白藜蘆醇對膿毒癥小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用和機(jī)制研究

蔡涵暉 劉景全 邵自強(qiáng) 林宗斌 梁天宇 楊向紅

急性腎損傷（acute kidney injury,AKI）是膿毒癥常見的并發(fā)癥之一。膿毒癥相關(guān)性急性腎損傷（sepsisassociated AKI,S-AKI）是一種急性功能損害和器官損害綜合征。患者一旦發(fā)生，不僅延長住院時(shí)間，更重要的是與不良預(yù)后密切相關(guān)，死亡風(fēng)險(xiǎn)大幅增加[1-2]。因此，S-AKI早期診斷并及時(shí)干預(yù)將有助于降低患者病死率，并提高其生存質(zhì)量。沉默信息調(diào)節(jié)相關(guān)酶1（sirtuin 1,SIRT1）是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）的去乙?；?。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1具有腎臟保護(hù)作用，如減輕氧化應(yīng)激損傷、誘導(dǎo)線粒體再生以及抑制腎小管細(xì)胞凋亡等[3-5]。白藜蘆醇作為SIRT1的天然激活劑，研究認(rèn)為其能緩解膿毒癥所致腎損傷，主要通過調(diào)控炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的腎臟微環(huán)境和炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)[6-7]。然而，近年來腎小管上皮細(xì)胞凋亡被認(rèn)為可能在S-AKI的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[8]。白藜蘆醇是否能干預(yù)S-AKI中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡及其作用機(jī)制如何，尚待研究探討。因此，本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）術(shù)構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，旨在探討白藜蘆醇是否通過調(diào)節(jié)SIRT1蛋白的表達(dá)干預(yù)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，達(dá)到保護(hù)腎功能的目的，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 清潔級C57BL/6小鼠（雄性，6～8周齡，體質(zhì)量20 g左右）由杭州醫(yī)學(xué)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SYXK（浙）2019-0011。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)倫理批準(zhǔn)（編號：ZJCLA-IACUC-20030023）。白藜蘆醇購自美國MCE 生物有限公司（200 mg/瓶，粉劑，批號：HY-16561）。腎損傷標(biāo)志物-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）的ELISA試劑盒購自美國Elabscience公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenFast qPCR Mix購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。PierceTMECL Western Blotting Substrate、Thermo Fisher/Pierce BCA Protein Assay Kit試劑盒購自英國Thermo Fisher公司。SIRT1抗體、半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase 3）抗體購自美國CST公司。Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膿毒癥小鼠模型的制備和分組 將45只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥模型組（CLP組）和白藜蘆醇實(shí)驗(yàn)組（CLP+白藜蘆醇組），每組15只。采用CLP術(shù)構(gòu)建膿毒癥模型[9]。術(shù)前所有小鼠禁食12 h，以1%戊巴比妥鈉注射液50 mg/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒鋪無菌巾，沿腹部正中線作約1 cm左右切口，在回盲瓣遠(yuǎn)側(cè)用4號縫合線結(jié)扎盲腸，結(jié)扎范圍為整個(gè)盲腸的1/3左右。用18號針貫穿盲腸2次，擠出少許腸內(nèi)容物。之后，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)畢在股部皮下注射37℃0.9%氯化鈉溶液30 ml/kg進(jìn)行液體復(fù)蘇。術(shù)后3 h開始予皮下注射亞胺培南/西司他丁25 mg/kg治療，每12 h重復(fù)1次，共2 d。Sham組除不結(jié)扎及盲腸穿孔，其余步驟與上述相同。CLP+白藜蘆醇組行CLP術(shù)后，給予10 mg/kg劑量白藜蘆醇0.4 ml灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；Sham組及CLP組，予0.4 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 腎功能指標(biāo)檢測 術(shù)后72 h每組取5只存活小鼠，將小鼠以1%戊巴比妥鈉注射液50 mg/kg麻醉后，采用眼球摘除法收集2 ml血液，3 000 r/min離心10 min后提取血清。采用全自動(dòng)生化分析儀測定小鼠血清中尿素氮及肌酐水平，剩余血清存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察 術(shù)后72 h每組取5只小鼠腎臟迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，切片機(jī)切成約5 μm厚的切片，HE染色，之后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 腎損傷標(biāo)志物檢測 術(shù)后72 h收集的每組小鼠血清，再按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測NGAL、KIM-1水平。

1.2.5 腎細(xì)胞凋亡檢測 取前述腎組織石蠟切片，按照Tunel凋亡檢測試劑盒說明書操作。凋亡細(xì)胞染色后，鏡下觀察其核呈現(xiàn)棕黃色，在高倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野，每個(gè)視野選100個(gè)細(xì)胞，綜合5個(gè)視野中凋亡細(xì)胞所占比例，得出細(xì)胞凋亡率（%），即細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 腎臟組織SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測 采用RT-qPCR法檢測SIRT1 mRNA表達(dá)。取各組小鼠新鮮腎臟皮質(zhì)組織100 mg，用Trizol試劑提取總RNA，通過紫外分光光度計(jì)對樣品RNA進(jìn)行測定，測定OD260/OD280值在1.8～2.0，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量的反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照廠商說明書進(jìn)行設(shè)定，內(nèi)參基因使用GAPDH，SIRT1 mRNA的相對表達(dá)水平通過2-ΔΔCt計(jì)算。

采用Western blot法檢測SIRT1蛋白表達(dá)水平。取各組小鼠腎組織經(jīng)細(xì)胞裂解提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。各組組織蛋白（15 μg）依次在10%SDS/PAGE行凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。經(jīng)5%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h后，PVDF膜在SIRT1（1∶300）和 β-actin（1∶6 000）的一抗管中 4 ℃孵育過夜。TBST液洗滌3次，接著加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗管中，室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液并通過BioRad系統(tǒng)成像，以β-actin作為內(nèi)參，ImageLab軟件分析結(jié)果。

1.2.7 腎臟組織Caspase 3表達(dá)檢測 采用免疫組織化學(xué)法。取前述制備的各組小鼠腎組織石蠟切片脫蠟至水，滴加兔抗Caspase 3抗體，4℃過夜孵育，DAPI復(fù)染細(xì)胞后封片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野觀察并拍照。Caspase 3陽性染色定位以細(xì)胞質(zhì)為主，以出現(xiàn)均勻完整的細(xì)胞質(zhì)著色定為陽性細(xì)胞。使用Image J軟件中的IHC Profiler對免疫組化染色后的切片進(jìn)行圖像分析并予評分。依據(jù)IHC Profiler給出的結(jié)果：高陽性區(qū)、陽性區(qū)、低陽性區(qū)和陰性區(qū)分別對應(yīng)4、3、2、1分，最后依據(jù)下述公式計(jì)算評分。評分=（高陽性區(qū)域面積×分?jǐn)?shù)+陽性區(qū)域面積×分?jǐn)?shù)+低陽性區(qū)域面積×分?jǐn)?shù)+陰性區(qū)面積×分?jǐn)?shù)）/圖片總面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠腎功能指標(biāo)比較 3組小鼠血肌酐和尿素氮水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與Sham組相比，CLP組小鼠血肌酐和尿素氮水平均升高（均P＜0.05）；CLP+白藜蘆醇組小鼠血肌酐和尿素氮均較CLP組降低（均P＜0.05），但較Sham組仍升高（均 P＜0.05），見表 1。

表1 3組小鼠腎功能指標(biāo)比較

2.2 3組小鼠腎臟組織病理學(xué)變化 Sham組小鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管、腎小球正常，腎小管上皮細(xì)胞未見變性、萎縮、腫脹壞死或炎癥細(xì)胞浸潤，管腔無擴(kuò)張；CLP組小鼠腎臟腎小球毛細(xì)胞血管擴(kuò)張、充血，腎小管上皮細(xì)胞水腫、顆粒性變樣或空泡變性，管腔縮小，大量炎癥細(xì)胞浸潤；CLP+白藜蘆醇組腎小球毛細(xì)胞血管擴(kuò)張不明顯，炎癥細(xì)胞浸潤較CLP組減輕。見圖1（插頁）。

圖1 3組小鼠腎臟組織病理學(xué)觀察所見（HE染色，×200）

2.3 3組小鼠血清腎損傷標(biāo)志物水平比較 3組小鼠血清NGAL、KIM-1水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與Sham組相比，CLP組小鼠血清NGAL和KIM-1水平均升高（均P＜0.05）；CLP+白藜蘆醇組小鼠血清NGAL、KIM-1均較CLP組降低（均P＜0.05），但較Sham組仍升高（均P＜0.05），見表2。

表2 3組小鼠血清腎損傷標(biāo)志物水平比較（ng/ml）

2.4 3組小鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況比較 3組小鼠腎臟細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Sham組相比，CLP組小鼠腎臟細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；CLP+白藜蘆醇組小鼠腎臟細(xì)胞凋亡率較CLP組降低（P＜0.05），但仍較 Sham 組升高（P＜0.05）。見圖 2（插頁）。

圖2 3組小鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況比較（a：Tunel染色鏡下所見，×200；b：細(xì)胞凋亡率比較）

2.5 3組小鼠腎臟組織SIRT1 mRNA、蛋白表達(dá)水平比較 3組小鼠腎臟組織SIRT1 mRNA、蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。CLP+白藜蘆醇組小鼠腎臟組織SIRT1 mRNA、蛋白表達(dá)水平＞CLP 組＞Sham 組（均 P＜0.05），見圖 3、4。

圖3 3組小鼠腎臟組織SIRT1 mRNA表達(dá)水平比較

圖4 3組小鼠腎臟組織SIRT1蛋白表達(dá)水平比較（a：蛋白表達(dá)電泳圖比較；b：蛋白表達(dá)水平比較）

2.6 3組小鼠腎臟組織Caspase 3表達(dá)情況比較 Caspase 3染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈細(xì)顆粒棕黃色。Sham組腎臟組織Caspase 3表達(dá)很少。與Sham組相比，CLP組腎臟組織Caspase 3表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），大部分遠(yuǎn)曲小管呈Caspase 3陽性反應(yīng)。CLP+白藜蘆醇組腎臟組織Caspase 3表達(dá)較CLP組下調(diào)（P＜0.05），但仍高于 Sham 組（P＜0.05）。見圖 5（插頁）、6。

圖5 3組小鼠腎臟組織Caspase 3表達(dá)情況比較（免疫組化染色，×200）

圖6 3組小鼠腎臟組織Caspase 3表達(dá)免疫組化染色評分比較

2.7 3組小鼠存活率比較 各組剩余的小鼠飼養(yǎng)至7 d，發(fā)現(xiàn)Sham組小鼠10只全部存活，7 d存活率100%；CLP組小鼠在第3天累計(jì)死亡9只，最終在第4天全部死亡，7 d存活率0%；CLP+白藜蘆醇組小鼠日死亡數(shù)量基本平穩(wěn)，在第 1、2、4、5、6 天各死亡 1只，第3天死亡2只，在第7天仍存活3只，存活率30%。生存分析顯示，CLP+白藜蘆醇組與CLP組小鼠7 d存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖7。

圖7 3組小鼠存活率比較

3 討論

白藜蘆醇具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、改善胰島素抵抗等[10-11]，具有一定的腎臟保護(hù)作用[6，12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，無論是原發(fā)性（尿毒癥大鼠模型）還是繼發(fā)性腎損傷（糖尿病性腎損傷大鼠模型），白藜蘆醇的干預(yù)能減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎損傷并改善其腎功能，提高存活率[12-13]。筆者團(tuán)隊(duì)在研究白藜蘆醇對S-AKI的保護(hù)作用基礎(chǔ)上也發(fā)現(xiàn)CLP+白藜蘆醇組小鼠血清肌酐、尿素氮以及腎損傷標(biāo)志物均較CLP組明顯降低，提示腎臟細(xì)胞損傷減輕，腎功能明顯好轉(zhuǎn)。而且，CLP+白藜蘆醇組小鼠的存活時(shí)間大大延長。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為白藜蘆醇緩解膿毒癥所致腎損傷，主要通過調(diào)控炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的腎臟微環(huán)境和炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)[6-7]。但是，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，盡管膿毒癥與非膿毒癥AKI有著相似的腎功能損傷，但膿毒癥腎臟中的急性腎小管壞死及炎癥較少，反而見到一定數(shù)量的凋亡腎小管細(xì)胞[8]。而在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠可見較多凋亡的腎小管上皮細(xì)胞，腎組織中促凋亡蛋白Caspase 3的表達(dá)也相應(yīng)增加。而經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)的膿毒癥小鼠，腎小管上皮細(xì)胞凋亡及腎組織凋亡蛋白的表達(dá)相應(yīng)減少。這提示腎小管上皮細(xì)胞凋亡參與了S-AKI，而白藜蘆醇可減輕膿毒癥小鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。

SIRT1是一種NAD+依賴性組蛋白去乙?；?，具有保護(hù)和維持腎臟細(xì)胞功能的作用[6，14]。Opal等[15]發(fā)現(xiàn)SIRT1激活劑STAC SRT3025的使用能降低膿毒癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病死率。白藜蘆醇作為SIRT1的天然激活劑，它對腎臟的保護(hù)也可能通過激活SIRT1相關(guān)通路實(shí)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)白藜蘆醇處理的膿毒癥小鼠，SIRT1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著升高同時(shí)其促凋亡蛋白Caspase 3的表達(dá)降低，腎功能好轉(zhuǎn)。因此，筆者認(rèn)為白藜蘆醇減輕膿毒癥相關(guān)腎損傷的機(jī)制之一，可能是通過SIRT1抑制凋亡通路的激活實(shí)現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，CLP組小鼠腎臟組織SIRT1表達(dá)水平升高。Kim等[16]的研究與本研究有相似的發(fā)現(xiàn)，該研究用順鉑處理C57BL/6小鼠誘導(dǎo)AKI，發(fā)現(xiàn)SIRT1的表達(dá)于6 h開始增加，至第5天達(dá)高峰，第14天開始下降，他們認(rèn)為這與腎損傷初期自我保護(hù)機(jī)制促使機(jī)體進(jìn)行腎臟自我修復(fù)，通過短暫上調(diào)SIRT1表達(dá)相關(guān)。但是，這與Xu等[17]的研究結(jié)果不符，他們發(fā)現(xiàn)CLP組SD大鼠SIRT1的表達(dá)和活性被抑制，尤其在造模后8 h降至最低。本研究雖與Xu等[17]造模方式相同，但選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卻不同。筆者推測SIRT1檢測結(jié)果不同是否與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異相關(guān)。因此，后續(xù)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探討SIRT1在不同AKI模型以及不同種類動(dòng)物膿毒癥模型中的表達(dá)情況。同時(shí)，本研究也存在一定的局限性。膿毒癥疾病是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的疾病進(jìn)程，這是CLP進(jìn)行膿毒癥造模所不能控制的。因此，與臨床中的膿毒癥存在一定的差異。另外，本研究并未對白藜蘆醇存在的不良反應(yīng)進(jìn)一步研究。后續(xù)將針對這些不足和缺陷再加以完善和驗(yàn)證。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過激活SIRT1信號抑制凋亡通路從而抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減輕S-AKI程度。這或?yàn)榕R床應(yīng)用白藜蘆醇治療S-AKI提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。