隋珠草莓莖尖的組培快繁技術(shù)

梁 崢，霍慧敏，賈民隆，曹冬梅

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太原 030031）

草莓（Fragaria×ananassa）屬薔薇科草莓屬多 年生草本，原產(chǎn)南美洲，由于其漿果營養(yǎng)豐富、口味鮮美，在現(xiàn)代果品生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[1]。我國的草莓種植面積已經(jīng)居世界第1位[2]，但種苗質(zhì)量不高，主要是帶毒現(xiàn)象嚴(yán)重[3-4]。生產(chǎn)上草莓的繁殖主要通過匍匐莖進(jìn)行無性繁殖，而無性繁殖容易使病毒積聚，嚴(yán)重影響草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量[5]。利用草莓莖尖進(jìn)行組培快繁培養(yǎng)，可在較短時(shí)間內(nèi)提供整齊、優(yōu)良的種苗，這對保持種苗的一致性狀和穩(wěn)定產(chǎn)量有重要的作用[6]。同時(shí)，快繁材料也可以作為離體再生研究和種質(zhì)資源保存的手段，這對進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)化研究和草莓新品種選育等具有重要意義。

最早對草莓進(jìn)行離體培養(yǎng)研究的是日本的下村于1960年的文獻(xiàn)[7]。國外對不同草莓基因型葉片離體培養(yǎng)研究較多，NEHRA等[8]以葉片為外植體進(jìn)行草莓的離體再生，BARCELó等[9]研究了植物生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)條件對葉盤外植體形態(tài)發(fā)生的影響。20世紀(jì)80年代以來，草莓工廠化育苗逐漸走進(jìn)人們的視野，國內(nèi)也出現(xiàn)了在各種草莓品種上進(jìn)行組培快繁的研究[10-11]，以葉柄、葉片、花藥等作為外植體均有報(bào)道[12-14]。近年來，病毒病造成的草莓減產(chǎn)每年可達(dá)30%～80%[15]。于是利用莖尖作為外植體，結(jié)合脫毒技術(shù)對草莓進(jìn)行種苗快繁成為研究熱點(diǎn)。劉健[16]報(bào)道，日本學(xué)者以包含1枚葉原基的莖尖材料獲得了無病毒草莓苗；艾勇等[17]以小于0.5 mm的草莓莖尖培養(yǎng)脫毒苗，其脫毒率達(dá)80%。

隋珠是當(dāng)前市場上主要的草莓品種之一，但針對此品種的組培快繁研究目前還未見報(bào)道。本研究以隋珠草莓的莖尖材料為外植體，對脫毒體系所需的組培過程進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化探索，以期為工廠化生產(chǎn)隋珠草莓脫毒苗提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為隋珠草莓帶頂芽的匍匐莖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 選取隋珠草莓未展開頂芽的幼嫩匍匐莖，剪下頂部2 cm左右莖段作為外植體材料；將外植體材料帶回實(shí)驗(yàn)室，置于燒杯中，加入5%NaClO溶液浸泡0～10 min，加入少許洗潔精流水沖洗30 min。進(jìn)入超凈工作臺，將外植體置入75%乙醇中振蕩2 min，無菌水沖洗1次，再置入含有或不含有0.05%吐溫的0.1%HgCl2溶液中，消毒5～12 min，無菌水沖洗3次。將消毒后的頂芽置于無菌紙上，用鑷子撕去外層葉片，切取0.3 cm左右的頂芽莖尖，置入MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照12 h/d，30 d后觀察記錄污染和褐化情況，統(tǒng)計(jì)消毒效率并進(jìn)行方差分析。

1.2.2 初培培養(yǎng)基的篩選 將新采集的外植體按照1.2.1中的最優(yōu)方法進(jìn)行消毒后，取頂芽0.3～0.5 cm的莖尖繼續(xù)進(jìn)行初培培養(yǎng)。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入0.1～0.5 mg/L 6-BA和0～0.1 mg/L NAA的不同激素組合，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，每天光照12 h，30 d后觀察莖尖材料的生長狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，并對統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

1.2.3 不定芽的增殖培養(yǎng) 取1.2.2中優(yōu)化的初培條件下培養(yǎng)的、生長狀態(tài)基本一致的不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)。分別以MS、1/2 MS和改良1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入0.5～1.0 mg/L 6-BA和0.1～0.2 mg/L IBA的不同激素組合（其中，改良1/2 MS培養(yǎng)基使用490 mg/L Ca（NO3）2替 代CaCl2，其 余 成 分 不變），培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照12 h/d，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖效率并對統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，篩選出最適培養(yǎng)基條件。將另一組完成初培的不定芽材料接種至前述增殖率最高的培養(yǎng)基條件上，于不同光質(zhì)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，溫度（25±2）℃，光照12 h/d，30 d后觀察不定芽生長狀況，統(tǒng)計(jì)增殖效率。

1.2.4 生根培養(yǎng) 取1.2.3中優(yōu)化的不定芽增殖培養(yǎng)條件、生長狀況健康一致的幼苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。分別以MS、1/2 MS和改良1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入0～0.5 mg/L IBA和0～0.5 mg/L NAA不同激素組合（其中，改良1/2 MS培養(yǎng)基使用490 mg/L Ca（NO3）2替代CaCl2，其余成分不變），培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照12 h/d，30 d后觀察根系生長情況，統(tǒng)計(jì)生根率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒方法對隋珠消毒效率的影響

由表1、2可知，所試范圍內(nèi)0.1%的HgCl2處理時(shí)間是影響外植體污染率、褐化率最主要的因素，隨處理時(shí)間增加污染率顯著降低，而褐化率顯著增大，成活率差異不顯著；處理2條件下污染率最高，褐化率最低；處理11條件下，污染率最低，而褐化率最高，可能是由消毒不徹底和消毒過度所致。0.1%HgCl2處理時(shí)間相同的情況下，有5%NaClO、0.05%吐溫處理可進(jìn)一步降低外植體污染率。綜合來看，5%NaClO 10 min+流水沖洗30 min+75%酒精2 min+含有0.05%吐溫的0.1%HgCl2處理5～8 min是對隋珠草莓外植體消毒處理的最佳組合，該組合下成活率可達(dá)87.0%。

表1 外植體消毒方法對隋珠消毒效率的影響Tab.1 Effect of explant disinfection methods on disinfection efficiency of Suizhu

表2 外植體消毒方法的方差分析Tab.2 Variance analysis of explant disinfection methods

2.2 初培培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

從表3可以看出，所試驗(yàn)組合的不定芽誘導(dǎo)率隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在0.2 mg/L時(shí)達(dá)到同組最高值；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度增加到0.5 mg/L時(shí)，不定芽誘導(dǎo)速度變慢，部分材料出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；而在培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L的NAA后不定芽的誘導(dǎo)效率會降低，同時(shí)出現(xiàn)少量的愈傷組織。

表3 不同激素組合對不定芽誘導(dǎo)效率的影響Tab.3 Effects of different hormone combinations on adventitious bud induction efficiency

所試驗(yàn)組合中，MS+0.2 mg/L 6-BA為最適初培培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基下不定芽誘導(dǎo)率達(dá)96.3%。方差分析結(jié)果表明（表4），所試驗(yàn)范圍內(nèi)，6-BA和NAA對不定芽誘導(dǎo)率的影響差異不顯著（P＞0.05）。

表4 初培培養(yǎng)條件的方差分析Tab.4 Variance analysis of initial culture conditions

2.3 不定芽的增殖培養(yǎng)結(jié)果

為探究Cl元素對草莓組培苗的影響，使用改良1/2 MS培 養(yǎng) 基（490 mg/L Ca（NO3）2替 代CaCl2）。不同培養(yǎng)條件對不定芽增殖效率的影響及培養(yǎng)條件方差分析結(jié)果列于表5、6。

表5 不同培養(yǎng)條件對不定芽增殖效率的影響Tab.5 Effects of different culture conditions on adventitious bud proliferation efficiency

表6 不定芽增殖培養(yǎng)條件的方差分析Tab.6 Variance analysis of culture conditions of adventitious bud proliferation

由表5、6可知，所試驗(yàn)結(jié)果范圍內(nèi)大量元素和6-BA質(zhì)量濃度對增殖系數(shù)的影響顯著，其中1/2 MS培養(yǎng)基組合增殖系數(shù)明顯高于MS組合，但改良與非改良1/2 MS處理組無明顯差異，6-BA質(zhì)量濃度0.5 mg/L優(yōu)于1.0 mg/L；IBA質(zhì)量濃度對增殖系數(shù)影響不顯著，但0.1 mg/L總體優(yōu)于0.2 mg/L。整體可見，1/2 MS或改良1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA為誘導(dǎo)不定芽增殖的最適培養(yǎng)條件，該條件下增殖系數(shù)可達(dá)5.1。

從表7可以看出，不同光質(zhì)培養(yǎng)條件對隋珠不定芽的生長狀態(tài)產(chǎn)生明顯影響，藍(lán)光條件下不定芽增殖系數(shù)較紅光條件下更高，但二者均小于混合光照條件下的增殖系數(shù)；所試驗(yàn)的3種混合光照條件對增殖系數(shù)的影響大小順序?yàn)榧t∶藍(lán)=1∶1＞白＞紅∶藍(lán)=7∶1，最高增殖系數(shù)達(dá)5.2。不定芽平均株高隨培養(yǎng)光質(zhì)中紅光比例增加而增大，葉柄形態(tài)隨藍(lán)光比例增加而趨于粗壯和縮短，葉柄顏色隨藍(lán)光比例增加而趨于紅色，葉片平均直徑隨藍(lán)光比例增加而增大，葉片顏色隨藍(lán)光比例增加而趨于深綠，葉片形態(tài)隨藍(lán)光比例增加從略卷曲變?yōu)槠秸梗▓D1）。綜上所述，最佳不定芽增殖培養(yǎng)條件為紅∶藍(lán)光源為1∶1+改良1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，該條件下增殖系數(shù)可達(dá)5.2。

表7 不同光質(zhì)對不定芽增殖的影響Tab.7 Effects of different light quality on adventitious bud proliferation

2.4 生根培養(yǎng)結(jié)果

由表8可知，培養(yǎng)基大量元素的濃度和不同生長素的選用對生根率有明顯的影響，其中，大量元素濃度對生根率影響顯著（P＜0.05），降低MS大量元素的濃度至1/2 MS可顯著提高生根率，但1/2 MS與改良1/2 MS這2種處理對生根率的影響差異不顯著。與NAA相比，IBA處理組合的生根率更高，質(zhì)量更好，可以觀察到更多更長的不定根，且以1/2 MS和改良1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生根率顯著高于MS（P＜0.05）；NAA處理組合生根率較低，同時(shí)在材料接觸培養(yǎng)基位置均出現(xiàn)明顯的愈傷組織，但1/2 MS和改良1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生根率顯著高于MS（P＜0.05）。所試驗(yàn)組合中，最適生根培養(yǎng)條件為1/2 MS+0.5 mg/L IBA，該條件下生根率可達(dá)97.4%，但與改良1/2 MS+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)條件間差異不顯著。

表8 不同培養(yǎng)基對不定根誘導(dǎo)效率的影響Tab.8 The effect of different mediums on adventitious root induction efficiency

3 結(jié)論與討論

幼嫩的外植體材料在消毒過程中往往面臨較大的挑戰(zhàn)[18]，NaClO等溫和消毒劑即使在較長的處理時(shí)間下也難以得到較高的消毒效率，而使用HgCl2處理則容易使材料迅速褐化，失去再生活力。莖尖材料本身是無菌材料[19]，但在進(jìn)入超凈工作臺進(jìn)行剖離前，匍匐莖頂芽的處理依然要按照幼嫩外植體消毒的方法進(jìn)行操作，以免在莖尖截取操作中帶入病菌。僅使用0.1%HgCl2溶液作為消毒劑時(shí)，外植體材料越幼嫩越需要精確控制處理時(shí)間，才能平衡消毒效率和褐化率之間的矛盾[20]，達(dá)到最高無菌苗成活率。而實(shí)際操作中，由于外植體材料的幼嫩程度始終存在一定差異，故很難把握最佳處理時(shí)間。本研究采用在流水沖洗前先用5%NaClO溶液浸泡10 min，再轉(zhuǎn)入一般HgCl2消毒步驟的方式對外植體進(jìn)行雙重消毒，可以在控制褐化程度的前提下，有效降低污染率，從而解決實(shí)際操作中不易控制HgCl2消毒時(shí)間的問題。隋珠草莓匍匐莖頂芽被新生的嫩葉所包裹，葉背毛刺狀的結(jié)構(gòu)在水面張力作用下容易積聚氣泡阻礙消毒溶液對材料表面的滲透，吐溫作為表面活性劑提高了消毒劑與外植體的接觸面積，從而提高了消毒效率。

據(jù)報(bào)道，紅顏、白雪公主、丹莓1號等品種草莓的不定芽增殖培養(yǎng)中多數(shù)使用MS培養(yǎng)基[11,21-22]，而本研究中，1/2 MS在隋珠不定芽增殖培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出更高的不定芽增殖系數(shù)，隋珠草莓可能更加適應(yīng)較低濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)條件。NAA在初培和生根試驗(yàn)中均顯示出對隋珠草莓愈傷組織誘導(dǎo)的能力，這在其他品種草莓組培研究中鮮有報(bào)道。生產(chǎn)中有草莓忌氯的說法，一些果農(nóng)會避開含氯肥料對草莓進(jìn)行培育，在文獻(xiàn)報(bào)道中也偶有提及[23]，但均沒有相關(guān)數(shù)據(jù)支撐。本研究在增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段引入了改良1/2 MS培養(yǎng)基，以Ca（NO3）2替代CaCl2，發(fā)現(xiàn)所試驗(yàn)結(jié)果范圍內(nèi)改良與非改良1/2 MS處理組間無明顯差異，說明是否含氯培養(yǎng)對草莓苗期并無明顯影響。

本研究表明，光質(zhì)對草莓組培苗形態(tài)的影響非常顯著，以白熾燈為對照，相同光強(qiáng)條件下紅色光源比例增高更有利于組培苗高度的增加，這與錢舒婷[24]在使用不同補(bǔ)光燈處理設(shè)施草莓質(zhì)量研究中的結(jié)果相似，說明紅色光源對隋珠草莓的營養(yǎng)生長可能具有促進(jìn)作用；藍(lán)光比例的增加對于葉柄、葉片組織的增粗加厚有促進(jìn)作用，這與劉慶等[25]采用LED光源對草莓品質(zhì)的研究結(jié)果相似，可能是由于藍(lán)色光源促進(jìn)了蛋白質(zhì)的積累，藍(lán)光比例的增加還有利于色素的積累。使用藍(lán)色光源處理組培苗20 d左右就可以明顯觀察到葉片綠色的顯著加深、葉柄基部色素積累，藍(lán)色光源對葉綠素、花青素等物質(zhì)的積累可能具有明顯的促進(jìn)作用[26-27]。本研究只討論了紅藍(lán)光源對組培苗不定芽的影響，但可以推測光質(zhì)對隋珠草莓果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量亦可產(chǎn)生明顯影響，開展工廠化生產(chǎn)過程中還需進(jìn)一步研究代謝和果實(shí)品質(zhì)。

本研究通過對隋珠草莓的莖尖進(jìn)行組培快繁培養(yǎng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用5%NaClO 10 min+流水沖洗30 min+75%酒精2 min+含有0.05%吐溫的0.1%HgCl2處理5～8 min的消毒方法，外植體成活率達(dá)到最高，為87.0%；MS+0.2 mg/L 6-BA為最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)效率最高，達(dá)96.3%；改良1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA為最佳不定芽增殖培養(yǎng)基，置于紅藍(lán)光源1∶1下培養(yǎng)時(shí)不定芽增殖系數(shù)最高，可達(dá)5.2；1/2 MS+0.5 mg/L IBA為最佳生根培養(yǎng)基，生根率可達(dá)97.4%。研究結(jié)果為隋珠的工廠化快繁提供了理論參考。