基于高基元SSR構(gòu)建黍子DNA分子身份證

丁藝冰，丁雨格，陳 凌，王海崗，陳喜明，王瑞云，，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 玉米研究所，山西 忻州 034099；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031）

在植物學(xué)分類(lèi)中，黍（Panicum miliaceumL.）屬于禾本科黍?qū)俚膯巫尤~植物、1年生草本植物，亦稱(chēng)糜子，是起源于我國(guó)最古老的農(nóng)作物之一，具有生育期短、耐旱、耐貧瘠等特點(diǎn)，是抗災(zāi)備荒、復(fù)種增收、調(diào)節(jié)農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的先鋒作物[1]。黍子抗逆、抗旱，且對(duì)環(huán)境、耕地要求不高，適應(yīng)性廣，是旱作地區(qū)最主要的糧食生產(chǎn)種類(lèi)之一[2]，比其他作物更容易在高原高海拔或者其他不良環(huán)境中生存下來(lái)，常常作為比較穩(wěn)產(chǎn)的糧食作物，在干旱地區(qū)種植也常常因其作物特點(diǎn)作為其他作物失敗或者種植延遲時(shí)的補(bǔ)救作物，避免造成糧食短缺對(duì)其進(jìn)行深入研究，對(duì)于我國(guó)干旱地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要的價(jià)值[3-7]。

黍子脫殼后為黃米，可釀酒、制糕、煮粥，黃米含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，富含人體稀缺的維生素B族、銅、鋅、錳等，有調(diào)理脾胃、明目安神、益陰利肺、預(yù)防糖尿病和心血管病的功效[8]。黍子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值均有很高的水平，黍子所含的蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、灰粉等主要營(yíng)養(yǎng)成分含量比大米高[9]，維生素B1、B2以及β-胡蘿卜素略高于大米，富含錳、鎂、鈉、鈣、銅、鐵、鋅等微量元素；蛋白質(zhì)以清蛋白、谷蛋白、球蛋白為主，氨基酸含量豐富，超出玉米、小麥、水稻的氨基酸含量[10]。黍子粳性品種的各個(gè)生長(zhǎng)階段的直鏈淀粉積累量均高于糯性品種，對(duì)開(kāi)發(fā)黍子食品具有重要意義[11]。從黃土高原的峽谷溝壑到內(nèi)蒙古高原的丘陵山地，均有黍子種植，其擁有非常發(fā)達(dá)的根系，能從深層的土壤中吸收水分，莖稈葉片上的絨毛和蠟質(zhì)層能減少自身水分的蒸發(fā)，這樣能充分利用有限的水熱資源，躲過(guò)旱季，在很短時(shí)間內(nèi)完成一生并獲得一定的產(chǎn)量[12]。相關(guān)研究表明，我國(guó)栽培黍的伴生雜草種群會(huì)導(dǎo)致馴化黍的種群變異，且佐證了野生以及馴化的黍子種群結(jié)構(gòu)模式存在至少有2個(gè)獨(dú)立馴化區(qū)的假設(shè)[13]。關(guān)于黍子的起源地，相關(guān)研究表明[14]，我國(guó)的華北夏糜子區(qū)、黃土高原春夏糜子區(qū)、東北春糜子區(qū)的糜子遺傳相關(guān)性較大，遺傳關(guān)系也較為復(fù)雜，這為闡明我國(guó)是黍子作物的起源中心提供了有力證據(jù)。

隨著各種分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，育種家加強(qiáng)了對(duì)新品種的保護(hù)意識(shí)，促進(jìn)了作物DNA指紋圖譜研究的發(fā)展，但早期的指紋圖譜大都是基于少數(shù)品種和有限標(biāo)記識(shí)別位點(diǎn)，其應(yīng)用的廣度非常有限，而且指紋圖譜鑒定在于對(duì)比圖片中的眾多差異，不易快速區(qū)分不同品種。近幾年，分子身份證的概念應(yīng)運(yùn)而生，其與指紋圖譜的功能相同，但分子身份證原則上是以廣泛基因組覆蓋度的最少共顯性特異變異位點(diǎn)或標(biāo)記為基礎(chǔ)，提取每份種質(zhì)有代表性、穩(wěn)定和特異的遺傳信息，并通過(guò)數(shù)字化處理和軟件分析建立分辨不同種質(zhì)的字符串形式，以達(dá)到簡(jiǎn)單明了區(qū)分品種間差異、在廣度上更直觀地進(jìn)行品種檢索的目的，并能更有效利用。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeat，SSR）分子標(biāo)記技術(shù)，是一種基于DNA長(zhǎng)度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)，具有豐富的多態(tài)性，且重復(fù)性?xún)?yōu)良，被廣泛應(yīng)用于對(duì)群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的分析和遺傳圖譜的構(gòu)建[15]。其在基因定位[16]、檢測(cè)種子純度[17]、品種鑒定[18]、研究親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[19]等方面已有廣泛的應(yīng)用。

近年來(lái)，SSR分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，為我國(guó)的現(xiàn)代分子技術(shù)作出了巨大貢獻(xiàn)。許多不同品種農(nóng)作物的真實(shí)性和純度也通過(guò)SSR分子標(biāo)記得到 鑒 定，例 如 大 麥（Hordeum vulgareL.）[20]、甘 蔗（Saccharum officinarum）[21]、南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）[22]、芥菜（Brassica juncea）[23]、亞麻（Linum usitatissimumL.）[24]、李 子（Prunus salicina）[25]、棉 花（Gossypium hirsutum）[26]等。何 杰 麗 等[27]用80個(gè)SSR評(píng)估144份種質(zhì)，基于聚類(lèi)分析（UPGMA）將資源劃分為3個(gè)。現(xiàn)有的黍子DNA分子水平的研究不夠成熟，且部分研究供試種質(zhì)材料范圍及數(shù)量均較小，該問(wèn)題更明顯；而對(duì)于黍子這樣一個(gè)種質(zhì)數(shù)量大、體系繁雜的類(lèi)群來(lái)說(shuō)，基于黍子SSR構(gòu)建DNA的分子身份證構(gòu)建研究尚未見(jiàn)報(bào)道[28-29]。

當(dāng)前，由于世界經(jīng)濟(jì)全球化的發(fā)展，人民生活水平不斷提高，國(guó)與國(guó)之間的交流日漸頻繁，綜合國(guó)力的競(jìng)爭(zhēng)越來(lái)越激烈，糧食生產(chǎn)已成為提高一個(gè)國(guó)家綜合國(guó)力的重要環(huán)節(jié)，提高糧食作物生產(chǎn)產(chǎn)量也是提高國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的途徑之一。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，農(nóng)作物新品種也在日益發(fā)展，農(nóng)作物新品種的必備特征是特異性、一致性和穩(wěn)定性，誕生過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)某些形態(tài)特征相似、血緣關(guān)系相近、適應(yīng)環(huán)境能力相同的情況，一般的鑒定性狀指標(biāo)大多是存在連續(xù)變異、易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀，很難做出明確描述。

艾呈祥等[30]利用10對(duì)SSR引物對(duì)38份甜櫻桃種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，將分子指紋賦值后構(gòu)建了其分子身份證。高運(yùn)來(lái)等[31]利用9對(duì)SSR引物構(gòu)建了83份黑龍江部分大豆品種的分子身份證。地方品種、農(nóng)家種、育成品種和野生資源中異物同名和同物異名現(xiàn)象大量存在，嚴(yán)重影響著資源的高效利用。關(guān)于作物品種的認(rèn)定工作既繁瑣而且花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，市場(chǎng)流通的品種魚(yú)龍混雜，農(nóng)家品種流通不夠或者是無(wú)法發(fā)揮品種的最大價(jià)值，造成種質(zhì)資源嚴(yán)重浪費(fèi)，創(chuàng)建準(zhǔn)確可靠而且操作便捷的資源鑒定系統(tǒng)勢(shì)在必行，需為黍子品種制定一份專(zhuān)屬的DNA分子身份證，以便更好地開(kāi)發(fā)和利用黍子種質(zhì)資源。

本研究選取華北平原、黃土高原、東北平原等不同地理區(qū)域的20份黍子材料，利用30對(duì)高基元SSR引物構(gòu)建20份資源的分子身份證，旨在為黍子資源的高效系統(tǒng)管理和合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為來(lái)自于華北平原、黃土高原、東北平原等不同地理區(qū)域的20份黍子（表1），選取各份材料的適量種子在適宜的人工條件下播種，待各份材料的幼苗長(zhǎng)至三葉期時(shí)，取葉片約0.3 g，液氮保存至-80℃冰箱備用。

表1 20份黍子試驗(yàn)材料明細(xì)Tab.1 The detail of 20 accessions of Panicum miliaceum in this exper iment

1.2 黍子基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增

剪取三葉期黍子葉片，采用改良CTAB法[32]提取基因組DNA。DNA的完整性及濃度檢測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[27]進(jìn)行。利用35對(duì)高基元引物[33]（表2）對(duì)來(lái)自我國(guó)不同地理區(qū)劃的20份黍子材料進(jìn)行擴(kuò)增，選取擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、多態(tài)性高、條帶完整清晰的引物構(gòu)建黍子DNA身份證。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表3所示。輕彈混勻，瞬時(shí)離心收集管壁上的液滴至管底，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃4 min；94℃40 s，不同Tm（表2）退火40 s，72℃1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃8 min[34]。反應(yīng)完成后，取3μL產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

表2 SSR引物及退火溫度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

表3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Tab.3 Reaction system of PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

取出染色好的凝膠，將其平鋪在LED燈膠片觀片臺(tái)上讀取凝膠電泳結(jié)果，在凝膠同一位置，有擴(kuò)增條帶的記為1，無(wú)擴(kuò)增條帶的記為0；而后通過(guò)軟件Pop Gen 1.32（Yeh and Boyle，1997）、MEGA 5.0（Tamura et al.,2011）、PowerMarker 3.25（Liu and Muse，2005）計(jì)算SSR遺傳多樣性參數(shù)。品種分子身份證由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的資源特征分析軟件ID Analysis 4.0建立。對(duì)應(yīng)字符串通過(guò)在線條形碼生成（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php），生成可掃描的條形碼用作DNA分子身份證；黍子材料的基本信息和DNA分子身份證代碼等相關(guān)文字信息通過(guò)二維碼在線技術(shù)（http://cli.im）生成二維碼DNA分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

選取的材料是來(lái)自于華北平原、黃土高原、東北平原等不同地理區(qū)域的20份黍子材料，用35對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30對(duì)引物（RYW1、RYW2、RYW3、RYW4、RYW5、RYW6、RYW7、RYW8、RYW9、RYW10、RYW11、RYW12、RYW13、RYW14、RYW15、RYW16、RYW17、RYW18、RYW19、RYW20、RYW21、RYW22、RYW23、RYW24、RYW25、RYW27、RYW29、RYW33、RYW34、RYW35）可擴(kuò)增出條帶清晰、穩(wěn)定多態(tài)性較高的引物，其可作為候選核心引物用于分子身份證的構(gòu)建。其中，RYW5引物對(duì)20份黍子材料的聚丙烯凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

2.2 引物多態(tài)性及遺傳參數(shù)分析

用30對(duì)SSR引物對(duì)20份黍子資源實(shí)行擴(kuò)增，得到表4中10對(duì)引物用于構(gòu)建分子身份證。

表4 10對(duì)SSR引物的遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 Genetic parameters of 10 pairs of SSR markers

由表4可知，20份材料在30個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出30個(gè)觀測(cè)等位變異，每一個(gè)位點(diǎn)都檢測(cè)到3個(gè)等位基因（平均3個(gè)）；有效等位變異為2.168 2（RYW7）～2.985 1（RYW35）個(gè)，平均為2.636 7個(gè)；Shannon多樣性指數(shù)為0.899 7（RYW7）～1.096 1（RYW35）,平均為1.020 6；觀測(cè)雜合度為0.473 7（RYW7）～0.833 3（RYW3），平均為0.677 7；期望觀測(cè)雜合度為0.553 3（RYW7）～0.677 1（RYW1），平均為0.635 0；Nei's基因多樣性指數(shù)為0.538 8（RYW7）～0.665 0（RYW35），平均為0.617 3；多態(tài)性信息含量為0.526 2（RYW3）～0.749 3（RYW1），平均為0.657 9；根據(jù)BOTSTEIN[35]提出的理論，10對(duì)引物都具備高度多態(tài)性（＞0.5），可用于分子身份證的構(gòu)建，其余20對(duì)引物多態(tài)性較低，不可用于分子身份證的構(gòu)建。

2.3 黍子種質(zhì)的分子ID構(gòu)建

將全部黍子的供試材料利用5對(duì)引物（RYW8、RYW12、RYW5、RYW2、RYW1）組合構(gòu)建字符串DNA分子身份證，結(jié)果如表5所示。例如供試材料1的分子身份證為01111，代表該引物次序下的供試材料1在引物RYW8擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后同一凝膠位置中表現(xiàn)為無(wú)條帶、而引物RYW12、RYW5、RYW2、RYW1的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為有條帶，即為供試黍子材料1的DNA分子身份證。以此類(lèi)推，可得到20份供試黍子材料的DNA分子字符串。

表5 20份黍子資源的分子身份證編碼Tab.5 Code of molecular ID of 20 Panicum miliaceum resources

將試驗(yàn)獲得的各黍子供試材料字符串DNA分子身份證在在線條形碼生成器中輸入，獲得DNA分子身份證的條形碼（圖2）；將各黍子供試材料的基本信息如名稱(chēng)、統(tǒng)一編號(hào)、生態(tài)區(qū)、來(lái)源、字符串DNA身份證號(hào)、備注等在在線二維碼生成器中輸入，得到DNA分子身份證二維碼（圖3）。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，對(duì)黍子的遺傳多樣性分子標(biāo)記非常有限，尤其是多態(tài)性高、檢測(cè)能力強(qiáng)的SSR標(biāo)記更少[36]。利用SSR分子標(biāo)記，可從分子水平上探究物種遺傳的多樣性，加上群體遺傳特點(diǎn)，可探討品種內(nèi)及其近緣種屬之間的起源、變異及進(jìn)化[11]。構(gòu)建的核心種質(zhì)資源被要求用最少的數(shù)目來(lái)最大范圍地包含供試植物資源的遺傳多樣性。查閱已有研究文獻(xiàn)，得到黍子基因多樣性指數(shù)分別為0.859 9[27]、0.628 4[27]、0.841 5[37]、0.768 6[38]、0.736 0[39]、0.847 8[40]，多態(tài)性信息含量分別為0.457 3[27]、0.587 4[41]、0.427 9[37]、0.566 7[38]、0.471 4[39]、0.554 4[40]；而本試驗(yàn)檢測(cè)到這2個(gè)指標(biāo)分別為1.020 6和0.657 9，均高于已有研究結(jié)果，可能與研究材料及樣本數(shù)量差異有關(guān)。在2017年，王瑞云等[27]用85個(gè)高基元SSR檢測(cè)到96份黍子資源的基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量分別為0.770 8和0.472 3，均低于本研究，這可能與本研究的20份供試材料有關(guān)。

目前，SSR標(biāo)記的檢測(cè)方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光毛細(xì)管電泳法2種。楊文娟等[42]用這2種方法檢測(cè)芝麻應(yīng)用核心種質(zhì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于多態(tài)性條帶較少、條帶間分子量差異大和擴(kuò)增帶型清晰的標(biāo)記，聚丙烯酰胺凝膠電泳法和熒光毛細(xì)管電泳法的電泳結(jié)果基本一致。聚丙烯酰胺凝膠電泳法無(wú)需昂貴的試驗(yàn)器材，試劑費(fèi)用低；而熒光引物僅能保存1～2 a（常規(guī)引物則為3～5 a），且熒光毛細(xì)管電泳法的合成成本遠(yuǎn)高于聚丙烯酰胺凝膠電泳法。限于經(jīng)濟(jì)條件，加之試驗(yàn)材料數(shù)量少，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法構(gòu)建黍子的DNA分子身份證可行。

DNA分子身份證是基于DNA指紋圖譜，運(yùn)用多種編碼數(shù)字化處理電泳圖譜獲得字符串，并輔以條形碼/二維碼等科學(xué)表述，在資源鑒定方面應(yīng)用廣泛[43-44]。用SSR構(gòu)建資源分子身份證有3種編碼方法：第1種為0/1代碼類(lèi)型，根據(jù)電泳條帶有無(wú)賦值1/0形成0/1字符串；第2種為等位基因賦值編碼類(lèi)型，編碼擴(kuò)增等位基因；第3種為基因型賦值編碼類(lèi)型，編碼擴(kuò)增帶型[45]。本研究采用第1種方法編碼，統(tǒng)計(jì)方便、書(shū)寫(xiě)簡(jiǎn)潔，字符串長(zhǎng)度適中，易于檢索。

以往研究多使用低基元SSR構(gòu)建作物資源的分子身份證。顏靜宛等[40]利用24對(duì)SSR引物對(duì)121份水稻常規(guī)品種和16個(gè)雜交水稻品種進(jìn)行了多態(tài)性信息含量分析，其平均為0.520 0；李紅琴等[46]用212對(duì)SSR引物辨別了66份小麥供試材料，多態(tài)性信息含量平均為0.510 0。而本試驗(yàn)對(duì)20份來(lái)源于華北平原、黃土高原、東北平原的黍子材料用30對(duì)高基元SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，多態(tài)性信息含量為0.657 9，高于已有低基元SSR引物研究結(jié)果。隨著新品種研發(fā)的不斷深入和新種質(zhì)資源的認(rèn)定完成，以往的作物數(shù)據(jù)庫(kù)存在一定的局限性，之后應(yīng)不斷完善、擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫(kù)的規(guī)模及增加核心引物構(gòu)建的組合數(shù)量；同時(shí)，分子身份證的構(gòu)建不僅需要包含其遺傳學(xué)信息，還需要包含該作物的社會(huì)屬性，只有這樣才能準(zhǔn)確描述一個(gè)品種，為作物品種的研究與鑒定提供參考依據(jù)，實(shí)現(xiàn)資源管理的科學(xué)化和規(guī)范化。