多房棘球蚴歐洲株與中國寧夏株在蒙古沙鼠肝組織內發(fā)育及病理損傷的比較

孫悅翔 ， 張春霞 ， 謝楷東 ， 唐志強 ， 李 靜 ， 張浩吉 ， 黃福強

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院 ， 廣東 佛山 528225 ； 2.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學院 ， 青海 湟源 812100)

多房棘球蚴又稱泡球蚴，為多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis)中絳期幼蟲，主要分布在北半球[1]，在我國主要分布在西部和北部廣大農(nóng)牧地區(qū)，即新疆維吾爾自治區(qū)、青海、甘肅、寧夏回族自治區(qū)、西藏自治區(qū)、內蒙古自治區(qū)和四川等地[2]。

多房棘球絳蟲成蟲長1.2～4.5 mm，形態(tài)與細粒棘球絳蟲相似，但兩者生殖孔開口位置有所不同，細粒棘球絳蟲生殖孔開口于側緣中部偏后，多房棘球絳蟲則開口于側緣的前半部[3]。多房棘球蚴為圓形或卵圓形的囊泡團塊，大小由豌豆到核桃大，囊泡團塊一般由許多大小為0.1～0.7 cm的小囊聚集而成[4-5]。多房棘球蚴病是一種極為重要的人獸共患寄生蟲病，其病原體主要寄生于小型嚙齒類(如田鼠、沙鼠等)動物的肝臟，人因誤食犬排出的蟲卵或被蟲卵污染的食物而偶有感染[4]。

多房棘球蚴的生長特點是彌漫性浸潤，壓迫周圍組織，引起器官萎縮和功能障礙。多房棘球蚴病如同惡性腫瘤一般，還可能轉移到全身各個器官中[5]，俗稱“蟲癌”，再加上它是一種自然疫源性疾病，所以預防與治療都非常困難。本試驗利用不同地理株多房棘球蚴感染蒙古沙鼠，分離肝臟和包囊組織制作組織切片并進行病理組織學觀察，為多房棘球蚴病的病理組織學診斷提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 感染中國寧夏株多房棘球蚴的蒙古沙鼠3只，感染歐洲株多房棘球蚴的蒙古沙鼠3只，空白對照組蒙古沙鼠3只，本試驗用蒙古沙鼠為實驗室自繁自養(yǎng)。

1.2 寄生蟲 由佛山科學技術學院動物寄生蟲實驗室蒙古沙鼠傳代保存的中國寧夏株棘球蚴和歐洲株棘球蚴。

1.3 主要儀器設備 凈化工作臺(SW-CJ-2F)，生物組織包埋機(KD-BM)，電腦生物組織攤、烤片機(KD-T)，石蠟切片機(HM315R)，電熱恒溫干燥箱(GZX-DH.500BS)，徠卡生物顯微鏡(DM3000)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(HDPF-55)。

1.4 主要試劑 各濃度乙醇，二甲苯，石蠟，蘇木精，稀碳酸鋰水溶液，伊紅溶液等。

1.5 試驗方法

1.5.1 試驗分組及處理 參照Spiliotis等[6]和章寧等[7]的方法，將2株蟲株于同一天分別腹腔接種同日齡蒙古沙鼠。試驗組(寧夏株感染組和歐洲株感染組)蒙古沙鼠注射0.5 mL包囊團塊懸液，空白對照組蒙古沙鼠注射0.5 mL PBS緩沖液，沙鼠自由采食，每周固定2次更換墊料、飼料和飲水。接種2個月后對試驗組和空白對照組蒙古沙鼠進行安樂死，剖檢并摘取蒙古沙鼠肝臟，生理鹽水清洗3次，然后用福爾馬林固定48 h后常規(guī)脫水，經(jīng)石蠟包埋，切片備用。對于取樣后的蒙古沙鼠及剩余的包囊團塊進行無害化處理。

1.5.2 蘇木精-伊紅(H.E.)染色 將試驗組和空白對照組蒙古沙鼠肝臟切片放入烤箱中60 ℃烘烤45 min后常規(guī)脫蠟、水化，根據(jù)參考文獻[8]的步驟進行染色：(1)蘇木精染液浸泡5 min；(2)自來水沖洗2 min；(3)1%鹽酸-酒精分化2 s或直至顯微鏡下看到切片呈紅色；(4)自來水沖洗45 s；(5)稀碳酸鋰水溶液藍化30 s；(6)自來水沖洗2 min；(7)80%酒精浸泡5 min；(8)伊紅染色10～20 s。染色完畢后，再將組織切片經(jīng)行常規(guī)脫水、透明和封片。

1.5.3 病理組織觀察 將制作好的試驗組和空白對照組切片放置在顯微鏡(DM3000)下觀察并進行比較分析。

2 結果

2.1 感染模型的建立 建立多房棘球蚴蒙古沙鼠感染動物模型時，寧夏株和歐洲株多房棘球蚴包囊液注射到蒙古沙鼠腹腔后，所注射的蒙古沙鼠在感染2個月后均出現(xiàn)身體消瘦、腹部腫大等臨床癥狀，經(jīng)斷頸法處死并剖檢后發(fā)現(xiàn)，所有注射過歐洲株和寧夏株棘球蚴包囊液的蒙古沙鼠腹腔內均出現(xiàn)大量直徑0.3～2.0 cm的不規(guī)則、圓形、白色、半透明或不透明包囊，且多與肝臟、腸道粘連并浸潤肝臟造成其嚴重萎縮，其他器官均有由包囊產(chǎn)生的不同程度的壓迫。結果表明寧夏株和歐洲株多房棘球蚴均對蒙古沙鼠易感。

2.2 肝臟組織病理學觀察 通過不同倍數(shù)顯微鏡的觀察結果如圖1～3所示，放大50倍時，試驗組與空白對照組相比，肝臟新生血管明顯增多，且寧夏株感染組蒙古沙鼠的新生血管增多更明顯；放大100倍時，試驗組肝組織結構破壞較明顯，竇間隙增寬，且歐洲株感染組肝組織破壞更為嚴重，空白對照組蒙古沙鼠肝組織結構基本正常；放大400倍時，試驗組肝細胞變性腫脹明顯，胞核淡染、膨脹，而空白對照組肝細胞胞核染色清晰。同時觀察還發(fā)現(xiàn)，寧夏株感染組和空白對照組肝細胞胞間均有少量紅細胞浸潤。

圖2 蒙古沙鼠肝臟組織病理學觀察(H.E.染色，100×)

圖3 蒙古沙鼠肝臟組織病理學觀察(H.E.染色，400×)

2.3 不同地理株多房棘球蚴在蒙古沙鼠肝臟中的發(fā)育情況比較 結果如圖4所示，感染歐洲株多房棘球蚴的肝臟組織中可發(fā)現(xiàn)多房棘球蚴生發(fā)層結構清晰，生發(fā)層周圍細胞增生，部分生發(fā)層細胞脫落，且生發(fā)層外圍堆積有纖維樣物質的角皮層，但所觀察視野部分無原頭蚴；感染寧夏株多房棘球蚴的肝臟組織中同樣發(fā)現(xiàn)有清晰的生發(fā)層結構和纖維樣的角質層，在囊壁周圍發(fā)現(xiàn)有育囊及大量的原頭蚴。

圖4 多房棘球蚴在蒙古沙鼠肝臟中發(fā)育情況(H.E.染色)

3 討論

本試驗結果顯示，不論是注射了歐洲株還是寧夏株多房棘球蚴的蒙古沙鼠，在飼養(yǎng)2個月后，蒙古沙鼠體腔中均會出現(xiàn)多房棘球蚴的生長和增殖，生成大量結節(jié)樣包囊團塊(內含微小囊)，這些包囊團塊能不斷生長，侵入肝臟并長期性的侵占、壓迫肝臟，使肝臟發(fā)生變性并逐漸萎縮。已有研究證實，蒙古沙鼠是多房棘球蚴感染的理想模型且多數(shù)實驗室均用蒙古沙鼠對不同地方分離的多房棘球蚴蟲株進行實驗室的感染和傳代[6]。

在對比歐洲株和寧夏株多房棘球蚴時發(fā)現(xiàn)，兩者均可以對蒙古沙鼠肝臟產(chǎn)生相似的寄生蟲性病理損傷，主要表現(xiàn)為2株不同地理株多房棘球蚴寄生后宿主的肝臟都伴隨著新生血管的生成。這些新生的血管是肝臟受多房棘球蚴浸潤性生長的病理性反應，為寄生蟲的生長提供所需營養(yǎng)物質。同時，由于肝臟會受寄生蟲的壓迫和刺激，肝組織結構也開始慢慢變性，肝細胞正常的整齊排列狀態(tài)也開始慢慢瓦解，肝竇間隙增寬，肝細胞在多房棘球蚴寄生的環(huán)境下，開始病理性變性，最終導致細胞核狀態(tài)發(fā)生變化，在H.E.染色中顯示為細胞核淡染。本試驗觀察到感染棘球蚴的蒙古沙鼠肝臟組織學變化情況與周青等[9]及imeková等[10]對小鼠肝臟多房棘球蚴中血管新生與病程發(fā)展的相關性研究結果及論述相符。

雖然歐洲株和寧夏株多房棘球蚴均能引起肝組織的損傷和肝臟新生血管的生成，但通過比較發(fā)現(xiàn)，感染歐洲株多房棘球蚴蒙古沙鼠肝組織結構破壞程度和竇間隙增寬寬度均大于寧夏株，感染寧夏株棘球蚴蒙古沙鼠新生血管要多于歐洲株。說明歐洲株棘球蚴在一定時期內對宿主肝臟損害程度要大于寧夏株，且寧夏株在一定的發(fā)育階段對宿主的營養(yǎng)需求可能高于歐洲株棘球蚴。在對肝臟組織病理損傷觀察的同時，本試驗也對侵染肝臟組織的歐洲株和寧夏株棘球蚴的發(fā)育狀況進行了觀察，發(fā)現(xiàn)感染寧夏株蒙古沙鼠肝臟中的棘球蚴生發(fā)層組織內含大量原頭蚴，但歐洲株未觀察到，提示2株不同地理株多房棘球蚴在腹腔感染模型中的發(fā)育速度和原頭蚴增殖能力不同，且歐洲株感染宿主后包囊團塊大多是由微小囊與宿主組織結合形成，而寧夏株的包囊團塊是由大量含原頭蚴的育囊附著于生發(fā)層以及囊內游離于囊液的微小囊或原頭蚴相結合然后再與宿主組織結合形成。

本試驗在操作過程中蒙古沙鼠處死方式是采用斷頸法，其中空白對照組蒙古沙鼠肝臟切片中也同樣發(fā)現(xiàn)有不同程度的紅細胞游離出血管，浸潤至肝臟組織周圍，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因很可能是蒙古沙鼠斷頸時應激反應較大，導致血管擴張破裂，紅細胞游離。同時，在空白對照組肝臟細胞也出現(xiàn)微小的肝細胞排列不緊密，可能是在組織包埋中，蠟塊融化的溫度過高導致。對于以上這些因素的影響還需做進一步的研究。

雖然目前從基因水平來說對多房棘球蚴的分類還不支持多房棘球絳蟲有不同的種或亞種，且多房棘球蚴各地方分離株線粒體基因差異較小[11]，但通過本試驗發(fā)現(xiàn)，不同地理株的多房棘球蚴在一定時期內對肝臟組織的損傷程度、發(fā)育速度以及原頭蚴的增殖能力會存在一定程度的差異。