鄔國棟,任燕霞,張 東
(1.包頭醫(yī)學院藥學院,內蒙古 包頭 014060;2.包頭醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院)
沙棘(Hippophae rhamnoides L.) 為胡頹子科酸刺屬的落葉灌木或小喬木,又名沙棗、酸柳果、酸柳、其察日嘎察(蒙名)、達普(藏名)、吉漢(維吾爾名),主要分布在我國的華北、西北、東北及西南地區(qū)[1-2]。沙棘具有相當高的藥用價值,是古代藏藥和蒙藥常用藥材?!吨袊幍洹?2020版1部)記載,沙棘具有健脾消食,止咳祛痰,活血化瘀的作用[3]。藥理學研究表明,沙棘具有保護肝臟、抗高血壓、抗癌、抗?jié)?、促進傷口愈合、抗菌、抗氧化、保護心臟和免疫調節(jié)等作用[4-7]。 沙棘中的主要活性成分是黃酮類,其主要成分有異鼠李素、山奈酚和槲皮素等[8]。
肝臟是代謝藥物的主要器官,而肝臟代謝藥物的主要酶是細胞色素P450酶系(CYP450),它有很多同工酶,如CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6等。近年來,CYP450在植物藥代謝方面逐漸受到人們的關注。CYP450同工酶的活性容易受到外來物質的誘導或抑制,進而會影響其他藥物的代謝而發(fā)生藥物之間的相互作用[9]。這種相互作用的結果之一就是導致不良反應的發(fā)生甚至毒性反應的產生。所以研究植物藥對CYP450酶活性的影響很有必要。人體內CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6和大鼠體內的CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2和CYP2b1分別具有高度同源性[10]。本課題采用實時熒光定量PCR方法研究沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2和CYP2b1酶 mRNA表達的影響,進而判斷沙棘黃酮對人體CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP2B6酶的活性是否具有抑制或誘導作用,為沙棘以及沙棘黃酮的臨床合理聯(lián)合應用提供參考依據(jù)。
1.1儀器、藥品和試劑 Nano Drop 2000分光光度計、5020PCR儀、Pacific T-Ⅱ型超純水儀、Micro 2/R 高速低溫離心機(美國 ThermoFisher Scientific 公司);BT125D 十萬分之一電子天平( 賽多利斯科學儀器北京有限公司)。
沙棘總黃酮(大連美侖生物技術有限公司研制,批號:20181104)。總RNA極速抽提試劑盒kit-RNAfast200(上海飛捷生物技術有限公司,批號:220011);第一鏈cDNA Synthesis Kit試劑盒以及2X Realtime PCR Master Mix(第二代)試劑盒(南京博爾迪生物科技有限公司,批號:20191103);DEPC(Sigma公司,批號:p0031);引物(南京金瑞斯生物科技有限公司)。
1.2實驗動物 Wistar雄性大鼠(體質量200~220 g),購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)2016-0002。動物飼養(yǎng)于明暗交替(12 h∶12 h)的清潔級動物飼養(yǎng)室中,環(huán)境溫度24~26 ℃,相對濕度50 %,自由進食飲水。動物實驗遵循包頭醫(yī)學院動物倫理委員會規(guī)定。
1.3給藥方案 40只雄性大鼠按照隨機化原則分為空白對照組,陽性對照組,沙棘黃酮高劑量組、中劑量組和低劑量組。各給藥組分別灌胃400、200和100 mg/kg的沙棘黃酮提取物,空白對照組灌胃等容量蒸餾水,連續(xù)14 d;陽性對照組從第8天開始腹腔注射苯巴比妥鈉50 mg/kg,連續(xù)7 d。末次給藥后禁食不禁水12 h,脫臼處死大鼠,腹主動脈取血檢測大鼠血清生化指標,取肝臟置于無RNA酶的凍存管中,液氮速凍后于-70 ℃冰箱凍存。
1.4肝功能指標的測定 大鼠腹主動脈取血5 mL,以3 000 r/min離心10 min,分離血清,按照試劑盒說明書測定谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、總蛋白(Total protein, TP)、球蛋白(Globulin, GLB)、白蛋白(Albumin, ALB)和直接膽紅素(Direct bilirubin, DBIL)各項指標。取肝臟稱重,計算肝重/體重比(Liver weight/body weight,L/W)。
1.5肝臟 CYP450 mRNA 表達水平的測定 總RNA提取 取冷凍肝組織約50 mg加生理鹽水勻漿,然后按照kit-RNAfast200極速抽提試劑盒說明提取總RNA。各總RNA樣本 A260/A280比值為 1.8~2.0。
cDNA 合成 取適量總RNA(使其終濃度為500 ng·μL-1),分別加入 1μL random hexamer primer、4μL 5×RT Buffer、1μL RT Enzyme Mix、1μL dNTPs和RNase free dd H2O至終體積 20 μL。逆轉錄條件為:25 ℃(10 min),50 ℃(45 min),85 ℃(5 min)。得到的cDNA產物用于 PCR 反應或于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
RT-PCR 測定mRNA表達水平 取1 μL cDNA產物,分別加入12.5 μL 2X Realtime PCR Master Mix、10uM的上下游引物各0.5 μL,加Nuclease-Free Water to至25 μL。PCR反應條件為:95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1min,45個循環(huán)。測定樣本CT值后,采用 2-ΔΔCT法計算各組CYP450 酶基因表達相對于空白對照組的倍數(shù)變化。大鼠 CYP2c11、CYP2e1、CYP2d2、CYP2b1和β-actin(內參)引物序列見表1。
表1 實時熒光定量引物序列
2.1沙棘黃酮對大鼠肝功能的影響 與空白對照組相比,沙棘黃酮各給藥組對ALT、AST、TP、GLB、ALB和L/W沒有影響(P>0.05),但是中劑量組和低劑量組可以顯著降低DBIL(P<0.05)。提示沙棘黃酮對大鼠肝功能沒有影響,不會造成肝損傷,DBIL的降低沒有太大意義。見表2。
表2 大鼠肝功能各項指標
2.2沙棘黃酮對CYP450各同工酶mRNA表達的影響 與空白對照組相比,高劑量組CYP2d2 mRNA表達上調了3.2倍(P<0.01),而CYP2c11、CYP2e1和CYP2b1 mRNA表達沒有顯著性變化(P>0.05)(圖1)。
圖1 沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP450酶mRNA表達的影響
3.1沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2b1、CYP2c11和CYP2e1 mRNA表達的影響 CYP2B6、CYP2C9和CYP2E1是人體肝臟中非常重要的代謝藥物的CYP450酶系同工酶。CYP2B6占人體肝臟中CYP450含量的2 %~10 %,并且可能參與了市場上近25 %的藥物的代謝,例如麻醉藥,抗癌藥,抗逆轉錄病毒依非韋倫和某些促癌物等[11-13]。CYP2C9可能參與了16%的臨床藥物的代謝,如非甾體抗炎藥,AT1受體阻滯劑,抗驚厥藥等[14-16]。CYP2E1在酒精、有機溶劑、毒素、致癌物和致癌物代謝中起重要作用[17-18]。本實驗結果表明,沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2b1、CYP2c11和CYP2e1 mRNA表達沒有影響,說明沙棘黃酮對CYP2B6、CYP2C9和CYP2E1的活性沒有影響。即沙棘黃酮可以安全地與通過CYP2E1、CYP2B6和CYP2C9代謝的藥物聯(lián)合使用,它們之間不會發(fā)生草藥-藥物之間的相互作用。
3.2沙棘黃酮對大鼠肝臟CYP2d2 mRNA表達的影響 CYP2D6也是肝臟中非常重要的CYP450同工酶之一。CYP2D6可以代謝約20 %的目前已知的臨床治療藥物[19],如β受體阻滯劑(丁呋洛爾、卡維地洛、甲氧普羅爾)、抗抑郁藥(阿米替林、帕羅西汀、地昔帕明、氟伏沙明、文拉法辛)抗心律不齊藥物(普羅帕酮、美西律、氟利卡胺)、抗精神病藥(阿立哌唑、利培酮)、抗癌藥(他莫昔芬、吉非替尼、司巴汀)和阿片類鎮(zhèn)痛藥(可待因、曲馬多、曲馬多)等[20-21]。本實驗結果表明,TFH可以上調CYP2d2 mRNA的表達,也就是說,TFH可以誘導CYP2D6的活性,提示沙棘黃酮與CYP2D6的底物之間存在代謝層面的相互作用。當沙棘黃酮與經CYP2D6代謝的藥物一起使用時,這些藥物的代謝可能會加快,導致藥理效應下降,所以在聯(lián)合用藥時需要調整這些藥物的給藥方案。如果這些藥物的代謝產物是有毒的,則聯(lián)合使用也會引起嚴重的不良反應。
3.3沙棘黃酮對大鼠肝功能的影響 從表2結果可知,沙棘黃酮對大鼠肝臟的ALT、AST、TP、ALB、GLB和L/W沒有影響,但可以降低DBIL的水平,說明沙棘黃酮對大鼠肝功能沒有影響,不會引起肝損傷。至于 DBIL降低沒有意義。
綜上所述,沙棘黃酮可以上調大鼠CYP2d2 mRNA的表達,而對CYP2b1、CYP2e1和CYP2c11 mRNA的表達沒有影響,這提示沙棘黃酮可能會誘導人CYP2D6酶的活性。當沙棘或沙棘黃酮與經CYP2D6代謝的藥物合用時,可能發(fā)生草藥-藥物相互作用。因此,在臨床實踐中應給予足夠的重視。