桿菌肽在動物可食性組織和禽蛋中殘留的HPLC-MS/MS檢測方法

高嫣珺，聶 貞，聶 雅，王 震，卜仕金

(揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

桿菌肽是一種由芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的多肽類抗生素，對腸道內(nèi)多數(shù)革蘭氏陽性菌有較強的抗菌作用，對部分革蘭氏陰性菌、放線菌、螺旋體亦有抑制作用[1]。桿菌肽特殊的抗菌譜與其無殘留、不產(chǎn)生耐藥性和無毒副作用等優(yōu)良特性，使其廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖、獸醫(yī)和人醫(yī)臨床等多個領(lǐng)域[2]。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，桿菌肽主要作為飼料添加劑用于促進動物生長和提高飼料利用率[3-7]，同時也用于防治壞死性腸炎等腸道疾病、提高氮元素利用率以減少動物糞便對環(huán)境的污染等[8]。2013年，亞甲基水楊酸桿菌肽在我國獲得農(nóng)業(yè)部藥物添加劑批準文號；2019年，亞甲基水楊酸桿菌肽可溶性粉制劑列入第三批獸用處方藥目錄[9]，隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，高效、安全的桿菌肽產(chǎn)品具有越來越廣闊的應(yīng)用前景。但動物性食品生產(chǎn)過程中仍存在獸藥過度使用或濫用現(xiàn)象，獸藥殘留經(jīng)食物鏈進入人體后易導(dǎo)致蓄積毒性、耐藥性等一系列連鎖危害，同時食品基質(zhì)的復(fù)雜性和獸藥殘留的痕量存在性使得食品中獸藥殘留的準確定量檢測存在一定困難[10]。本研究建立的動物可食性組織和禽蛋中桿菌肽殘留的HPLC-MS/MS檢測方法滿足動物可食性組織中桿菌肽殘留限量的檢測要求，為動物性食品中桿菌肽的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支撐，對保障我國動物源性食品安全、促進動物性食品進出口貿(mào)易具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 儀器：AB SCIEX Qtrap 6500plus三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；AB SCIEX ExionLCTMAC高效液相色譜儀；XBridge?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)；QUINTIX124-1CN電子天平；Eppendorf Centrifuge 5810 R臺式高速冷凍離心機；Eppendorf可調(diào)微量移液器(10 μL、100 μL、1000 μL、5000 μL)；Nylon 0.22 μm有機相針式濾器；Agilent Bond Elut Plexa PCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱；WATERS OASIS?MCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱。

試劑：桿菌肽標準品(桿菌肽A、B1、B2和B3總含量84.8%，桿菌肽A含量53.2%。規(guī)格：100 mg；批號：C10418000；購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；甲酸、濃氨水(色譜純，上海阿拉丁公司)；乙酸乙酯、正己烷(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；三氯乙酸(分析純，上海MACKLIN公司)；水為符合GB/T 6682標準的超純水。

1.2 標準工作液配置 準確稱取約7.37 mg桿菌肽標準品粉末于25 mL的容量瓶中，加入適量的0.1%甲酸甲醇溶解并定容至刻度，即配置濃度為0.25 mg/mL(以桿菌肽計)的標準儲備液，于-20 ℃冰箱中保存。準確量取適量標準儲備液，用0.1%甲酸甲醇稀釋制備濃度為1000、10000 ng/mL的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 動物可食性組織包括豬、雞和鴨的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織，空白動物可食性組織以潔凈手術(shù)剪適當(dāng)剪碎，用勻漿機攪碎；禽蛋包括雞蛋和鴨蛋，去除蛋殼，取全部蛋清和蛋黃，用勻漿機攪勻。稱取(2.0 ±0.01)g勻漿后空白動物可食性組織和禽蛋樣品于50 mL離心管A中，加入4.0 mL 4%三氯乙酸乙腈溶液，渦旋2 min，加入4.0 mL 0.1%甲酸水溶液渦旋提取5 min，隨后12000 r/min離心6 min(4 ℃)，轉(zhuǎn)移上清液至于50 mL離心管B中。殘渣按前述步驟重復(fù)提取一次，合并上清于離心管B中備用。離心管B中加入經(jīng)0.1%甲酸水溶液飽和的正己烷3.0 mL，渦旋混合1 min，隨后8000 r/min離心5 min，棄去上層有機相及中間乳化層，保留下層溶液待凈化。

動物可食性組織使用Agilent Bond Elut Plexa PCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱凈化，禽蛋使用OASIS?MCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱凈化。依次用3.0 mL甲醇和3.0 mL 0.1%甲酸水溶液活化固相萃取柱，取前述步驟處理得到的樣品液過柱，隨后依次用3.0 mL 1%甲酸乙酸乙酯和3.0 mL甲醇淋洗，淋洗完畢后抽干萃取柱，用3.0 mL 0.5%氨水甲醇溶液洗脫，收集全部洗脫液于10 mL具塞離心管中，離心管中加入1.0 mL 0.1%甲酸水溶液，渦旋混勻后經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜過濾，濾液收集至1.5 mL進樣瓶中，待檢測。

1.3.2 液相色譜條件優(yōu)化 XBridge?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；液相色譜梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 電噴霧離子源(Turbo ion Spray)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；氣簾氣壓力：40.0 psi；碰撞氣壓力：Medium；電離電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃。根據(jù)桿菌肽離子掃描結(jié)果，相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 桿菌肽質(zhì)譜參數(shù)

1.4 定性方法 通過待測物色譜圖的保留時間與對照品保留時間、待測物色譜峰特征離子與相應(yīng)濃度對照品色譜峰的特征離子相對照進行定性。

定性測試需要滿足以下條件：①與受試藥物相同的離子峰在空白樣品圖譜中不出現(xiàn)；②定性離子色譜峰的信噪比≥3；③待測樣品與標準液中目標峰的保留時間偏差不超出±2.5%；④樣品中特征離子對的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉藴室旱南鄬ωS度一致，偏差滿足2002/657/EC[11]中的要求。

1.5 定量方法

1.5.1 基質(zhì)標準曲線的繪制 分別稱取各動物的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織及禽蛋的空白樣品，經(jīng)前處理后得到空白基質(zhì)液并加入適量的標準工作液配制濃度為50、100、250、500、750、1000 ng/g的基質(zhì)匹配標準溶液，在本試驗建立的色譜和質(zhì)譜條件下，按照濃度從低到高的順序依次進樣檢測。以測得的桿菌肽特征離子峰面積為縱坐標，對應(yīng)的標準溶液濃度為橫坐標，擬合標準曲線。

1.5.2 檢測限和定量限的確定 分別稱取各動物的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織及禽蛋的空白樣品，經(jīng)前處理得到空白基質(zhì)液并加入適量標準工作液制備不同濃度的空白基質(zhì)添加樣品，每個濃度5個平行，在本試驗建立的色譜和質(zhì)譜條件下依次進樣檢測，取信噪比(S/N)≥3時的桿菌肽添加濃度為方法的檢測限(LOD)，信噪比(S/N)≥10時的桿菌肽添加濃度為方法的定量限(LOQ)。

1.5.3 準確度和精密度的測定 本方法以組織添加樣品的回收率考察準確度，回收率的批內(nèi)變異系數(shù)考察精密度，批間變異系數(shù)考察重復(fù)性，選定添加濃度50、100、500和750 ng/g作為添加回收試驗的四個濃度。分別準確稱取(2.0±0.01)g各動物的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織及禽蛋的空白樣品，加入適量的標準工作液。按1.3項下的條件處理、分析。測定結(jié)果代入各組織的基質(zhì)標準曲線，樣品實測值與標準曲線中對應(yīng)濃度峰面積比值，記為本方法的回收率。每批次每個濃度制備5個平行樣品，共測定三個分析批次分三天完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜行為 在本試驗的優(yōu)化的質(zhì)譜和色譜條件下，桿菌肽出峰時間約為3.19 min，目標峰與基質(zhì)雜質(zhì)峰分離良好，桿菌肽目標峰峰型尖銳，可用于定量分析(圖1)。

圖1 桿菌肽標準品總離子流色譜圖(桿菌肽50 ng/g)

對比各動物可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)及禽蛋(雞蛋、鴨蛋)空白基質(zhì)圖譜與空白基質(zhì)添加桿菌肽標準品圖譜，顯示桿菌肽標準品與空白基質(zhì)雜質(zhì)分離良好且互不干擾，可用于定量分析。掃描空白基質(zhì)與空白基質(zhì)添加藥物(50 ng/g)樣品中桿菌肽定量離子對(712.2>199.0)的離子流圖見圖2～圖9。

圖2 添加桿菌肽的豬可食性組織總離子流色譜圖

圖3 空白豬可食性組織總離子流色譜圖

圖4 添加桿菌肽的雞可食性組織總離子流色譜圖

圖5 空白雞可食性組織總離子流色譜圖

圖6 添加桿菌肽的鴨可食性組織總離子流色譜圖

圖7 空白鴨可食性組織總離子流色譜圖

圖8 添加桿菌肽的禽蛋組織總離子流色譜圖

圖9 空白禽蛋組織總離子流色譜圖

2.2 基質(zhì)匹配標準曲線 桿菌肽在空白基質(zhì)中添加50～1000 ng/g范圍內(nèi)，添加濃度和目標峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r>0.999(表3)。

表3 各動物組織和禽蛋中的桿菌肽含量的標準曲線方程

2.3 檢測限和定量限 取S/N≥3時濃度為檢測限，本方法檢測限為30 ng/g；根據(jù)精密度和準確度試驗結(jié)果，取S/N≥10時濃度為定量限，本方法定量限為50 ng/g。

2.4 準確度和精密度 制備各動物組織和禽蛋在50、100、500、750 ng/g四個添加濃度下的組織添加樣品，進行添加回收試驗，批內(nèi)、批間平均回收率及變異系數(shù)結(jié)果見表4、表5，桿菌肽在各組織中的平均回收率為66.2%～84.7%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。

表4 豬可食性組織中桿菌肽添加回收率及變異系數(shù)(n=5)

表5 雞、鴨可食性組織及禽蛋中桿菌肽添加回收率及變異系數(shù)(n=5)

2.5 定性試驗 定性試驗結(jié)果顯示，本試驗中各動物可食性組織和禽蛋中內(nèi)源性雜質(zhì)不影響目標物質(zhì)的定量。在本試驗建立的色譜條件下，目標峰分離良好且峰型尖銳，利于定量分析，基質(zhì)添加樣品中桿菌肽相對離子豐度符合定性測試要求。

3 討 論

3.1 前處理方法的優(yōu)化 試驗比較了多種沉淀蛋白的方法，結(jié)果顯示，使用甲醇沉淀蛋白后提取液澄清，但易堵塞萃取柱；使用乙腈沉淀蛋白，個別組織提取液不澄清，難以除去懸浮殘渣；使用4%～10%不同濃度的三氯乙酸乙腈溶液，在4%和10%濃度下，動物組織樣品和禽蛋樣品可以獲得澄清的提取液，且不會堵塞萃取柱。故本試驗選定4%和10%三氯乙酸乙腈作為蛋白沉淀劑。同時比較了先提取后沉淀蛋白和先沉淀蛋白后提取兩種不同順序，結(jié)果顯示，先提取后沉淀蛋白，色譜圖中會出較大干擾峰，干擾定量測定。沉淀蛋白后的提取液使用0.5%三氟乙酸水溶液進一步提取樣品，并且兩次重復(fù)提取以確保樣品中的桿菌肽提取完全。

試驗比較了多種固相萃取柱的凈化效果，參考全家興[12]的報道選用HLB萃取柱凈化樣品，并使用含TFA的提取液以增加目標物保留度，結(jié)果顯示HLB萃取柱對樣品凈化能力較強，但加樣回收率不穩(wěn)定。已知桿菌肽在酸性溶液中溶解度更好，故嘗試用于堿性物質(zhì)分析的混合型陽離子交換柱，洗脫液為5%氨水∶甲醇(V/V∶10/90)的偏堿性溶液。分別以甲醇/乙腈作為蛋白沉淀劑，0.1%甲酸水/0.5%三氟乙酸水為提取液，對HLB和MCX的柱保留效果進行比較，對比結(jié)果中除HLB萃取柱在用乙腈沉蛋白時柱回收率較低外，其他結(jié)果基本處在同一水平，并且MCX萃取柱在以上幾種條件下結(jié)果均保持穩(wěn)定。PCX與MCX屬于同類型的陽離子交換柱，但PCX過柱流速更快，且柱回收良好，可縮短樣品處理時間。使用酸性水溶液取代純水對陽離子交換柱進行活化，可以提高對目標物的保留度，MCX萃取柱由70.27%提升為85.86%，PCX萃取柱由84.2%提升為104.31%。但禽蛋樣品使用PCX萃取柱回收率較低，嘗試更換不同萃取柱進行試驗，結(jié)果顯示MCX萃取柱可得到更好的結(jié)果。由于上述結(jié)果中使用含離子對試劑(TFA)提取液與甲酸水溶液提取的結(jié)果差異不顯著，故選用0.1%甲酸水作為提取液，以簡化試驗中使用的試劑。使用經(jīng)提取液飽和的正己烷除脂，防止樣品提取液與正己烷互溶。參照萃取柱說明書上的凈化程序，選用中性淋洗液(甲醇)和酸性淋洗液(1%甲酸乙酸乙酯)除去雜質(zhì)。

3.2 液相色譜條件的優(yōu)化 本試驗選用XBridge?BEH C18130A色譜柱，亞乙基橋雜化(BEH)顆粒技術(shù)對堿性化合物有很好的保留，且pH耐受范圍大，是肽類化合物專用色譜柱。流動相為乙腈-0.1%甲酸水體系，該體系下桿菌肽峰型良好，利于定量分析。為進一步提高檢測效率，適當(dāng)縮短梯度洗脫時間，縮短后的洗脫程序為乙腈：0～0.5 min 15%，5.0～5.5 min 85%，5.6～6.5 min 15%，桿菌肽出峰時間約為3.19 min，峰型良好，與大部分雜質(zhì)可以分離，可用于定量分析。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 桿菌肽在質(zhì)譜掃描中一般為加氫離子，并且可觀察到三種電荷態(tài)，其中荷2個質(zhì)子的桿菌肽豐度最高[13]，結(jié)合實際離子掃描結(jié)果選取了[M+2H]2+作為質(zhì)譜掃描中的母離子。最初選取712.2(桿菌肽A)和704.8(桿菌肽B)作為母離子進行離子掃描，進一步轟擊母離子產(chǎn)生子離子后，選取712.2>199.0、712.2>226.9和704.8>199.0、704.8>227.0分別作為定量、定性監(jiān)測離子對。確定檢測離子對后需要先后優(yōu)化其碰撞能(CE)和去簇電壓(DP)。碰撞能使母離子裂解產(chǎn)生子離子，去簇電壓可防止擊碎的子離子再次聚合。優(yōu)化結(jié)果分別為56、48、54、47、130、140 V(同一母離子的子離子有相同的DP值)。在后續(xù)HPLC-MS/MS檢測中發(fā)現(xiàn)桿菌肽B的檢測離子對704.8>199.0、704.8>227.0，因同分異構(gòu)體的存在，在色譜行為中分裂為三個峰，分裂后的峰響應(yīng)值較低，不利于定量分析。且按照藥品說明書的標識桿菌肽B總含量應(yīng)為31.6%，但三個同分異構(gòu)體的含量并不明確，考慮到這種不確定性，選取含量明確且穩(wěn)定的桿菌肽A的離子對：712.0>199.0、712.0>227.0，作為本試驗中的定量、定性離子對進行檢測。

4 結(jié) 論

本研究摸索和優(yōu)化了樣品前處理方法及儀器條件，建立了豬、雞、鴨的可食性組織及禽蛋中桿菌肽殘留的HPLC-MS/MS檢測方法，樣品經(jīng)0.1%甲酸水提取，三氯乙酸乙腈沉淀蛋白，正己烷除脂，固相萃取柱凈化后，進HPLC-MS/MS檢測。以0.1%甲酸水和乙腈作為流動相梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧離子源，正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。結(jié)果表明，在50～1000 ng/g添加濃度范圍內(nèi)，濃度與目標峰面積線性關(guān)系良好，r>0.999，LOD≥30 ng/g，LOQ≥50 ng/g。平均回收率66.2%～84.7%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。本試驗建立的動物可食性組織和禽蛋中桿菌肽殘留的HPLC-MS/MS檢測方法符合生物樣品定量分析驗證指導(dǎo)原則的規(guī)定，滿足動物可食性組織中桿菌肽殘留限量的檢測要求。