甘薯近緣野生資源的染色體倍性研究

吉士東， 王 麗， 胡啟國(guó)， 楊愛(ài)梅

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院， 河南 南陽(yáng) 473061；2.商丘市農(nóng)林科學(xué)院， 河南 商丘 476000)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]隸屬于旋花科甘薯屬，是世界上重要的糧食、飼料和工業(yè)原料用作物之一[1]。遺傳上甘薯有高度雜合、種間與種內(nèi)雜交不親和以及遺傳資源缺乏等特點(diǎn)[2]，因此其遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，病毒病、病蟲害危害也較為嚴(yán)重，制約了甘薯品種在遺傳方面的改良。目前世界上分布著甘薯屬600～700個(gè)物種[1,3-4]，甘薯近緣野生資源非常豐富。甘薯近緣野生種具有抗逆、抗蟲、抗病等優(yōu)良基因[2,5]，與甘薯遺傳性狀的差別較大，因此利用甘薯近緣野生種與甘薯品種進(jìn)行雜交，為擴(kuò)大甘薯基因庫(kù)及改良甘薯遺傳性狀等方面提供了重大的基因資源來(lái)源。將甘薯近緣野生種與甘薯品種進(jìn)行雜交時(shí)，常要求它們的染色體組一定相同或大致相同。張必泰等[6]指出，甘薯屬植物的染色體基數(shù)雖然都是15，但不同種的染色體組卻不相同。根據(jù)它們雜交是否親和，可以把甘薯近緣野生種植物分成兩大類群，即A群和B群[7]。A群品種有Ipomoea.lacunosa、Ipomoea.triloba、Ipomoea.gracilis等，B群品種有Ipomoea.leucantha、Ipomoea.littoralis、Ipomoea.batatas和Ipomoea.trifida及其系列種等。A群可以自交結(jié)實(shí)，相互雜交容易成功；B群能夠雜交，自交不結(jié)；A群與B群各種之間雜交并不親和。

I.trifida中文名為三淺裂野牽牛，有2倍體、3倍體、4倍體和6倍體[8]。I.trifida被認(rèn)為是甘薯的野生祖先[9-12]。I.trifida具有優(yōu)良的特性，如高淀粉、抗病蟲、耐病毒、抗旱等，可以通過(guò)利用甘薯栽培種與I.trifida群體進(jìn)行雜交，將其優(yōu)異性狀基因?qū)敫适碓耘喾N中，來(lái)提高甘薯品種的淀粉含量以及甘薯對(duì)病蟲害和環(huán)境的抗性。甘薯近緣種有不同倍數(shù)的染色體，但由于它們的細(xì)胞質(zhì)比較濃厚、染色體極小且數(shù)目多、著色能力又較弱、不易觀察，較難得到分裂相多、分散度高的制片[13]。目前對(duì)甘薯近緣野生種體細(xì)胞染色體形態(tài)、倍數(shù)分析等研究很少，相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究也相對(duì)薄弱，這對(duì)研究甘薯及近緣野生種的起源、分類以及進(jìn)化有著直接影響。因此，很有必要加強(qiáng)對(duì)甘薯野生種材料進(jìn)行染色體觀察和細(xì)胞學(xué)的研究鑒定。

秋水仙素是一種生物堿。自1937年美國(guó)學(xué)者布萊克斯利等用秋水仙素加倍曼陀羅等植物的染色體數(shù)獲得成功以后，秋水仙堿就被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)的研究和植物育種中[14]；對(duì)二氯苯是一種有機(jī)化合物，用于有機(jī)合成，它是一種優(yōu)良的預(yù)處理藥物，在染色體制片技術(shù)中，基本上可以達(dá)到秋水仙素或其他藥物的效果[15]；8-羥基喹啉(8-HQ)是一種應(yīng)用范圍比較廣的殺菌劑，能夠與金屬離子結(jié)合，通過(guò)奪走細(xì)胞內(nèi)的銅離子和鐵離子起到抗菌作用，可用來(lái)對(duì)甘薯根尖細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理[16]。

在甘薯細(xì)胞染色體研究中，選擇合適的預(yù)處理劑、處理濃度及時(shí)間是獲得染色體分散均勻的中期分裂相的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用0.1%秋水仙素、對(duì)二氯苯飽和溶液、2 mmol/L 8-HQ三種試劑對(duì)甘薯野生種I.trifida根尖進(jìn)行預(yù)處理，確定最佳預(yù)處理方法。采用最佳預(yù)處理方法明確秋水仙素加倍后的I.trifida和甘薯品種徐薯18的倍性，為其遠(yuǎn)緣雜交育種以及雜種細(xì)胞遺傳學(xué)行為的進(jìn)一步研究提供必要的細(xì)胞學(xué)依據(jù)，并為甘薯屬植物的染色體實(shí)驗(yàn)方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘薯近緣野生種I.trifida、甘薯品種徐薯18由徐州甘薯研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1根尖材料預(yù)處理與制片

剪取溫室盆栽I.trifida、秋水仙素處理加倍后的I.trifida、徐薯18枝條進(jìn)行水培，待其發(fā)根長(zhǎng)至1～1.5 cm，于08：00—10：00時(shí)取樣。將I.trifida根尖分別用0.1%秋水仙素、2 mmol/L 8-HQ在4 ℃冰箱分別進(jìn)行1、2、3、4、5 h的預(yù)處理，用對(duì)二氯苯飽和溶液在室溫下分別進(jìn)行1、2、3、4、5 h的預(yù)處理，每種預(yù)處理液均設(shè)置清水處理的根尖作為對(duì)照。用卡諾氏溶液固定20～24 h，70%乙醇沖洗2次，轉(zhuǎn)入70%乙醇中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取固定后的根尖材料，蒸餾水漂洗2～3次，于60 ℃恒溫水浴中用1 mol/L HCl解離8～10 min，用蒸餾水漂洗2～3次，蒸餾水中保存，0～1 h內(nèi)制片。切取尖端1～2 mm，搗碎，用改良苯酚品紅溶液染色5～10 min后，常規(guī)壓片鏡檢，將具有完整細(xì)胞輪廓，且染色體分散良好的細(xì)胞用SPOT RTKE冷CCD進(jìn)行采集圖像。

1.2.2數(shù)據(jù)分析

在顯微鏡下觀察，選取細(xì)胞均勻分散的區(qū)域，統(tǒng)計(jì)有絲分裂指數(shù)。

有絲分裂指數(shù)=(視野內(nèi)觀察到的分裂細(xì)胞數(shù)目/視野內(nèi)觀察到的總細(xì)胞數(shù)目)×100%。

1.2.3染色體倍性分析

采用最佳預(yù)處理方法對(duì)秋水仙素加倍后的I.trifida與甘薯品種徐薯18進(jìn)行倍性鑒定。每種材料統(tǒng)計(jì)30個(gè)染色體分散良好的分裂相細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)具有一致染色體數(shù)目的細(xì)胞，把85%以上細(xì)胞都具有的染色體數(shù)目定為該植物的染色體數(shù)目[17]。

2 結(jié)果分析

2.1 不同預(yù)處理方法對(duì)壓片效果的影響

本試驗(yàn)中，使用0.1%秋水仙素、對(duì)二氯苯飽和溶液、8-HQ三種試劑分別處理1、2、3、4、5 h的甘薯近緣野生種I.trifida根尖染色體壓片結(jié)果顯示，3種預(yù)處理劑均可以使根尖細(xì)胞的有絲分裂停留在中期。但采用對(duì)二氯苯飽和液與2 mmol/L 8-HQ 溶液處理根尖后，染色體收縮程度適中，分散性良好，便于計(jì)數(shù)(見(jiàn)圖1)，而用秋水仙素處理的材料中染色體較長(zhǎng)，且分散性不理想。因此，在本試驗(yàn)中預(yù)處理劑選用對(duì)二氯苯飽和液與2 mmol/L 8-HQ溶液較好。

注：A為對(duì)二氯苯飽和溶液處理3 h；B為2 mmol/L 8-HQ處理2 h。圖1 對(duì)二氯苯飽和溶液與2 mmol/L 8-HQ預(yù)處理的甘薯近緣種I. trifida根尖有絲分裂Fig.1 Root tip mitosis of I. trifida pretreated with saturated p-dichlorobenzene and 2 mmol/L 8-HQ

2.2 不同預(yù)處理方法對(duì)甘薯近緣種I.trifida根尖有絲分裂的影響

3種試劑在不同處理時(shí)間下對(duì)甘薯近緣種I.trifida根尖有絲分裂的影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種預(yù)處理劑的對(duì)照組細(xì)胞中均有少許分裂相，但有絲分裂指數(shù)較低。隨著3種預(yù)處理劑處理時(shí)間的延長(zhǎng)，有絲分裂指數(shù)均上升。其中0.1%秋水仙素處理 2 h 后的中期有絲分裂指數(shù)約是處理1 h 的1.18倍，是對(duì)照的2.68倍；對(duì)二氯苯飽和溶液處理3 h后的中期有絲分裂指數(shù)約是處理1 h的1.43倍，是對(duì)照的5.22倍；2 mmol/L 8-HQ處理2 h后的中期有絲分裂指數(shù)約是處理1 h的1.34倍，是對(duì)照的4.09倍。但隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，3種預(yù)處理劑的有絲分裂指數(shù)均有不同程度的下降趨勢(shì)，但均高于對(duì)照組。這說(shuō)明不同預(yù)處理劑的處理時(shí)間很關(guān)鍵，更長(zhǎng)的預(yù)處理時(shí)間可能會(huì)部分抑制甘薯近緣野生種根尖細(xì)胞的有絲分裂。

表1 3種試劑不同處理時(shí)間對(duì)甘薯近緣野生種I.trifida根尖有絲分裂的影響

2.3 染色體倍性鑒定

用對(duì)二氯苯飽和溶液對(duì)甘薯近緣野生種I.trifida、秋水仙素加倍后的I.trifid與甘薯品種徐薯18的根尖進(jìn)行3 h預(yù)處理，采用相同的壓片方法進(jìn)行鏡檢。各材料染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)情況見(jiàn)表2，染色體形態(tài)見(jiàn)圖2。由表2可知，I.trifida染色體數(shù)為30的占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的90%，秋水仙素加倍的I.trifid染色體計(jì)數(shù)為60的占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86.7%，徐薯18染色體計(jì)數(shù)為90的占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的86.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘薯近緣種I.trifida染色體數(shù)目以30條為主，秋水仙素加倍處理后的I.trifid染色體數(shù)目以60條為主，徐薯18染色體數(shù)目以90條為主。由于甘薯屬植物染色體基數(shù) x=15，因此本實(shí)驗(yàn)中甘薯近緣種I.trifida是二倍體(2 n=2 x=30)，秋水仙素加倍處理后的I.trifid是四倍體(2 n=4 x=60)，徐薯18是六倍體(2 n=6 x=90)。

表2 各材料不同數(shù)目染色體的細(xì)胞及比例

注：A為I.trifida；B為秋水仙素加倍后的I.trifid；C為徐薯18。圖2 染色體倍性計(jì)數(shù)Fig.2 Chromosome number of the materials

3 討 論

由于甘薯近緣種染色體比較小且數(shù)目多、著色能力弱、不易觀察[13,16]，所以在對(duì)其進(jìn)行染色體觀察以及計(jì)數(shù)時(shí)，最好是在細(xì)胞分裂下進(jìn)行，以有絲分裂中期的染色體最為合適。在細(xì)胞學(xué)上常利用秋水仙素、對(duì)二氯苯飽和溶液、8-HQ對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理來(lái)積累中期分裂細(xì)胞，便于染色體觀察。每種植物的染色體大小及數(shù)目不同，所采用的預(yù)處理劑的濃度、時(shí)間及其效果也不同。有關(guān)預(yù)處理劑對(duì)不同材料進(jìn)行根尖細(xì)胞有絲分裂的研究，在花生、辣椒、大蒜、洋蔥、蠶豆等[18-22]植物中均有報(bào)道，而相關(guān)研究在甘薯屬植物中報(bào)道較少。本研究比較不同的預(yù)處理方法對(duì)甘薯近緣種I.trifida積累中期分裂相的影響，得出最優(yōu)的預(yù)處理方法，從而為甘薯近緣野生種及其他甘薯根尖細(xì)胞預(yù)處理提供了直接參考，達(dá)到減少實(shí)驗(yàn)步驟和避免材料浪費(fèi)的目的。

本試驗(yàn)中，對(duì)二氯苯飽和液與2 mmol/L 8-HQ溶液壓片效果較好，對(duì)二氯苯飽和溶液處理I.trifida根尖3 h時(shí)，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)最高。其中2 mmol/L 8-HQ處理2 h時(shí)甘薯近緣野生種I.trifida細(xì)胞有絲分裂指數(shù)最高，這與王路等[16]研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1%秋水仙素、2 mmol/L 8-HQ和對(duì)二氯苯飽和水溶液3種預(yù)處理劑均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，I.trifida根尖有絲分裂指數(shù)均先增加后降低(見(jiàn)表1)，這與賽爾蘭·熱合買提等[23]研究結(jié)果相同。其原因可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的處理影響細(xì)胞內(nèi)原有的代謝活力，改變了細(xì)胞內(nèi)原有的物質(zhì)平衡并阻止細(xì)胞內(nèi)的分裂轉(zhuǎn)化，相應(yīng)延長(zhǎng)了細(xì)胞周期，導(dǎo)致根尖生長(zhǎng)緩慢[23-24]。本試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)不同預(yù)處理劑進(jìn)行更小范圍的處理時(shí)間研究，更小范圍的處理時(shí)間對(duì)I.trifida細(xì)胞的有絲分裂的影響是否顯著，還需進(jìn)一步研究探討。

I.trifida被公認(rèn)為甘薯的近緣祖先，但I(xiàn).trifida在分類學(xué)和甘薯進(jìn)化中的地位還存在很大爭(zhēng)議，因?yàn)樵撈贩N存在二倍體、四倍體和六倍體。因此有研究者認(rèn)為，I.trifida本身就是一個(gè)包括從二倍體到六倍體的多倍體和多倍體間雜種的綜合群體——復(fù)合體(species，complex)[9,25]。迄今為止，甘薯近緣種I.trifida只有六倍體成功應(yīng)用于甘薯育種中。經(jīng)本試驗(yàn)中最優(yōu)處理方法鑒定供試材料甘薯近緣種I.trifida為二倍體。六倍體甘薯自交不親和，由于雜交育種，導(dǎo)致甘薯遺傳背景非常復(fù)雜。與六倍體甘薯相比，二倍體I.trifida遺傳組成簡(jiǎn)單，遺傳背景清晰。將遺傳背景清晰的甘薯近緣種I.trifida作為親本，和我國(guó)栽培甘薯品種進(jìn)行雜交，既能將甘薯野生種質(zhì)導(dǎo)入栽培甘薯品種中，又可以降低甘薯野生種質(zhì)遺傳干擾，從而能更加集中目標(biāo)進(jìn)行甘薯遺傳研究。本試驗(yàn)中經(jīng)秋水仙素處理加倍后的I.trifida經(jīng)鑒定是四倍體。多倍體可以在遠(yuǎn)緣雜交中克服種間不育性，實(shí)現(xiàn)基因的種間轉(zhuǎn)移[26]，具有更強(qiáng)的遺傳可塑性[27]。對(duì)于得到的四倍體I.trifida是否能夠直接利用，或作為中間親本把其野生親本的優(yōu)良性狀傳遞到栽培種中，還有待于進(jìn)一步研究。

甘薯是一種遺傳上很復(fù)雜、很不穩(wěn)定并且十分難掌握的試驗(yàn)材料，雖然它的野生資源的種類十分豐富而且分布廣泛，但人們所能收集到的甘薯野生資源還很少，所以關(guān)于甘薯屬植物種的分類原則、進(jìn)化關(guān)系在世界上至今仍然沒(méi)有得到統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。有關(guān)甘薯屬植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究在我國(guó)仍然比較薄弱，而且國(guó)外有關(guān)這方面的文獻(xiàn)也比較少。但隨著生物技術(shù)的日益發(fā)展、甘薯育種要求越來(lái)越高以及野生資源的進(jìn)一步引進(jìn)、開(kāi)發(fā)和利用，這些問(wèn)題會(huì)變得越來(lái)越清楚。