7種特色蔬菜種質(zhì)資源種子生活力監(jiān)測及安全保存期研究

傅伊倩， 張寶海， 何偉明， 韓向陽， 劉龐源

(北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點實驗室， 北京 100097)

種質(zhì)資源是攜帶物種遺傳信息的載體，作為農(nóng)業(yè)科技原始創(chuàng)新、現(xiàn)代種業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，種質(zhì)資源的收集和保存受到世界各國及相關(guān)國際組織的高度重視。根據(jù)FAO在2011年統(tǒng)計[1]，截至2010年，全球已建成1 750座基因庫，收集保存的種質(zhì)資源約740萬份，而其中的絕大多數(shù)(90%)種質(zhì)資源是以植物種子的形式被異地保存。將種子貯存于基因庫中可利用低溫、干燥等貯存條件抑制種子新陳代謝，延長種子壽命。然而種子成熟后，在保存過程中就開始了不可避免的衰老進程。在保存的過程中，種子生活力的下降趨勢呈現(xiàn)“倒S型”曲線[2]，即在種子保存初期的一段時間內(nèi)，種子處于較高活力的平臺期，而后進入持續(xù)快速下降的驟降期，直至種子活力的喪失?？梢酝ㄟ^適時監(jiān)測種子的活力，確定種質(zhì)繁殖更新的最佳時間點，來確保種質(zhì)資源的安全，防止種質(zhì)資源的丟失[3]。

世界各國及相關(guān)組織對于種子活力下降至何種水平時需要更新的標準不盡相同。種子從入庫保存到發(fā)芽率下降，再到需要繁種更新的發(fā)芽率臨界值的貯藏時間為種質(zhì)的安全保存期。按照FAO種質(zhì)資源基因庫管理標準[1]，當正常種子生活力下降至入庫初始生活力的85%時，應(yīng)對種子進行繁殖更新。而美國農(nóng)業(yè)部國家種子貯藏實驗室曾設(shè)定的最低要求為所有庫存種子活力需維持在60%以上[4]，俄羅斯對繁種更新的臨界值曾要求為種子活力下降為初始發(fā)芽率的50%[5]。當一批種子的活力下降至50%(P50)時[6]，種子可能出現(xiàn)的遺傳漂變幾率變大，遺傳完整性也大大降低。從入庫初期到下降至P50的時間段定義為種子的保存壽命，這2個時間點在種質(zhì)資源管理中應(yīng)重點關(guān)注。

種質(zhì)資源的安全管理需對不同種類的種子生活力進行定期監(jiān)測，明確種子生活力下降的關(guān)鍵節(jié)點。不同蔬菜種子及不同貯存環(huán)境條件基因庫的種子安全保存期和種子保存壽命存在差異，因此，種子活力監(jiān)測時間間隔設(shè)置應(yīng)不同。大部分種質(zhì)資源的保存研究集中在大田作物及常規(guī)蔬菜品種上，而對一些特色蔬菜的研究比較少。由于生活水平的提高，一些特色蔬菜種類也開始進入人們的生活，豐富了食用蔬菜品種。特色蔬菜的品種收集、保存有助于相關(guān)品種后續(xù)的開發(fā)及育種研究。通過本研究的監(jiān)測方法可以初步制定相關(guān)品種的保存方法及繁種更新的時間，為后續(xù)大規(guī)模的特色蔬菜持續(xù)引種、保存提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗材料為韭蔥(AlliumporrumL.)、紅莧菜(AmaranthustricolorL.)、京水菜(Brassicarapavar.niposinicaL.)、球莖茴香(Foeniculumvulgarevar. dulce)、紫羅羅生菜(LactucasativaL. ‘Ziluoluo’)、大橡葉生菜(LactucasativaL. ‘Daxiangye’)、櫻桃蘿卜(RaphanussativusL. var. radculus pers)共7種特色蔬菜種子。

1.2 方 法

1.2.1種子干燥及貯存

種子放入干燥箱中進行約3周常規(guī)干燥后，取出少量用于后續(xù)含水量測定，其余種子分成6份分別用牛皮紙袋包裝后裝入鋁箔袋密封保存，于2009年分別放入-2～2 ℃低溫庫塑料密封桶內(nèi)和20 ℃左右室溫的玻璃干燥器(含有硅膠)內(nèi)保存。

1.2.2種子含水量的測定

根據(jù)《國際種子檢驗規(guī)程》(ISTA)測定，采用高溫烘干法，105 ℃下烘干12 h。每份種子稱取5 g，用高溫烘干前后的重量計算含水量，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率的測定

種子生活力主要通過對種子發(fā)芽率的監(jiān)測結(jié)果來判斷。種子放入墊有一層吸水紙和一層濾紙的發(fā)芽盒中，在黑暗的培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。種子發(fā)芽條件為溫度(23±2)℃，相對濕度90%。每處理100粒種子，重復(fù)3次。每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，第3天后計算發(fā)芽勢，第7天后統(tǒng)計發(fā)芽率。

表2 7種蔬菜種子在不同溫度下第3年和第12年發(fā)芽勢測定結(jié)果 Table 2 The seed germination rates of 7 vegetable varieties after 3rd year and 12th year storage 單位：%

表3 7種蔬菜種子在不同溫度下第3年和第12年發(fā)芽率測定結(jié)果 Table 3 The seed germination percentages of 7 vegetable varieties after 3rd year and 12th year storage 單位：%

發(fā)芽勢(%)=(第3天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

發(fā)芽勢及發(fā)芽率測定的時間分別為2009年(初始)，2012年(第3年)和2021年(第12年)。發(fā)芽勢及發(fā)芽率數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件分析(p<0.05)。

1.2.4種子安全保存期的預(yù)測

種子安全保存期為種子生活力下降至需繁種更新發(fā)芽率臨界值所用的時間。通過對發(fā)芽率過往的3次測定，9組數(shù)據(jù)，選擇Sigmoidal函數(shù)進行擬合分析，確定種子活力下降曲線，并通過該曲線推測種子安全保存期(下降至初始生活力85%的時間)、種子保存壽命(種子生活力下降至50%)、種子壽命(生活力完全喪失)所對應(yīng)的時間點，作為種子庫管理及繁種更新的重要依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子入庫的含水量及發(fā)芽率測定

7種特色蔬菜分別來自于石蒜科、菊科、傘形花科等5個科6個屬，僅紫羅羅生菜和大橡葉生菜屬于同一個物種的不同品種類型。所有種子依照本單位種質(zhì)資源庫入庫常規(guī)流程。所有種子初始發(fā)芽率都在80%以上，符合入庫標準。干燥處理后，經(jīng)105 ℃高溫烘干后所測定的種子含水量約為10%，處于種子保存較安全的含水量范圍。

表1 7種蔬菜種子含水量及初始發(fā)芽率Table 1 The seed moisture content and initial germination percentages of 7 vegetable varieties

2.2 種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率的變化

7種蔬菜種子分別在2009年、2012年、2021年進行發(fā)芽試驗的(發(fā)芽勢如表2)。7種特色蔬菜中，5種蔬菜種子的初始發(fā)芽勢達80%及以上，即在第3天，大部分種子發(fā)芽勢已經(jīng)達到80%。

在0 ℃左右低溫庫保存的種子，監(jiān)測3次的發(fā)芽勢數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA分析后發(fā)現(xiàn)，其中有紅莧菜、京水菜、球莖茴香、櫻桃蘿卜等4種蔬菜種子在12年間的3次發(fā)芽勢監(jiān)測數(shù)值差異不顯著(p<0.05)，表明這4種蔬菜種子在12年里的發(fā)芽勢變化不明顯；韭蔥、大橡葉生菜的3次發(fā)芽勢呈下降趨勢，且存在顯著的差異；而紫羅羅生菜3次發(fā)芽勢監(jiān)測中，第3年的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯著小于初始發(fā)芽勢和第12年的發(fā)芽勢，呈“V”型變化。

圖2 7種特色蔬菜種子在0 ℃貯存條件下種子生活力下降趨勢曲線 Fig.2 The predicted viability curve of 7 vegetable varieties under 0 ℃ conditions

圖1 在0 ℃及20 ℃貯藏條件下3次種子生活力監(jiān)測變化Fig.1 The seed germination percentages changes under 0 ℃ and 20 ℃ conditions of 7 vegetable varieties after 3 tests

相比0 ℃保存的種子，在20 ℃左右低溫庫保存的種子監(jiān)測3次的發(fā)芽勢數(shù)據(jù)，僅有2種蔬菜種子在12年里的種子發(fā)芽勢變化不明顯，發(fā)生變化的是京水菜和球莖茴香2種發(fā)芽勢監(jiān)測數(shù)值呈顯著下降趨勢。紫羅羅生菜并未呈現(xiàn)在0 ℃保存時的“V”型變化，而是和大橡葉生菜同樣呈顯著下降趨勢。韭蔥的3次發(fā)芽勢呈現(xiàn)顯著的倒“V”變化，即在2012年的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯著高于初始發(fā)芽勢和2021年測定的數(shù)值，而非在0 ℃保存條件所呈下降趨勢。

7種蔬菜種子在2009年、2012年、2021年3次發(fā)芽試驗中的第7天統(tǒng)計發(fā)芽種子個數(shù)，發(fā)芽率如表3。在12年間的3次發(fā)芽率監(jiān)測整體主要的變化趨勢如圖1，大部分呈現(xiàn)顯著持續(xù)下降，如韭蔥(在0 ℃和20 ℃保存的條件下均呈現(xiàn)發(fā)芽率的顯著變化)、京水菜(0 ℃和20 ℃)、球莖茴香(0 ℃和20 ℃)、紫羅羅生菜(0 ℃和20 ℃)、大橡葉生菜(0 ℃和20 ℃)、櫻桃蘿卜(20 ℃)。僅紅莧菜(0 ℃和20 ℃)、櫻桃蘿卜(0 ℃)為變化無顯著差異。

2.3 安全保存壽命的預(yù)測

種子生活力在貯存過程中隨著時間延長往往呈倒“S”曲線變化。對所試驗特色蔬菜中3次發(fā)芽率監(jiān)測呈現(xiàn)下降趨勢的蔬菜種子存活的變化數(shù)據(jù)進行了擬合Sigmoidal函數(shù)分析，確定相關(guān)參數(shù)，并通過擬合的生活力變化曲線，如圖2，圖3，并通過曲線對種子安全保存期、種子保存壽命及種子壽命的3個關(guān)鍵時間點進行了分析和預(yù)測。

圖2及圖3分別是根據(jù)7種特色蔬菜種子在0 ℃及20 ℃的3次生活力監(jiān)測后所預(yù)測的生活力變化趨勢曲線。從圖中可見，每類種子生活力下降曲線變化均存在一定的差異。由于前期監(jiān)測數(shù)據(jù)的頻次較低，且部分種子的初始發(fā)芽率遠低于100%，所以圖2和圖3中顯示的種子生活力下降曲線的平臺期數(shù)據(jù)位于以年限為橫軸的負半軸中(通過模型計算得出)。隨著貯存年限的增加，種子活力逐漸下降，至每類種子初始發(fā)芽率的85%，即圖中顯示綠色區(qū)域部分；P50為圖中紅色曲線，為種子保存壽命。根據(jù)試驗種子生活力曲線及表4可知，無論在低溫中期庫還是干燥后經(jīng)室溫保存，大部分種子的安全保存期在10～15年間，即在種子貯存第10～15年需要對種子進行繁種更新。有部分種類的種子如韭蔥、球莖茴香生活力下降速度較快，試驗的12年期間已經(jīng)下降至種子保存壽命期限的下限。由于監(jiān)測數(shù)據(jù)有限，部分種子的擬合曲線對種子安全保存期及保存壽命的預(yù)測可能存在差異，后續(xù)監(jiān)測將持續(xù)跟進。

圖3 7種特色蔬菜種子在20 ℃貯存條件下種子生活力下降趨勢曲線 Fig.3 The predicted viability curve of 7 vegetable varieties under 20 ℃ conditions

3 討 論

種子成熟后便不可避免的發(fā)生劣變，然而作為種質(zhì)資源，種子需要在基因庫中保存10年，甚至數(shù)十年?；驇焱ㄟ^低溫、干燥等手段延緩種子的衰老進程，延長種子壽命?？刂瀑A藏溫度和種子含水量是保持庫存種子活力的關(guān)鍵因素。低溫庫保存種質(zhì)資源是一種安全有效的途徑，但是投資大、常年運轉(zhuǎn)費用高，部分研究單位也試圖研究通過降低種子的含水量達到種子在較高含水量且低溫下貯藏相同的效果[7]。在本試驗中，7種特色蔬菜種子分別在0 ℃低溫庫和20 ℃左右室溫的玻璃干燥器中保存。兩組種子在不同溫度下12年的保存過程中種子生活力(發(fā)芽率)的變化趨勢大體一致。盡管兩組種子在不同溫度條件下保存，但由于所有試驗的兩組種子在保存前均充分干燥，并用鋁箔紙袋密封保存于干燥器(桶)內(nèi)，與室外空氣無交換，在后續(xù)第3年和第12年的發(fā)芽率監(jiān)測中，大部分種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢差異不顯著。可能是由于種子均經(jīng)充分干燥并在密封條件下，種子含水量處于較低水平，且保持平衡，種子的生理生化活動在此條件下已經(jīng)處于較弱的水平，溫度對種子的生活力影響較小?？紫檩x[8]曾對幾種蔬菜含水量的研究中也認為，當種子含水量較低時，在-20～40 ℃之間設(shè)置的6種不同溫度條件下均有較好的貯存效果。

在種子貯存的過程中，種子活力隨著貯存時間的變化曲線呈現(xiàn)倒S型，種子從平臺期進入驟降期的拐點為種子活力喪失關(guān)鍵節(jié)點，需要在此階段及時繁種更新，以免種質(zhì)資源的丟失。在種質(zhì)資源庫的管理過程中，需要對種子發(fā)芽率進行定期檢測以確定種質(zhì)資源是否處于該關(guān)鍵節(jié)點。在適宜含水量的密封包裝條件下，水稻和小麥在中期庫中安全保存壽命為17年，在哈爾濱、西寧等地常溫條件下可保存12年[9]。在研究中對種子管理日常常規(guī)操作，對大部分種質(zhì)資源也是往往在第11～12年進行繁種更新。在第12年種子活力監(jiān)測時，部分種子已經(jīng)降至種子安全保存期，處于急需繁種更新階段。可能是由于此批種子入庫前臨時存放不妥導(dǎo)致種子損傷[10]，推測采收后并未經(jīng)干燥處理且處于室溫環(huán)境，入庫初始狀態(tài)處于易劣變的溫濕度狀態(tài)，老化速率加快，縮短了“平臺期”的時間，導(dǎo)致在第12年時種子已處于較低生活力狀態(tài)。

表4 7種蔬菜種子在不同溫度下的種子安全保存期、種子保存壽命、種子壽命Table 4 The predicted seed safe storage period, seed safe storage lifespan and seed lifespan of 7 vegetable varieties under different temperature conditions單位：年

確定每種蔬菜種質(zhì)資源的安全保存期及種子壽命對種子繁種更新，并設(shè)置合理的種子生活力監(jiān)測間隔具有重要的指導(dǎo)意義。FAO所發(fā)布的基因庫管理標準認為，種子監(jiān)測時間間隔應(yīng)設(shè)定為安全保存期的1/3[1]，而每批種子的老化速率隨著貯存時間的變化會因為每批種子的成熟度、含水量、采收的環(huán)境、包裝方式、基因庫中的溫濕度而不一樣。Ellis等[11]研究認為，種子老化模式符合Sigmoidal函數(shù)曲線，研究了種子活力方程，以此研究種子的壽命及預(yù)測種子的活力。Walters等[12]根據(jù)已知初始及最終的發(fā)芽率等數(shù)據(jù)，通過阿夫拉米(Avrami)方程計算種子達到P50的年限。宋超等[9]也通過多年發(fā)芽監(jiān)測數(shù)據(jù)進行Sigmoid擬合。所有對安全保存期及種子壽命只能有一個大致的預(yù)測。本研究采用擬合Sigmoidal函數(shù)的方法對已有數(shù)據(jù)進行分析，獲得了7種蔬菜種質(zhì)資源的生活力曲線，并推算出在不同溫度下的安全保存期及種子保存壽命(P50)。除了韭蔥及球莖茴香的安全保存期僅為一年，且P50約為30年，屬于典型的短命種子外[6]，其他作物的種子經(jīng)干燥后在低溫或室溫條件下，應(yīng)在第10～15年進行繁種更新。而對于韭蔥及球莖茴香等此類蔬菜，需要采取額外的干燥處理或縮短原有固定的繁種更新年限以避免種質(zhì)資源的丟失。