)薄板存在可見或紫外吸收的成分進(jìn)行掃描， 將掃描得到的圖譜通過電子信號(hào)傳輸至終端， 并用于定性定量分析的一種方法。 HPLC 是在傳統(tǒng)色譜法的基礎(chǔ)上， 引入了氣相色譜的理論， 是以高壓下的液體為流動(dòng)相的檢測(cè)分析技術(shù)。 HPLC 應(yīng)用廣泛， 近80%的有機(jī)化合物可用該法測(cè)定。 導(dǎo)數(shù)光譜又名微分光譜， 屬于紫外吸收光譜的一種，D2S 操作簡(jiǎn)單、 準(zhǔn)確率高， 具有可不經(jīng)分離而直接對(duì)復(fù)雜成分進(jìn)行測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)。

井山林等通過繪制苦杏仁甙標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收曲 線 測(cè) 定 其 含 量[23]； Kang 等[24]、 Isozaki等[25]、 呂偉峰[26]用毛細(xì)管膠束電泳法測(cè)苦杏仁甙異構(gòu)體的含量； 李吉來等利用QTLC 測(cè)定苦杏仁中的苦杏仁甙， 含量可達(dá)2.49%[27]； 李海龍等利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定苦杏仁中苦杏仁甙含量， 測(cè)得苦杏仁中苦杏仁甙平均含量為2.31%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 為1.65%[28]； 劉瑞琛等建立高效液相色譜-串聯(lián)桿質(zhì)譜法測(cè)定芪龍膠囊中的苦杏仁甙含量， 其線性范圍可達(dá)20～5000ng/mL， 線性系數(shù)為0.9979[29]； 萬書彤等建立超高效液相色譜法檢測(cè)逐瘀通竅口服液中苦杏仁甙含量， 其檢出限為39.70 ～794.00 mg/L[30]； 吳迪等對(duì)比了HPLC 和D2S 對(duì)苦杏仁的分析效果， 結(jié)果表明: 該2 種方法所測(cè)得的苦杏仁甙的含量基本一致， 精確度高， 重現(xiàn)性好，D2S 消除背景液干擾的效果更佳[31]； 易駿利用D2S 測(cè)定桃仁中苦杏仁甙的含量， 結(jié)果表明， 該法快速可靠， 測(cè)定過程中樣品不經(jīng)分離即可消除背景干擾[32]。

2.2.3 生物分析法

常見的生物分析法有酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)法等， ELISA 法將可溶性受檢樣本的抗原或抗體結(jié)合到固相載體上， 利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)。 Cho 等以匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)作為載體蛋白與苦杏仁甙結(jié)合， 分析苦杏仁甙在堅(jiān)果中的含量， 同時(shí)， 以兔/人嵌合抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫分析， 其檢測(cè)限可達(dá)1×10-9mol/L[33]； 宋正華等將葡萄糖苷酶、 發(fā)光氨、 殼質(zhì)胺和大孔陰離子交換劑組成流動(dòng)注射系統(tǒng)， 利用苦杏仁甙分解生成的氫氰酸根與溶解氧反應(yīng)生成超氧陰離子自由基， 可用于苦杏仁甙的測(cè)定[34]。

3 苦杏仁甙的生化機(jī)理

3.1 苦杏仁甙的藥理作用

3.1.1 抗腫瘤作用

關(guān)于苦杏仁甙的抗腫瘤作用， 學(xué)術(shù)界仍存在爭(zhēng)議。 贊同方認(rèn)為， 苦杏仁甙可釋放出氰化物和苯， 對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性的殺傷力， 而對(duì)健康細(xì)胞則影響不大； 反對(duì)方認(rèn)為， 苦杏仁甙的抗腫瘤依據(jù)不充分， 且具有毒性， 不適合用于醫(yī)療診治。 國(guó)內(nèi)目前有較多關(guān)于苦杏仁甙抗腫瘤的報(bào)道。 聶振等利用β-葡萄糖苷酶激活苦杏仁甙用于限制膀胱癌EJ 細(xì)胞株的生長(zhǎng)， 結(jié)果表明， 腫瘤細(xì)胞的凋亡速度隨著苦杏仁甙濃度的增加而明顯加快， 表明β-葡萄糖苷酶/苦杏仁甙酶解前藥系統(tǒng)可能成為治療膀胱癌的有效策略[35]。 連彥軍等的研究表明， 苦杏仁甙可在抗-CEA 單抗-β-葡萄糖苷酶偶聯(lián)物的作用下， 對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞(LoVo)有靶向殺傷效果， 副作用低， 療效顯著[36]。

3.1.2 抗纖維化作用

纖維化是器官病理增生， 可發(fā)生在人體眾多臟器， 導(dǎo)致功能障礙。 張向群等總結(jié)了苦杏仁甙在緩解肝、 胰、 腎等器官的纖維化方面有顯著療效[37]。 郭君其等發(fā)現(xiàn)， 苦杏仁甙可加速成纖細(xì)胞的凋亡， 延緩移植腎的纖維化速度[38]。 李雪梅等的研究表明， 在苦杏仁甙的作用下， 大鼠肝組織的活性有明顯提升， 肝纖維化狀況得到改善[39]。 洪長(zhǎng)福等采用苦杏仁甙對(duì)矽肺大鼠進(jìn)行治療， 發(fā)現(xiàn)苦杏仁甙對(duì)大鼠矽肺纖維化有明顯的抑制作用[40]。

3.1.3 抗菌消炎作用

研究表明， 苦杏仁甙具有一定的抗菌消炎作用。 盧明芳等觀察120 位老年胃潰瘍患者， 采用口服苦杏仁甙方式治療， 結(jié)果表明， 苦杏仁甙可提高治療效果， 加快胃炎的痊愈[41]。 蔡瑩在小鼠束縛-冷凍應(yīng)激性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 苦杏仁甙對(duì)醋酸性胃炎的愈合有明顯效果； 大鼠醋酸燒灼潰瘍模型則表明， 苦杏仁甙對(duì)胃潰瘍有防治作用， 且對(duì)大鼠關(guān)節(jié)的腫脹， 有一定的抑制作用[42]。

3.1.4 止咳鎮(zhèn)痛作用

研究表明， 苦杏仁甙分解能產(chǎn)生微量的氫氰酸， 可在一定程度上抑制呼吸神經(jīng)的敏感性， 從而達(dá)到止咳作用。 同時(shí)， 苦杏仁甙分解產(chǎn)生的苯甲醛可與安息香縮合酶反應(yīng)生成安息香， 具有一定的鎮(zhèn)痛作用。 林國(guó)榮用二氧化硫刺激小鼠， 引發(fā)咳嗽， 以苦杏仁甙灌胃， 結(jié)果表明， 止咳效果明顯[10]。 甘露發(fā)現(xiàn)， 苦杏仁甙對(duì)支氣管平滑肌細(xì)胞的增殖具有抑制作用， 可用于大鼠鎮(zhèn)咳[43]。朱友平等通過小鼠板熱法和醋酸扭體法證實(shí)苦杏仁甙有一定鎮(zhèn)痛作用， 且無副作用[44]。

3.1.5 調(diào)節(jié)免疫力作用

方偉蓉等發(fā)現(xiàn)， 苦杏仁甙可顯著降低大鼠胃蛋白酶活性， 具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用[45]。 郭君其等觀察了苦杏仁甙對(duì)人淋巴細(xì)胞增殖的影響， 結(jié)果顯示， 苦杏仁甙可增強(qiáng)細(xì)胞的免疫作用[38]。 鄭巧玲等的研究表明， 苦杏仁甙有明顯的促進(jìn)人血T 淋巴細(xì)胞PCC 分裂增殖作用[46]。李春華等以小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?發(fā)現(xiàn)苦杏仁甙對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能具有一定作用[47]。

3.1.6 抗氧化作用

董捷等的研究表明， 苦杏仁甙對(duì)各種自由基的清除具有一定效果， 抗氧化性能明顯[48]。 鄔曉勇等發(fā)現(xiàn)， 苦杏仁甙可有效清除自由基DPPH，當(dāng)濃度為7.50 mg/mL 時(shí)， 對(duì)DPPH 的清除率可達(dá)90.9%[15]。

3.2 苦杏仁甙的降解

苦杏仁甙在酸性環(huán)境或酶的作用下可水解成葡萄糖和野黑櫻甙， 野黑櫻甙最終可生成苯甲醛和氫氰酸， 如圖2 所示。 李強(qiáng)等通過檢測(cè)水解產(chǎn)物中的葡萄糖含量來研究苦杏仁甙的水解率， 實(shí)驗(yàn)表明， 當(dāng)苦杏仁甙樣品中加入5 倍量的0.2 mol/L 的鹽酸溶液， 在40℃下反應(yīng)40 min， 水解率可達(dá)到94.62%[49]。 因此， 為了提高檢測(cè)精度和準(zhǔn)確率， 在測(cè)定過程中如何抑制苦杏仁甙的酶解和水解將是今后研究的重點(diǎn)。

圖2 苦杏仁甙降解過程

苦杏仁甙在動(dòng)物體內(nèi)的代謝研究表明， 其在胃中消化酶的作用下， 同樣可分解為野黑櫻甙和葡萄糖。 野黑櫻甙通過腸道菌群的作用分解為苯乙醇腈(杏仁腈)， 繼而羥基化反應(yīng)分解成苯甲醛和氫氰酸。 而實(shí)驗(yàn)表明， 苦杏仁甙所發(fā)揮的生化機(jī)理作用， 如抗腫瘤、 抗纖維化、 抗菌消炎、 止咳鎮(zhèn)痛、 調(diào)節(jié)免疫力等， 多數(shù)跟其分解的產(chǎn)物有關(guān)， 當(dāng)然， 這還需要通過更多生化機(jī)理性的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

4 展望

綜觀上述研究， 苦杏仁甙不僅存在于苦杏仁中， 在枇杷及其他一些薔薇科植物中也普遍存在， 其代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、 抗纖維化、 抗菌消炎、 止咳鎮(zhèn)痛、 調(diào)節(jié)免疫力及抗氧化等作用。 關(guān)于其提純、 檢測(cè)、 生化機(jī)理等方面的研究也有不少文獻(xiàn)報(bào)道， 但在某些方面仍存在不足。

4.1 苦杏仁甙提取、 檢測(cè)方面

近年來， 對(duì)苦杏仁甙的提取研究多集中于水浸提、 醇浸提， 而對(duì)于超聲、 微波等輔助方法涉及較少， 且提取大多在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行， 對(duì)提取效率的追求較極致化， 然而關(guān)于量化提取的研究則鮮有報(bào)道， 今后可加大對(duì)量化生產(chǎn)的研究，合理應(yīng)用超聲、 微波輔助技術(shù)。 苦杏仁甙檢測(cè)技術(shù)目前已較為成熟， 但苦杏仁甙在酸性環(huán)境或酶的作用下容易分解， 會(huì)對(duì)最終的測(cè)定結(jié)果造成較大影響， 此問題應(yīng)引起更大的關(guān)注。

4.2 苦杏仁甙生化機(jī)理研究方面

對(duì)于苦杏仁甙生化機(jī)理的研究方面， 目前多處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段， 人體臨床研究相對(duì)較少。 而對(duì)苦杏仁甙功能作用的分子機(jī)理還需更深一步的探索， 如: 抗腫瘤機(jī)理大多尚未明確， 分解過程所產(chǎn)生的氫氰酸的毒理作用和藥理作用仍有待驗(yàn)證， 苦杏仁甙的其他一些代謝產(chǎn)物的鑒定也有待進(jìn)一步研究。

4.3 苦杏仁甙開發(fā)應(yīng)用方面

苦杏仁甙作為一種廣泛分布的天然活性成分， 其開發(fā)應(yīng)用還處于萌芽階段。 我國(guó)薔薇科植物資源豐富， 如福建莆田作為國(guó)內(nèi)重要的枇杷基地之一， 擁有大量的枇杷資源。 目前， 對(duì)于枇杷資源的利用除了果實(shí)和一些常見的深加工產(chǎn)品外， 還鮮有其他方面的開發(fā)利用。 而苦杏仁甙作為枇杷加工處理過程中的重要附加產(chǎn)物， 在提高產(chǎn)業(yè)附加值方面具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。