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    蒙藥制劑額日敦·烏日勒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

    2022-05-16 10:10:02楊雪苗徐楠冰鄔國(guó)棟薄彧坤
    關(guān)鍵詞:烏日甘草酸梔子

    楊雪苗,陳 希,徐楠冰,鄔國(guó)棟,薄彧坤,楊 丹,安 明

    (內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040)

    額日敦·烏日勒為蒙藥復(fù)方制劑,別名珍寶丸,該處方由甘草、木香、梔子、訶子、川楝子、苘麻子、丁香、沉香等三十味名貴藥材組成,該制劑已獲得內(nèi)藥制字 M14020112 的批準(zhǔn)文號(hào)。額日敦·烏日勒具有清熱安神、舒筋活絡(luò)的功效。主要用于治療白脈病、半身不遂、風(fēng)濕、類風(fēng)濕、布病、肌筋萎縮、神經(jīng)麻痹、腎脈損傷、瘟疫熱病、久熱不愈等疾病。額日敦·烏日勒現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》1984版,但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀和檢查項(xiàng),不能保證該藥品的質(zhì)量,擬增加薄層鑒別項(xiàng)和含量測(cè)定項(xiàng)以保證該制劑的質(zhì)量。

    該處方中甘草為君藥,具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效[1-2]。臨床主要用于治療脾胃虛弱、中氣不足、咳嗽哮喘、緩和藥物烈性、解藥物毒性。木香屬于理氣藥,具有行氣止痛、健脾消食的功效。臨床上主要用于胸脅、脘腹脹滿、瀉痢后重、不思飲食。梔子為清熱瀉火藥,具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效,其活性成分梔子苷[3]具有緩瀉、鎮(zhèn)痛、利膽、抗炎等作用。因此,額日敦·烏日勒發(fā)揮主要藥理作用與處方中甘草、木香、梔子間相互作用密切相關(guān)。

    為進(jìn)一步控制該藥品質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜(Thin Layer chromatography, TLC)法對(duì)處方中的甘草、梔子、木香進(jìn)行定性鑒別,采用高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC-UV)法對(duì)甘草中主要成分甘草苷、甘草酸[4]進(jìn)行含量測(cè)定,并通過(guò)方法學(xué)考察,為完善蒙藥制劑額日敦·烏日勒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1儀器 Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、BSA224S-CW 萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、SQP 型十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、超純水儀 (美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)、AS10200 超聲波清洗機(jī)(40/60 Hz)(北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司)、TDZ5-WS 多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

    1.2試藥 樣品(批號(hào)2009091、2009092、2009093):本制劑由包頭市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院提供。梔子苷對(duì)照品(110749-201919)、木香烴內(nèi)酯(111524-201710)、去氫木香烴內(nèi)酯(111525-201711)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。甘草苷對(duì)照品(AF21020853)、甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào)AF21020859)、梔子對(duì)照藥材(AF20102601)、甘草對(duì)照藥材(AF20110113)均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司。乙腈為色譜純,甲醇為色譜純和分析純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

    1.3方法

    1.3.1薄層鑒別

    1.3.1.1梔子薄層鑒別 取額日敦·烏日勒丸4.6 g,加入50 %甲醇10 mL,超聲處理40 min,濾過(guò),取濾液作為供試品溶液。依照處方比例稱取缺梔子的陰性樣品,同供試品溶液制法相同,即得陰性樣品溶液。取梔子藥材1.0 g和梔子對(duì)照藥材1.0 g,同供試品溶液制法相同,即得梔子藥材和梔子對(duì)照藥材溶液。取一定量梔子苷對(duì)照品, 加乙醇制成每1 mL含有4 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則 0502)試驗(yàn),吸取上述溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi)、取出、晾干,再噴以10 %的硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

    1.3.1.2木香薄層鑒別 取額日敦·烏日勒丸3.5 g,加甲醇15 mL,超聲處理30 min,濾過(guò),取濾液作為供試品溶液。依照處方比例稱取缺木香的陰性樣品,同供試品溶液制法相同,即得陰性樣品溶液。取木香對(duì)照藥材0.5 g,同供試品溶液制法相同,即得木香對(duì)照藥材溶液。分別取一定量去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品,加甲醇分別制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則 0502)試驗(yàn),吸取上述溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠 G 薄層板上,以環(huán)己烷 - 甲酸乙酯 - 甲酸(15∶ 15∶ 1)的上層溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以1 %香草醛硫酸溶液,加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

    1.3.1.3甘草薄層鑒別 取額日敦·烏日勒丸6.9 g,加乙醚40 mL,加熱回流1小時(shí),濾過(guò),棄去醚液,藥渣加甲醇30 mL,加熱回流1 h,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,用正丁醇提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗滌3次,棄去水液,正丁醇液蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,作為供試品溶液。依照處方比例稱取缺甘草的陰性樣品,同供試品溶液制法相同,即得陰性樣品溶液。取甘草藥材1 g、甘草對(duì)照藥材1 g,同法制成藥材溶液、對(duì)照藥材溶液。取甘草酸銨對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(通則 0502)試驗(yàn),吸取上述溶液各1~2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶ 1∶ 1∶2)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以10 %硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置熒光燈(256 nm)下檢視。

    1.3.2含量測(cè)定

    1.3.2.1色譜條件 選用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱:依利特SinoChrom ODS-BP色譜柱,以乙腈為流動(dòng)相A,以0.1 %磷酸溶液為流動(dòng)相B,按照表1色譜條件進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.8 mL/min,柱溫為 25 ℃,進(jìn)樣體積為 10 μL ,在237 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)。理論塔板數(shù)按甘草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

    表1 梯度洗脫條件

    1.3.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取甘草苷對(duì)照品2 mg, 置10 mL容量瓶中,加70 %乙醇溶解并稀釋至刻度,再精密吸取1 mL至10 mL 容量瓶中,用70 %乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得。稱取甘草酸銨對(duì)照品2 mg,置10 mL 容量瓶中,加70 %乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

    1.3.2.3供試品溶液的制備 稱取蒙藥額日敦·烏日勒丸適量,置于研缽研細(xì),取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.39 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70 %乙醇20 mL ,密塞,稱定重量,超聲處理30 min,冷卻,再稱定重量,用70 % 乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    1.3.2.4陰性溶液的制備 按照蒙藥額日敦·烏日勒處方比例稱取除甘草以外的其它藥材,充分研細(xì)混勻,參照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制成(缺甘草)的陰性對(duì)照溶液。

    2 結(jié)果

    2.1薄層鑒別

    2.1.1梔子薄層鑒別 在薄層色譜中,供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

    圖1 蒙藥額日敦·烏日勒中梔子的TLC圖譜

    2.1.2木香薄層鑒別 在薄層色譜中,供試品溶液與對(duì)照藥材溶液色譜、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

    圖2 蒙藥額日敦·烏日勒中木香的TLC圖譜

    2.1.3甘草薄層鑒別 在薄層色譜中,供試品溶液與對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

    圖3 蒙藥額日敦·烏日勒中甘草的TLC圖譜

    2.2含量測(cè)定

    2.2.1提取效率考察 取額日敦·烏日勒丸適量,置于研缽研細(xì),取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)1.39 g,精密稱定3份,超聲時(shí)間分別設(shè)置為20、30、40 min,按“2.2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,根據(jù)色譜圖結(jié)果用外標(biāo)法計(jì)算出甘草苷、甘草酸的含量。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。

    表2 各組分提取時(shí)間考察

    2.2.2專屬性考察 精密吸取額日敦·烏日勒供試品、甘草苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品、額日敦·烏日勒陰性對(duì)照溶液適量,按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣檢測(cè)。甘草苷、甘草酸的色譜峰分離效果良好,并且陰性對(duì)照沒(méi)有干擾。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4~6。

    圖4 蒙藥額日敦·烏日勒供試品溶液色譜圖

    圖5 甘草苷對(duì)照品色譜圖(A)、甘草酸對(duì)照品色譜圖(B)

    2.2.3線性關(guān)系的考察 取濃度為8.7 μg/mL甘草苷溶液0.435 mL,濃度為44.32 μg/mL甘草酸溶液2.216 mL,將上述溶液放置10 mL容量瓶,用70 %乙醇溶解,即得到儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量,加70 %甲醇稀釋制成系列濃度的對(duì)照品溶液,參照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以色譜峰面積A為橫坐標(biāo),質(zhì)量濃度C為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)曲線。結(jié)果表明甘草苷在濃度為0.00348~0.01218 mg/mL的范圍內(nèi),呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。甘草酸在濃度0.017723~0.06205 mg/mL的范圍內(nèi),呈現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 各組分線性回歸方程

    2.2.4精密度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL,連續(xù)進(jìn)樣6針,測(cè)得甘草苷峰面積值RSD %為0.36 %,甘草酸峰面積值RSD %為0.55 %,表明儀器精密度良好。

    2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(2009091)樣品,按“2.2.3”項(xiàng)方法平行配制供試品溶液6份, 按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,記錄色譜圖峰面積,用外標(biāo)法計(jì)算甘草苷、甘草酸含量并計(jì)算 RSD 值,RSD<4.0 %,在規(guī)定范圍內(nèi),表明該試驗(yàn)方法的重復(fù)性好。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 4和表 5。

    表4 甘草苷重復(fù)性試驗(yàn)

    表5 甘草酸重復(fù)性試驗(yàn)

    2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定樣品粉末1.4 g,以“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,室溫放置,分別在0、4、8、12、24 h按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6,表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定,且RSD<4.0 %,該方法可行。

    表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.7加樣回收試驗(yàn) 取同一批號(hào)(2009091)樣品,精密稱定 9 份,每份 0.69 g,分為3組,每組分別加入供試品含量的 50 %、100 %、150 %的對(duì)照品溶液,按“2.2.3” 項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,記錄甘草苷、甘草酸的色譜峰面積,并按外標(biāo)法計(jì)算甘草苷、甘草酸含量、平均回收率,平均回收率在規(guī)定范圍內(nèi)(85 %~110 %),且RSD<4.0 %。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7,表明該方法準(zhǔn)確度好。

    2.2.8耐用性的考察 換不同廠家、不同型號(hào)色譜柱,取供試品約1.39 g,精密稱定,按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣,按外標(biāo)法計(jì)算甘草苷、甘草酸含量,RSD<4.0 %。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

    2.2.9樣品含量測(cè)定 取三個(gè)批號(hào)的樣品(2009091、2009092、2009093)及實(shí)驗(yàn)室自制模擬樣品一份,4個(gè)樣品各取 3 份,按照“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別精密量取各溶液 10 μL,注入高效液相色譜儀,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定, 記錄甘草苷、甘草酸的色譜峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算樣品中甘草苷、甘草酸的含量,并求RSD值,各項(xiàng)下RSD<4.0 %。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

    表7 各組分加樣回收實(shí)驗(yàn)

    表8 耐用性考察

    表9 含量測(cè)定

    3 討論

    3.1薄層板的選擇 在甘草TLC鑒別中,分別考察了硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板、硅膠H薄層板對(duì)甘草酸的分離能力,結(jié)果表明硅膠GF254板中甘草酸斑點(diǎn)顯示清晰,分離度良好,陰性溶液無(wú)干擾。因此在甘草TLC中選擇硅膠GF254薄層板對(duì)甘草酸進(jìn)行定性鑒別。

    3.2流動(dòng)相的選取 流動(dòng)相的選擇參照《中國(guó)藥典》2020年版一部卷柏中甘草苷、甘草酸含量測(cè)定,結(jié)合文獻(xiàn),以乙腈- 0.05 %磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫(0~8 min,19 %乙腈;8~35 min, 19 %~50 %乙腈;35~36 min, 50 %~100 % 乙腈;36~40 min,100 %~19 %乙腈),在此條件下甘草苷、甘草酸分離效果不理想。鑒于以上,本研究增加磷酸水溶液的濃度并改變流動(dòng)相的梯度,以乙腈-0.1 %磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫(0~6 min, 19 %乙腈;6~12 min,19 %~25 %乙腈;12~16 min,25 %~27 %乙腈;16~20 min,27 %~36 %乙腈;20~33 min,36 %~47 % 乙腈;33~36 min,47 %~19 %乙腈),結(jié)果表明在此條件下蒙藥制劑額日敦·烏日勒中甘草的主要成分甘草苷、甘草酸保持良好的峰形,各峰分離度良好,該方法專屬性強(qiáng),準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好,因此,最終使用乙腈- 0.1 % 磷酸水溶液作為本研究的流動(dòng)相[5]。

    3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取“2.2.3”項(xiàng)下的溶液,在200~500 nm下通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器做全波長(zhǎng)掃描,甘草苷、甘草酸分別在198 nm、256 nm處有最大吸收。查閱文獻(xiàn)并參考《中國(guó)藥典》2020版卷柏中甘草苷、甘草酸的含量測(cè)定,在237 nm下考察甘草苷、甘草酸的吸收情況,結(jié)果顯示各峰均有吸收并保持良好的峰型,故最終選擇 237 nm 作為本研究的檢測(cè)波長(zhǎng)。

    3.4流速的選擇 參照2020 年版《中國(guó)藥典》,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),考察了不同流速對(duì)甘草苷、甘草酸的分離效果。本研究分別考察了流速為0.6、0.8、1.0 mL/min時(shí)各峰的出峰情況,結(jié)果表明甘草苷、甘草酸在流速為0.8 mL/min時(shí),基線穩(wěn)定,各峰峰形、分離度良好,因此選擇流速為0.8 mL/min時(shí)對(duì)甘草苷、甘草酸進(jìn)行定量分析。

    綜上所述,本研究建立了蒙藥制劑額日敦·烏日勒中甘草、梔子、木香TLC定性鑒別的方法,該方法重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)。采用HPLC法建立了蒙藥制劑額日敦·烏日勒中甘草的主要藥效成分甘草苷、甘草酸含量測(cè)定方法,該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。因此,本研究成功地將蒙藥制劑額日敦·烏日勒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善,該方法可用于蒙藥制劑敦·烏日勒的質(zhì)量控制[6]。

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