4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成研究

黨濟(jì)政 易 莉

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 401331；2.重慶市萬州中心血站檢驗(yàn)科，重慶 404000

糖作為三大營養(yǎng)物質(zhì)之一在人體中承擔(dān)著非常重要的角色，而很多糖苷類化合物具有特殊的生物活性，如抗菌性、抗病毒和抗腫瘤活性[1]。β-半乳糖苷酶是指一類水解含半乳糖苷鍵物質(zhì)的酶類，現(xiàn)今該酶在生物技術(shù)領(lǐng)域如基因工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程等方面也都發(fā)揮著重要作用，并開始廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等領(lǐng)域。β-半乳糖苷類化合物是β-半乳糖苷酶水解的底物，通過該酶-底物水解反應(yīng)過程可測定酶活性，并可將其廣泛用于篩選酶抑制劑類藥物、測定血清酶及免疫分析標(biāo)記酶、監(jiān)測特殊毒害性酶抑制劑等[2]。

4-硝基萘酚、4-硝基苯酚等化合物因在410 nm左右有較強(qiáng)的紫外吸收經(jīng)常被選擇作為顯色團(tuán)。本文初步選擇4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷作為β-半乳糖苷酶的顯色底物，該底物用于β-半乳糖苷酶活性測定等有著廣泛的應(yīng)用前景，因而4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成也具有重要的意義[3]。

糖苷類化合物中含有較多羥基和縮醛結(jié)構(gòu)，一般合成過程都較為復(fù)雜，且產(chǎn)物中存在α 與β 異構(gòu)體，而如何高效地得到單一構(gòu)型的產(chǎn)物一直是糖苷合成中的重點(diǎn)，現(xiàn)常用的糖苷合成方法如磷酸酯糖供體法、三氯乙酰亞胺酯法等操作過程較復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高且得到的產(chǎn)物選擇性不高。本文路線設(shè)計(jì)先將所有羥基?；Ｗo(hù)即以D-半乳糖為起始原料與乙酸鈉反應(yīng)，通過高溫回流乙?；玫礁叨冗x擇性β-D-半乳糖五乙酸酯。β-D-半乳糖五乙酸酯經(jīng)過溴化氫溴代、4-硝基-1-萘酚取代、甲醇鈉去乙?；詈笾亟Y(jié)晶得到目標(biāo)化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷，合成路線見圖1，與常用的方法相比，本研究的合成方法反應(yīng)條件溫和，操作簡便可行且產(chǎn)物選擇性高，是具有應(yīng)用價(jià)值潛力的合成方法路線。因此該研究為β-半乳糖苷酶-底物水解反應(yīng)測定酶活性及之后的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

圖1 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成路線

1 儀器與試劑

1.1 儀器

BS210S 型電子天平（德國賽多利斯公司）；恒奧德HWC-RDY-1B 熔點(diǎn)儀（北京恒奧德儀器儀表有限公司）；Bruker-AV-500 型核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；MicrOTOF QII 高分辨質(zhì)譜（德國Bruker 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52（上海青浦瀘西儀器廠）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）；超純水生成儀（美國Elix MILLIPOER）。

1.2 試劑

4-硝基-1-萘酚（Alfa Aesar，純度≥98%，批號(hào)：10218521）；D-半乳糖、N-溴代琥珀酰亞胺（上海晶純實(shí)業(yè)有限公司，純度≥98%）；液溴、磷（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑，化學(xué)純）；無水乙酸鈉、乙酸酐、乙醇、二氯甲烷、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉、無水碳酸鉀、甲醇鈉（重慶川東化工基團(tuán)有限公司，分析純）；溴化氫溶液、乙醚、石油醚、丙酮、甲醇（成都市科龍化工試劑廠，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 β-D-半乳糖五乙酸酯的合成

將5.0 g（27.8 mmol）D-半乳糖，4.6 g（55.6 mmol）無水乙酸鈉放入100 ml 單口燒瓶。室溫下加24 ml乙酸酐并攪拌溶解，加熱至130℃回流3 h。另取一燒瓶加入200 ml 蒸餾水冷卻至10℃后將反應(yīng)液緩慢倒入，冰浴下攪拌2 h，靜置待反應(yīng)液分層后分離上下層，棄去上清液，下層褐色液體加100 ml 水?dāng)嚢? h，褐色固體逐漸析出。減壓抽濾，并用少量水洗，用乙醇重結(jié)晶，得白色固體7.8 g。經(jīng)測定熔點(diǎn)145℃，為產(chǎn)物β-D-半乳糖五乙酸酯[4]。

2.2 溴代半乳糖四乙酸酯的合成

取“2.1”項(xiàng)下所得的β-D-半乳糖五乙酸酯2 g（5.1 mmol）溶于7 ml 乙酸置于100 ml 單口燒瓶中并攪拌溶解，冰浴條件下待燒瓶內(nèi)溫約10℃時(shí)將33%溴化氫的乙酸溶液2 ml 緩慢滴加，反應(yīng)2 h。向燒瓶內(nèi)加入二氯甲烷50 ml，用飽和碳酸氫鈉溶液洗至中性，在用水洗2 次，有機(jī)層無水硫酸鈉干燥1 h 后抽濾，濾液減壓蒸餾得到褐色固體，該產(chǎn)物用乙醚-石油醚（1∶2）重結(jié)晶，得白色固體1.2 g。熔點(diǎn)80℃，為產(chǎn)物溴代半乳糖四乙酸酯[5-6]。

2.3 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯的合成

取“2.2”項(xiàng)下所得的溴代半乳糖四乙酸酯0.23 g（0.56 mmol）加入50 ml 單口燒瓶中，之后依次加入4-硝基-1-萘酚0.11 g（0.58 mmol）無水碳酸鉀0.08 g，丙酮5 ml，攪拌下58℃回流5 h，反應(yīng)完后冷卻至室溫，減壓蒸餾，剩余殘?jiān)枚燃淄槿芙?，少量飽和碳酸氫鈉溶液洗有機(jī)相，有機(jī)層無水硫酸鈉干燥1 h 后抽濾，濾液減壓蒸餾，得褐色油狀物0.17 g，為產(chǎn)物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯[7-8]。

2.4 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷的合成

取“2.3”項(xiàng)下所得的4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖四乙酸酯0.56 g（1.08 mmol）溶于3 ml 甲醇，加入催化量（200 μl）的1 mol/L 的甲醇鈉的甲醇溶液，室溫?cái)嚢?0 min，靜置反應(yīng)液于0～5℃約8 h，固體析出，抽濾得到濾餅用甲醇/水（3:1）重結(jié)晶，得黃色固體0.19 g，為終產(chǎn)物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷[9-10]。

2.5 結(jié)構(gòu)表征

采用核磁共振（1H-NMR、13C-NMR）和高分辨質(zhì)譜（ESI-HRMS）對終產(chǎn)物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

核磁共振1H-NMR（Brucker Avance 500 MHz）數(shù)據(jù)見下圖2、表1。

圖2 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷核磁共振（1H-NMR）結(jié)構(gòu)表征

表1 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷核磁共振（1H-NMR）解析數(shù)據(jù)

根據(jù)C1 位置氫和C2 位置氫的耦合常數(shù)判斷絕對構(gòu)型是糖苷構(gòu)型確認(rèn)的常用方法[11]。β 構(gòu)型的半乳糖苷其C1 位氫和C2 位氫之間的角接近180°，J1,2耦合常數(shù)較大，常在7～8。而α 構(gòu)型其二面角接近60°，J12 耦合常數(shù)常在2～4。本研究合成的半乳糖苷核磁共振（1H-NMR）C1 位氫（e）和C2 位氫（d）之間的J1,2 為7.5，說明該化合物為β 構(gòu)型。

核磁共振13C-NMR（DMSO，BruckerAvance500MHz）數(shù)據(jù)見下圖3、表2。

圖3 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷核磁共振（13C-NMR）結(jié)構(gòu)表征

表2 4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷（13C-NMR）解析數(shù)據(jù)

高分辨質(zhì)譜結(jié)果顯示，4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷計(jì)算質(zhì)荷比[M+Na]+為374.0846，實(shí)測結(jié)果為374.0848。測定結(jié)果支持該終產(chǎn)物即為化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷。

2.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化與關(guān)鍵試劑的選擇

因?yàn)樘擒债a(chǎn)物存在α 與β 兩個(gè)異構(gòu)體，而乙?；磻?yīng)條件較難控制，溴代反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定。為了得到單一的β 構(gòu)型終產(chǎn)物，故對乙?；弯宕姆磻?yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.6.1 乙?；磻?yīng)條件的選擇 D-半乳糖的乙酰化會(huì)因反應(yīng)溫度影響而產(chǎn)生不同構(gòu)型的異構(gòu)體，α-D-半乳糖五乙酸酯熔點(diǎn)90～95℃與β-D-半乳糖五乙酸酯熔點(diǎn)140～145℃差異較大。而原料D-半乳糖的熔點(diǎn)為165～168℃，兩種異構(gòu)體產(chǎn)物熔點(diǎn)均低于原料D-半乳糖。若反應(yīng)生成了α 異構(gòu)體，則產(chǎn)物會(huì)在90℃左右開始熔融，若反應(yīng)全生成了β 構(gòu)型異構(gòu)體則產(chǎn)物會(huì)在140℃開始熔融。故原料是否反應(yīng)完全即產(chǎn)物中是否存在原料不影響是否生成α 異構(gòu)體的判斷。據(jù)此以產(chǎn)物熔點(diǎn)測定觀察其熔融時(shí)的溫度以確定其中是否存在α 異構(gòu)體。現(xiàn)固定D-半乳糖和乙酸鈉的投料比，以不同的反應(yīng)溫度和時(shí)間為影響因素，以D-半乳糖的消耗和是否產(chǎn)生α 構(gòu)型產(chǎn)物為監(jiān)測指標(biāo)，用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC），以展開劑丙酮/石油醚（3∶10）監(jiān)控反應(yīng)中原料D-半乳糖是否反應(yīng)完全，以熔點(diǎn)儀測定產(chǎn)物初始熔融溫度判斷是否產(chǎn)生了α 異構(gòu)體。對乙?；磻?yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化（表3）。

表3 ?；磻?yīng)結(jié)果

在溫度低于100℃時(shí)不論是延長反應(yīng)時(shí)間還是增加反應(yīng)溫度，原料D-半乳糖均無法完全反應(yīng)且產(chǎn)物中始終存在α 構(gòu)型產(chǎn)物，當(dāng)溫度為100℃時(shí)，反應(yīng)1 h仍存在原料，將反應(yīng)時(shí)間延長至3 h 后監(jiān)控反應(yīng)原料消失反應(yīng)完全，但后處理之后用產(chǎn)物測定熔點(diǎn)后發(fā)現(xiàn)存在α 構(gòu)型異構(gòu)體。后將反應(yīng)溫度增加至130℃回流后反應(yīng)1 hTLC 監(jiān)控仍然存在原料，延長反應(yīng)時(shí)間至3 hTLC 監(jiān)控反應(yīng)完全，再將后處理得到的產(chǎn)物測定熔點(diǎn)發(fā)現(xiàn)其在141℃才開始熔融，說明沒有產(chǎn)生α 異構(gòu)體。綜合考慮后，將反應(yīng)條件設(shè)定為回流溫度130℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h，即為上文“2.1”項(xiàng)中的反應(yīng)條件。

2.6.2 溴代試劑的選擇 在乙酰鹵代糖中鹵原子具有良好的離去性，使糖基有足夠活性可與醇羥基或酚羥基發(fā)生取代反應(yīng)。也因此鹵代糖的穩(wěn)定性較低。而在氟與氯溴相比，以氟代糖的離去性最低，穩(wěn)定性最好。在和4-硝基-1-萘酚的取代反應(yīng)中，因與酚羥基發(fā)生反應(yīng)故應(yīng)選擇活性較高的鹵代糖，本文選擇了活性與穩(wěn)定性均較好的溴代糖基作為中間體。選擇較常用的三種溴代方法對β-D-半乳糖五乙酸酯進(jìn)行溴代反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件參數(shù)見表4，實(shí)驗(yàn)具體操作參考文獻(xiàn)[8,12-14]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)可操作性、經(jīng)濟(jì)性和收率綜合考慮選擇了最適合的溴代方法，收率=B/A×100%。

表4 不同溴代法反應(yīng)條件參數(shù)及收率

三種溴代方法中，液溴-磷溴化收率最高，但液溴有較強(qiáng)的毒性與腐蝕性會(huì)揮發(fā)出有強(qiáng)烈刺激性的煙霧，刺激眼睛和呼吸道的黏膜，對實(shí)驗(yàn)保護(hù)要求很高，且該方法產(chǎn)生雜質(zhì)較多，分離難度大。N-溴代琥珀酰亞胺溴代收率較低，且原料N-溴代琥珀酰亞胺價(jià)格較高。溴化氫的乙酸溶液作溴代法反應(yīng)條件溫和且收率較高。綜合考慮成本與實(shí)驗(yàn)可操作性選擇溴化氫的乙酸溶液作為溴代試劑。

3 討論

本研究以D-半乳糖為原料，與乙酸鈉反應(yīng)，酯化后得到β-D-半乳糖五乙酸酯。β-D-半乳糖五乙酸酯經(jīng)過溴化氫溴代、4-硝基-1-萘酚取代、最終水解除去乙?；僦亟Y(jié)晶得到目標(biāo)化合物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷。經(jīng)核磁共振（1H-NMR、13C-NMR）和高分辨質(zhì)譜（ESI-HRMS）確定了最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。為了得到單一β 構(gòu)型的產(chǎn)物，對關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)乙?；磻?yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推斷出反應(yīng)溫度是產(chǎn)生不同構(gòu)型產(chǎn)物的最關(guān)鍵因素，并根據(jù)原料與兩個(gè)不同構(gòu)型產(chǎn)物的熔點(diǎn)差異定性監(jiān)控是否產(chǎn)生α 異構(gòu)體，與現(xiàn)今常用的高效液相色譜監(jiān)控異構(gòu)體方法相比更加簡單易行?？紤]到溴代糖的穩(wěn)定性較低，在對最常用的三種方法進(jìn)行篩選時(shí)除考慮原材料成本、收率和產(chǎn)生的雜質(zhì)之外，還需要考慮到后處理過程對產(chǎn)物的影響。而用溴化氫乙酸溶液進(jìn)行溴代反應(yīng)不僅成本低條件溫和，而且后處理簡單便捷，更加適合糖類化合物的溴代。

酶聯(lián)免疫吸附測定是利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法，是目前最常用、最經(jīng)典的免疫學(xué)測定方法。而堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶是酶聯(lián)免疫吸附測定中最常用的酶。本文中合成的4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷是β-半乳糖苷酶的底物。在該底物的應(yīng)用研究中，當(dāng)PH 在5.5～7.6 時(shí)4-硝基-1-萘酚在450 nm 的吸收是對硝基苯酚的2.1 倍，是鄰硝基苯酚的9.6 倍[15]。而作為顯色底物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷在弱酸性或者中性條件下對應(yīng)的水解酶活性高于現(xiàn)酶聯(lián)免疫吸附測定常用的顯色底物[16-17]。這使得本研究合成的顯色底物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷有著較廣闊的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。

綜上所述，本研究成功合成了β-半乳糖苷酶的顯色底物4-硝基-1-萘基-β-D-半乳糖苷。反應(yīng)條件溫和，操作簡單，原料廉價(jià)易得。為β-半乳糖苷酶-底物水解反應(yīng)測定酶活性及之后的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。