土三七致大鼠肝竇阻塞綜合征發(fā)病機制研究

石玉芝，陳 芳，許 劍*

（1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院藥學部；2.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院感染性疾病科，重慶 400120）

肝竇阻塞綜合征（hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS），又稱為肝靜脈閉塞病（Hepatic veno-occlusive disease, HVOD），是由各種原因導致的肝血竇、肝小靜脈和小葉間靜脈內皮細胞水腫、壞死、脫落進而形成微血栓，引起肝內淤血、肝損傷和門靜脈高壓的一種肝臟血管性疾病[1]。其常見的原因主要有造血干細胞移植前大劑量化療、攝入含吡咯烷生物堿（PA）的中草藥、放射治療、器官移植、長期口服避孕藥及飲酒等[2]。其中，服用含有PA的植物藥物是發(fā)展中國家HSOS的主要病因，在我國主要由土三七引起[3-4]，但具體的發(fā)病機制尚不明確。本研究目的在于初步探索土三七致HSOS可能的靶基因，為HSOS的精準治療及預防提供可能的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選用24只健康SPF級雄性SD大鼠，體重（200±20 g），由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供[ 生產許可證號：SCXK（川）2018-18；使用許可證號：SYXK（川）2018-076]。所有動物飼養(yǎng)于川北醫(yī)學院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為層流潔凈飼育室，溫度為室溫22～25 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜明暗交替12 h/12 h；自由飲食、飲水，大鼠適應喂養(yǎng)1周，觀察無不良反應后，納入實驗。本研究經重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審查（倫理審批號：2010JC012）。

1.1.2 藥材和試劑 土三七由重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院藥學部從安徽省亳州市藥材總公司中藥公司購買，Trizol試劑（購于Thermo Fisher Scientific有限公司），福爾馬林液由川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 土三七灌胃藥液的制備 將土三七打粉，每次取150 g置于砂鍋中，加入900 mL水浸泡2 h，煎煮1.5 h后，濾出藥渣，得到藥液A；繼續(xù)加水600 mL煎煮1 h，濾出藥渣，得到藥液B，將藥液A和藥液B置于煎藥鍋中，濃縮至150 mL，即得到藥液濃度為1.0 g/mL土三七藥液。

1.2.2 實驗動物分組和干預 分組方法：將24只雄性大鼠分籠喂養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1周后以隨機數字表法隨機分為土三七高濃度組、中濃度組、低濃度組及空白對照組，每組6只。

干預方法：各組大鼠每日同一時間灌胃1次，高濃度組、中濃度組、低濃度組分別按照 [20 g/(Kg·d)]、[10 g/(kg·d)]、[5 g/(kg·d)]的劑量以土三七藥液灌胃，給予空白對照組相應的生理鹽水灌胃，1次/d。所有SD大鼠灌胃前稱體重，根據體重變化調整當日灌胃劑量。

1.2.3 肝組織病理檢查 灌胃4周后，以引頸法處死大鼠，剖腹取大鼠肝臟組織，留取部分肝組織備用，生理鹽水沖洗后用福爾馬林液固定，行肝組織HE染色及MASSON染色，證實HSOS形成情況。

1.2.4 通過基因芯片篩選靶基因 將肝臟病理檢查證實為HSOS的大鼠的肝組織提取RNA，以膽汁淤積、脂肪變性、磷脂病、肝細胞毒性、致癌性、炎癥壞死等相關標志物84個基因和12個內參基因組成96孔基因芯片（靶基因列表見表1）以篩選可能的致病靶基因。隨后通過Western blot法進一步炎癥靶基因蛋白表達水平及其上下游相關蛋白表達水平。

表1 PCR array篩選基因列表

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計學方法，PCR array描述RNA倍數變化采用2△△CT法[5]，Western blot結果采用檢測指標灰度值與內參灰度值之比進行計量分析，計量資料采用t檢驗，用(±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠生存情況 造模第1周結束時，高濃度組死亡5只，剩余1只在第2周內死亡。至第4周造模結束時，中濃度組大鼠存活3只，低濃度組大鼠存活4只，對照組大鼠無死亡發(fā)生。

2.2 大鼠肝臟病理學變化 高濃度組大鼠在造模2周內全部死亡，故無4周后的病理結果。造模4周結束，光鏡下觀察，低濃度組、中濃度組各組大鼠HE染色顯示肝小葉結構紊亂，多個小葉出血、壞死，肝細胞明顯減少或消失，伴灶性纖維素樣滲出，部分可見含鐵血黃素沉積，門靜脈、中央靜脈、肝竇不同程度擴張、淤血，部分中央靜脈閉塞。MASSON染色可見門靜脈周圍及中央靜脈內皮下纖維化，部分中央靜脈閉塞。中濃度組大鼠上述病理改變較為典型。對照組大鼠肝組織肝小葉結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，MASSON染色未見纖維蛋白沉積（圖1）。

圖1 造模4周結束時大鼠肝臟病理形態(tài)（光鏡×200）

2.3 大鼠肝組織靶基因PCR array篩查 在84個目標基因中發(fā)現具有明顯倍數關系（＞2倍）變化的基因有Ccng1、Cdkn1a、Pdgfra、Cd68、Thrsp、Serpine1、Cav1、Hmox1 8個基因。結合病理特征進一步篩選發(fā)現，中濃度組大鼠serpine1轉錄水平較空白組明顯較低，差異有統計學意義（P＜0.05），而低濃度組與空白對照組大鼠比較差異無統計學意義（P＞0.05）；除此之外，尚有Ccng1、Cdkn1a兩個基因，低濃度、中濃度與空白組大鼠對比倍數差異均具有統計學意義（P＜0.05）且低濃度組與中濃度組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 PCR array具有明顯倍數關系的基因表

2.4 肝竇內皮細胞損傷相關蛋白檢測 Western blot檢測顯示，中濃度土三七組大鼠肝組織serpine1蛋白表達水平低于空白組表達水平（P＜0.05），低濃度土三七組大鼠serpine1蛋白表達水平與空白組比較無顯著差異（P＞0.05）（圖2）；中濃度土三七組大鼠基質金屬肽酶9（MMP-9）蛋白表達水平明顯高于空白組表達水平，差異有統計學意義（P＜0.05），低濃度土三七組大鼠MMP9蛋白表達水平與空白組表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3）；中濃度土三七組大鼠谷胱甘肽（GSH）蛋白表達水平低于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低濃度土三七組大鼠GSH蛋白表達水平與空白組表達水平比較無顯著差異（P＞0.05）（圖4）。

圖2 Western blot檢測大鼠肝組織serpine1蛋白水平

圖3 Western blot檢測大鼠肝組織MMP9蛋白水平

圖4 Western blot檢測大鼠肝組織GSH蛋白水平

3 討論

土三七，又名菊三七，屬于菊科，具有止血、散瘀、消腫等功效，是我國民間常用的治療跌打損傷的中草藥。菊科的土三七與主產自云南的五加科三七（參三七）容易混淆[6]，二者均具有止血、消腫等功效，而土三七含有PA，過量服用后可引起肝竇阻塞綜合征（HSOS）。國內報道的HSOS病例約有半數以上為服用土三七所致[7]?；颊甙l(fā)病后主要的臨床表現為肝區(qū)疼痛、肝大和腹水，總死亡率可高達67%，除了肝移植外尚無特異性的治療手段[8]。本研究發(fā)現，給予大鼠高劑量土三七[20 g/(Kg·d)]灌胃1周后，死亡率超過80%，2周內死亡率為100%，這說明高劑量的土三七具有較強的毒性及致死性。

土三七含有較高劑量的PA，其在肝細胞色素p450的代謝下，最終代謝產物與細胞蛋白及DNA反應后生成“吡咯代謝物或代謝吡咯”，其中一部分降解為次生毒性代謝物，誘發(fā)急慢性或遺傳毒性，造成肝細胞功能紊亂、壞死甚至組織損傷[9]。本實驗造模4周，光鏡下觀察大鼠肝組織，土三七低、中濃度各組大鼠HE染色均可見不同程度門靜脈、中央靜脈、肝竇的擴張、淤血，肝細胞壞死及匯管區(qū)炎癥細胞浸潤；MASSON染色顯示不同程度纖維組織增生，符合HSOS的病理特征。這表明服用低、中濃度土三七灌胃4周可成功誘導大鼠HSOS的形成，以中濃度組較為明顯，且隨著劑量的增加，致死性隨之增加。

肝竇內皮細胞損傷在HSOS 發(fā)病中起著重要作用[6]。本研究經PCR array檢測發(fā)現，中濃度大鼠肝組織中serpine1轉錄水平較空白組明顯較低（P＜0.05），而低濃度組與空白對照組無差異（P＞0.05）。這說明中濃度土三七可通過內皮細胞損傷途徑導致HSOS，serpine1可能是其作用的靶點。Serpine1是serpine超家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其可由包括內皮細胞、巨噬細胞、肝細胞、平滑肌細胞和血小板等多種細胞合成[10]，其與慢性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關[11]。Serpine1敲除的小鼠MMP-9活性增加[12]，MMP9表達的增加與HSOS的發(fā)展密切相關[13]。本研究發(fā)現，中濃度土三七組隨著serpine1蛋白水平的降低，MMP9蛋白表達水平升高。可以推測，中濃度土三七通過內皮細胞損傷途徑引起serpine1表達降低，繼而引起MMP9蛋白的表達升高，從而導致HSOS。

PA代謝產物可與GSH或半胱氨酸反應形成毒性較弱或無毒的產物。肝竇內皮細胞GSH耗竭在HSOS發(fā)病中起重要作用。當GSH含量減少時，毒性物質形成增加，從而導致肝竇內皮細胞受損，典型表現以肝腺泡Ⅲ區(qū)為主的肝竇內皮細胞腫脹、損傷、脫落，肝竇顯著擴張充血；肝細胞不同程度地腫脹、壞死，紅細胞滲入狄氏間隙，肝內小靜脈管壁增厚，管腔狹窄、閉塞，無纖維化表現或可見匯管區(qū)輕度纖維增生[14]。本研究發(fā)現中濃度土三七組GSH蛋白表達水平低于空白組，推測土三七可能通過下調肝竇內皮細胞谷胱甘肽的合成或耗竭，引起內皮細胞損傷，從而導致HSOS的發(fā)生。

另外，本研究通過PCR Array實驗還發(fā)現，低濃度、中濃度土三七所致大鼠肝組織中的Ccng1和Cdkn1a的轉錄水平明顯高于空白組（P＜0.05）。細胞周期蛋白G1(Ccng1)和Cdkn1a是參與細胞周期調節(jié)的關鍵酶，是多個miRNA的靶點[15]。miRNA可在調節(jié)基因轉錄過程中與靶細胞相互作用誘導細胞死亡，已成為藥物性肝損傷的重要機制[16-17]，具體機制有待闡明。

4 結論

土三七通過下調肝竇內皮細胞谷胱甘肽的合成，引起肝竇內皮細胞serprine1表達下降，繼而引起MMP表達水平升高，最終引起HSOS。這初步揭示了土三七可能的致病機制，為探索土三七所致HSOS的分子機制提供了一定的理論依據。