番茄青枯病拮抗菌株的篩選、鑒定及發(fā)酵條件的優(yōu)化

盧曉虹，許 敏，李甜爽，劉海霞，王美琴

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

近年來(lái)，隨著設(shè)施番茄種植面積的不斷擴(kuò)大，品 種單一，連作現(xiàn)象嚴(yán)重等問(wèn)題導(dǎo)致土傳性病害發(fā)生嚴(yán)重，其中由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的番茄青枯病，嚴(yán)重時(shí)造成毀滅性危害。番茄青枯病是設(shè)施栽培的重要病害之一，該病可造成番茄植株大面積萎蔫直至死亡，發(fā)病較嚴(yán)重的田塊發(fā)病率可高達(dá)80%以上，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量，使其產(chǎn)量急劇下降甚至絕收[1-3]。對(duì)于番茄青枯病常用的防治方法主要有施用化學(xué)藥劑、改良土壤結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及選育抗病品種等，但這些防治方法效果均不穩(wěn)定[[4-5]，且長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)、農(nóng)藥殘留、產(chǎn)生抗藥性、微生物態(tài)體系遭到破壞等不良影響，因此，生物防治成為解決土傳性病害最有效、安全的防治方法之一[6-7]，同時(shí)也受到人們的廣泛關(guān)注與研究。利用拮抗菌防治番茄青枯病成為具有應(yīng)用前景的防治措施之一，如何分離篩選出在室內(nèi)有較好抑菌效果的菌株并可在田間發(fā)揮理想的防治效果，是生物防治面臨解決的關(guān)鍵性問(wèn)題。王麗麗等[4]利用篩選到的拮抗菌株W12和W118進(jìn)行田間生防效果試驗(yàn)，其防治效果達(dá)到43.0%。鄭雪芳等[1]采用抑菌圈法篩選出24個(gè)對(duì)青枯雷爾氏菌具有拮抗作用的菌株，其中，菌株FJAT-20261和FJAT-19700盆栽防效分別達(dá)72.73%和67.77%。羅坤等[8]篩選出6株對(duì)番茄青枯病有拮抗活性的菌株，其中，1株拮抗菌株室內(nèi)盆栽防效達(dá)96.40%。進(jìn)一步加強(qiáng)此方面的研究將有效控制青枯病的發(fā)生和流行，從而確保拮抗菌株持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)揮防治效果，特別是具有拮抗效果微生物的生存環(huán)境和生態(tài)適應(yīng)能力是決定防治效果的關(guān)鍵所在。利用生防菌防治植物病害，主要是通過(guò)其代謝產(chǎn)物及其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對(duì)病菌起到抑制作用[9-10]。微生物在代謝過(guò)程中，會(huì)受到諸多因素影響，如培養(yǎng)時(shí)間、p H、溫度、培養(yǎng)基組分等[11]。有益微生物在適宜的環(huán)境條件下培養(yǎng)有利于其生長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化增加拮抗菌株抑菌活性物質(zhì)的數(shù)量，從而提高抑菌效果[12]。發(fā)酵優(yōu)化過(guò)程中常采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法[13]，以測(cè)量的吸光度值及抑菌圈大小為參考指標(biāo)[14-16]，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[17-19]。

目前，番茄青枯病生物防治方法大都處于試驗(yàn)階段，進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)的很少。前人篩選出來(lái)的拮抗菌株在室內(nèi)的盆栽試驗(yàn)當(dāng)中效果明顯，但在田間條件下出現(xiàn)防治效果不太穩(wěn)定的現(xiàn)象。為了能有效控制番茄青枯病害的發(fā)生流行，分離篩選出具有較好抑菌效果的菌株具有重要意義。目前，番茄青枯病生物防治方面缺乏高效穩(wěn)定的生防菌株。為此，本試驗(yàn)從健康番茄植株根際土壤中篩選出理想的拮抗菌株，并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出有效防治青枯病的生物菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土樣 土樣采集于太谷縣范村鎮(zhèn)象谷村健康番茄植株的根際土壤，共采集38份土樣。

1.1.2 供試菌株 番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：蔗糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，瓊脂粉15 g，1 000 mL蒸餾水，p H值7.0；NA培養(yǎng)基中不加瓊脂粉即NB培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄根際土樣中微生物的分離 采用稀釋涂布分離法，每份土樣取10 g，碾碎后加入三角瓶（有玻璃珠）中，再加入90 mL無(wú)菌水振蕩30 min，靜止后依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6g/mL質(zhì)量濃度梯度的菌懸液，每個(gè)梯度取0.1 mL涂布在NA平板上[20]，然后置于30℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后觀察，挑取不同形態(tài)特征的單菌落純化后進(jìn)行編號(hào)。

1.2.2 番茄青枯病菌拮抗菌株的篩選 初選：采用對(duì)峙培養(yǎng)法，將培養(yǎng)48 h的番茄青枯病菌菌懸液稀釋1 000倍后涂布在NA平板上，靜止10 min后，將1.2.1分離純化的147個(gè)菌株均勻點(diǎn)接在平板上[20]，每個(gè)平板點(diǎn)接4個(gè)菌株，在30℃培養(yǎng)24 h后觀察，記錄有抑菌效果的菌株，每個(gè)處理重復(fù)3次。

復(fù)選：將初選具有拮抗效果的細(xì)菌菌株18個(gè)分別接種到NB培養(yǎng)液中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h制成菌懸液，稀釋1 000倍后取0.1 mL均勻涂布在NA平板上，靜止20 min后將蘸有番茄青枯病菌發(fā)酵液的無(wú)菌濾紙小圓片接在平板中央，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄抑菌圈的大小，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 拮抗菌株B-6的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)鑒定 將1.2.2篩選到的拮抗菌株B-6接種到NA平板上，觀察細(xì)菌菌落的大小、顏色、邊緣形狀、隆起形狀和透明度及觀察在NB液體培養(yǎng)液菌株的培養(yǎng)性狀，如有無(wú)色素的產(chǎn)生、有無(wú)沉淀、有無(wú)菌璞和菌膜的產(chǎn)生、有無(wú)特殊氣味等；通過(guò)革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)，通過(guò)掃描電鏡在電鏡下觀察菌體的形態(tài)、大小等特征。

1.2.3.2 生理生化鑒定 測(cè)定生理生化指標(biāo)的具體試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[21-22]進(jìn)行。

1.2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 采用TSINGKE植物DNA提取試劑盒對(duì)拮抗菌株B-6的基因組DNA進(jìn)行提取，且對(duì)拮抗菌株B-6的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。16S rDNA PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物：正向引物為5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；提取的DNA樣品適量稀釋后作為PCR模板，以1×TSE101金牌mix進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并將準(zhǔn)備好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至西安擎科測(cè)序有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 拮抗菌株B-6生長(zhǎng)曲線的測(cè)定及種子培養(yǎng) 將1.2.2篩選出的拮抗菌株B-6菌株活化后，從平板上挑取2環(huán)接種于50 mL（250 mL錐形瓶）NB培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取出1瓶測(cè)其吸光度（OD600），重復(fù)3次。以O(shè)D600為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制拮抗菌株B-6的生長(zhǎng)曲線[23]。根據(jù)生長(zhǎng)曲線培養(yǎng)菌種直到生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后將其接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.5 拮抗菌株B-6發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.5.1 最佳碳源的篩選 蛋白胨5 g、氯化鈉3 g、蒸餾水1 000 mL、p H值調(diào)至7.0左右，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶裝液量50 mL，制成無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)液。將葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉及果糖共5種碳源配制成體積分?jǐn)?shù)為10%的溶液[24]，與無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)液分開(kāi)滅菌。滅菌完畢后，將碳源溶液以1%的量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中。待冷卻后加入1%的拮抗菌株種子液，置于28℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，將發(fā)酵液取0.1 mL涂布在NA平板上，平板中央點(diǎn)接番茄青枯病菌進(jìn)行平板對(duì)峙，根據(jù)其抑菌圈大小來(lái)確定最佳碳源。

1.2.5.2 最佳氮源的篩選 蔗糖10 g、氯化鈉3 g、蒸餾水1 000 mL、p H值調(diào)至7.0左右，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶裝液量50 mL，制成無(wú)氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)液。將蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、氯化銨及硫酸銨共5種氮源配制成體積分?jǐn)?shù)為5%的溶液[24]，與無(wú)氮源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液分開(kāi)滅菌。滅菌完畢后，將氮源溶液以0.5%的量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中。方法同1.2.5.1，根據(jù)其抑菌圈大小選出最佳氮源。

1.2.5.3 最佳無(wú)機(jī)鹽的篩選 蔗糖10 g、蛋白胨5 g、蒸餾水1 000 mL，p H值調(diào)至7.0左右，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶裝液量50 mL，制成不含無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。將氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸亞鐵及氯化鉀共5種無(wú)機(jī)鹽配制成體積分?jǐn)?shù)為3%的溶液[24]，與不含無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)液分開(kāi)滅菌。滅菌完畢后，將無(wú)機(jī)鹽溶液以0.3%的量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中。方法同1.2.5.1，根據(jù)其抑菌圈大小選出最佳無(wú)機(jī)鹽。

1.2.5.4 正交試驗(yàn) 發(fā)酵培養(yǎng)基各因素間最佳配比組合：以抑菌圈直徑的大小為衡量指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源體積分?jǐn)?shù)（A）、氮源體積分?jǐn)?shù)（B）、無(wú)機(jī)鹽體積分?jǐn)?shù)（C）進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)影響因素設(shè)置3個(gè)水平，組成3因素3水平正交試驗(yàn)。各因素水平如表1所示，之后按SPSS正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)出的各因素水平的組合方案進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。將NB培養(yǎng)基分裝50 mL于規(guī)格為250 mL錐形瓶中，接種1%的菌株種子液，后置于28℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，通過(guò)對(duì)峙試驗(yàn)測(cè)量其抑菌圈直徑大小。對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析，確定各因素各水平間的最佳組合。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基因素水平Tab.1 Fermentation medium factor level %

1.2.6 拮抗菌株B-6發(fā)酵條件的優(yōu)化 以確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選出對(duì)發(fā)酵效果影響較大的發(fā)酵時(shí)間（D）、裝液量（E）、接種量（F）及pH（G）4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，組成4因素3水平試驗(yàn)（表2），使用SPSS進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定組合方式進(jìn)行試驗(yàn)。各處理分別置于相應(yīng)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后與番茄青枯病原菌進(jìn)行平板對(duì)峙測(cè)量其抑菌圈直徑大小，3次重復(fù)。對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析，經(jīng)綜合分析確定最佳發(fā)酵條件。

表2 發(fā)酵條件因素水平Tab.2 Fermentation condition factor level

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用Excel 2019進(jìn)行圖表的制作；采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、極差分析及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄青枯病菌拮抗菌株分離與篩選

從38份土樣中共分離篩選出147株平板菌落形態(tài)特征不同的菌株，初篩結(jié)果分離篩選出18株有抑菌效果的拮抗菌株，經(jīng)純化和復(fù)篩，其中，拮抗菌株B-6與B-17菌株抑菌效果最好，且比較穩(wěn)定，B-6抑菌圈直徑達(dá)到13.8 mm，B-17抑菌圈直徑達(dá)到12.3 mm，其拮抗菌株的平板抑菌效果如圖1所示。

2.2 拮抗菌株B-6培養(yǎng)性狀及菌體形態(tài)

從圖2可以看出，拮抗菌株B-6在平板上的單菌落為不規(guī)則圓形，呈淡黃色，不透明，微隆起，略有光澤度，邊緣不整齊，有刺激性氣味產(chǎn)生；拮抗菌株B-6在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，逐漸變渾濁，3 d后，試管內(nèi)出現(xiàn)乳白色沉淀，5 d后在液體表面長(zhǎng)出了白色菌璞，在培養(yǎng)液中出現(xiàn)片狀菌膜（圖3）。

拮抗菌株B-6經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可知G+，菌體短桿狀，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛（圖4）；通過(guò)電鏡觀察可知，拮抗菌株B-6細(xì)胞為短桿狀，菌體大小約為（1.5～2.7）μm×（0.5～1.2）μm，不具有鞭毛，單個(gè)或2～4個(gè)細(xì)胞形成短鏈（圖5）。

2.3 拮抗菌株B-6的生理生化特性

對(duì)拮抗菌株B-6各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明（表3），該菌株在20～37℃可以生長(zhǎng)，4℃以下和41℃以上停止生長(zhǎng)；耐鹽性與需鹽性試驗(yàn)表明，該菌株可以在含有2%～7%的NaCl培養(yǎng)液中生長(zhǎng)；熒光色素中菌株培養(yǎng)1、3、5 d后在紫外燈下觀察均有熒光；丙二酸與檸檬酸鹽試驗(yàn)中呈陽(yáng)性。葡萄糖氧化發(fā)酵中經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，2種指示培養(yǎng)基均產(chǎn)酸變黃，為發(fā)酵型；接觸酶和甲基紅試驗(yàn)呈陽(yáng)性；糖類發(fā)酵試驗(yàn)指示劑沒(méi)有變色呈陰性；淀粉水解反應(yīng)呈陽(yáng)性；V-P測(cè)定試驗(yàn)呈陰性；硝酸鹽還原測(cè)定試驗(yàn)為硝酸鹽還原陽(yáng)性。

表3 拮抗菌株B-6的生理生化鑒定結(jié)果Tab.3 Physiological and biochemical identification result of the strain B-6

2.4 拮抗菌株B-6的分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)提取拮抗菌株B-6的基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條長(zhǎng)約1 500 bp的DNA片段，經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后得到長(zhǎng)度為1 424 bp的16S rDNA序列，將上述16S rDNA與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的16S rDNA序列進(jìn)行同源相似性比較，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖6）。對(duì)比結(jié)果表明，拮抗菌株B-6與假單胞菌的遺傳距離最近，且它與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）處于同一分支上，拮抗菌株B-6 16S序列比對(duì)結(jié)果為Pseudomonasaeruginosastrain Pa84（或同屬）。綜合拮抗菌株B-6的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。

2.5 拮抗菌株B-6的生長(zhǎng)曲線繪制

由圖7可知，拮抗菌株B-6生長(zhǎng)曲線分布：0～7 h為延遲期，8～22 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，23～25 h為穩(wěn)定期，25 h后細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，菌株生長(zhǎng)迅速，代謝旺盛，適合作種子液。因此，最終確定拮抗菌株B-6發(fā)酵用種子液培養(yǎng)時(shí)間為22 h。

2.6 拮抗菌株B-6發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

通過(guò)比較不同培養(yǎng)基發(fā)酵所得到的發(fā)酵培養(yǎng)液的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為麥芽糖時(shí)，抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達(dá)到（15.80±0.30）mm。通過(guò)比較加入不同氮源發(fā)酵得到的發(fā)酵培養(yǎng)液的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基氮源為蛋白胨時(shí)，抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達(dá)到（16.20±0.20）mm。通過(guò)試驗(yàn)添加5種不同的無(wú)機(jī)鹽所得到的發(fā)酵培養(yǎng)液測(cè)定的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉時(shí)，抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達(dá)到（13.40±0.25）mm（表4）。

表4 拮抗菌株B-6發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化Tab.4 Optimization of fermentation medium formulation of antagonistic strain B-6 mm

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 拮抗菌株B-6發(fā)酵培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化結(jié)果 在確定拮抗菌株B-6合適的發(fā)酵培養(yǎng)液各組分種類的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。從表5可以看出，3個(gè)因素的極差（R）值存在差異，各因素對(duì)拮抗菌株B-6生長(zhǎng)量的影響大小通過(guò)R值反映，R值越大則表明該因素對(duì)菌株的影響效果越大，反之則越小。

表5 拮抗菌株B-6發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.5 Orthogonal test results and range analysis of the optimal combination of fermentation medium of antagonistic strain B-6

由表5可知，RC＞RA＞RB，即無(wú)機(jī)鹽＞碳源＞氮源，無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株的拮抗活性抑菌效果影響最大，其次依次為碳源和氮源，A 3B2C2組合所產(chǎn)生的抑菌圈直徑為16.5 mm，與采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所得發(fā)酵液對(duì)峙產(chǎn)生的抑菌圈直徑13.8 mm相比，發(fā)酵優(yōu)化后抑菌圈直徑增加了19.6%，差異較明顯。方差分析和顯著性檢驗(yàn)如表6所示，碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的P值均大于0.05，表明3種因素差異均不顯著，但從表5可以看出，這3種發(fā)酵配方因素變化對(duì)拮抗菌株B-6拮抗活性物質(zhì)的生物量影響差異從大到小依次為無(wú)機(jī)鹽＞碳源＞氮源，即無(wú)機(jī)鹽變化對(duì)其影響較大，氮源變化對(duì)其影響較小。經(jīng)綜合極差分析和方差分析結(jié)果，最終確定拮抗菌株B-6最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A 3B2C2，即麥芽糖3%（30 g）、蛋白胨1.0%（10 g）、氯化鈉1.0%（10 g），蒸餾水1 000 mL。

表6 拮抗菌株B-6發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合的方差分析Tab.6 Analysis of variance of the optimal combination of fermentation medium of antagonistic str ain B-6

2.7.2 拮抗菌株B-6發(fā)酵條件正交優(yōu)化結(jié)果 拮抗菌株B-6最佳發(fā)酵條件正交試驗(yàn)及結(jié)果分析如表7所示，4個(gè)因素極差有差異，對(duì)于拮抗菌株B-6產(chǎn)生拮抗物質(zhì)生物量大小的影響通過(guò)R值大小反映，R值越大，則表明該因素對(duì)菌株的影響效果越大，反之則越小。由表7可知，RD＞RG＞RE＞RF，即發(fā)酵條件對(duì)拮抗菌株B-6拮抗活性的影響依次為發(fā)酵時(shí)間＞pH＞裝液量＞接種量，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間對(duì)拮抗菌株B-6的拮抗活性物質(zhì)的生物量影響最大，其次依次為p H、裝液量及接種量。通過(guò)方差分析和顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（表8），發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量及p H的P值均大于0.05，表明4種因素差異均不顯著。但從表7可以看出，影響拮抗菌株B-6產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)數(shù)量的4種發(fā)酵條件因素其差異大小依次為pH＞裝液量＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量，即pH值變化對(duì)其影響較大，接種量變化對(duì)其影響較小。經(jīng)綜合極差分析和方差分析結(jié)果，最終確定拮抗菌株B-6的最佳發(fā)酵條件組合為D1E3F1G3，即發(fā)酵時(shí)間24 h、裝液量100 mL（規(guī)格為250 mL錐形瓶）、接種量1.0%（1 mL），p H值8。

表7 拮抗菌株B-6發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.7 Orthogonal test results and range analysis of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

表8 拮抗菌株B-6發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.8 Variance analysis of orthogonal test results of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

續(xù)表7 拮抗菌株B-6發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Tab.7（Continued） Orthogonal test results and range analysis of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

3 結(jié)論與討論

生物防治是控制番茄青枯病有效的途徑，主要是利用分離篩選到的拮抗菌株對(duì)其進(jìn)行防控。目前，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者從植株根際土壤中分離篩選具有拮抗作用的生防細(xì)菌。畢凱麗等[25]從土壤中篩選對(duì)水稻胡麻斑病病原菌（Helminthospotium oryzaeBreda de Hann）具有穩(wěn)定拮抗作用的細(xì)菌。王麗麗等[6]從番茄青枯病重病田塊的健康植株根際土壤中分離篩選得到2株高效拮抗菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定均為芽胞桿菌屬。鄭雪芳等[1]采用抑菌圈法從不同地理來(lái)源的植物根際土壤中篩選出24個(gè)對(duì)青枯雷爾氏菌具有拮抗作用的芽孢桿菌。

本研究利用稀釋涂布分離篩選到1株對(duì)番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）抑菌效果最好的拮抗菌株B-6，經(jīng)過(guò)鑒定確定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），并對(duì)其發(fā)酵液配方及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，使其發(fā)酵液抑菌效果最強(qiáng)。結(jié)果表明，健康植株的根際土壤中含有拮抗菌株，可以用來(lái)防治植物病原菌，有望成為生物防治病害又一主力軍。但篩選出的拮抗菌株如何在大田土壤中能有效定殖且發(fā)揮高效穩(wěn)定的防治效果，有待進(jìn)一步研究。

利用拮抗菌株進(jìn)行生物防治過(guò)程中，如何使其產(chǎn)生較多抗菌物質(zhì)及提高抑菌效果對(duì)防治植物病害十分重要。拮抗菌株發(fā)酵液除了受到發(fā)酵培養(yǎng)基各組分影響外，還會(huì)受到培養(yǎng)條件的制約，通過(guò)對(duì)發(fā)酵液配方及發(fā)酵條件的優(yōu)化，拮抗菌株抑菌物質(zhì)數(shù)量顯著提高，從而充分發(fā)揮其抑菌作用[26-27]。目前對(duì)生防菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，一般采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)的方法[28]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，具有高效和快速的特點(diǎn)。菌體發(fā)酵是一個(gè)較復(fù)雜過(guò)程，受到很多因素的影響。本試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基各組分及最佳發(fā)酵條件，拮抗菌株B-6最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糖3%（30 g）、蛋白胨1.0%（10 g）、氯化鈉1.0%（10 g），蒸餾水1 000 mL，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間24 h、裝液量100 mL（規(guī)格為250 mL錐形瓶）、接種量1.0%（1 mL），p H值為8。拮抗菌株發(fā)酵條件優(yōu)化以對(duì)峙抑菌圈大小作為衡量指標(biāo)，前人已有許多的報(bào)道[29-32]。楊曉楠等[13]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了黃瓜菌核病拮抗菌株T 111的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件，優(yōu)化后其抑菌效果增加了69.4%；劉曉琳等[17]通過(guò)采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)方法篩選出對(duì)棗果黑斑病有抑菌效果的拮抗菌xj063-1菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件；侯敏等[29]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)研究了培養(yǎng)基各組分對(duì)拮抗細(xì)菌S13產(chǎn)生芽孢的影響。

本研究?jī)H是在恒溫?fù)u床條件下對(duì)拮抗菌株B-6發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后拮抗菌株B-6生物菌劑的研發(fā)和研究進(jìn)展提供了一定的理論依據(jù)，但沒(méi)有將其投入到盆栽及大田防效試驗(yàn)中檢測(cè)其防治效果。由于發(fā)酵是一個(gè)較復(fù)雜的過(guò)程，試驗(yàn)中仍存在許多不足之處，需進(jìn)一步的調(diào)整與完善，為了使其能夠產(chǎn)業(yè)化，還需進(jìn)一步對(duì)其代謝過(guò)程進(jìn)行研究。目前，該菌株已保存在中國(guó)微生物菌種保藏中心，編號(hào)為CGMCC No.24048，正在申報(bào)國(guó)家發(fā)明專利，已被國(guó)家專利局受理。