非小細(xì)胞肺癌癌組織和癌旁組織的環(huán)狀核糖核酸表達(dá)水平與診斷價(jià)值分析

劉成英 農(nóng)雪萍

江西省胸科醫(yī)院病理科，江西南昌 330000

肺癌是臨床常見且嚴(yán)重的惡性腫瘤疾病，該病的診斷率較高、致死率較高，嚴(yán)重危害人類的身體健康[1]。目前有研究表明，環(huán)狀核糖核酸（circular ribonucleic acid，circRNA）能夠明顯表達(dá)出肺癌的進(jìn)展情況，在高通量測(cè)序的不斷更新?lián)Q代下，更多的研究和文獻(xiàn)提出circRNA 通過(guò)異常顯著差異表達(dá)來(lái)表示肺癌的進(jìn)展情況[2]。相關(guān)研究表明circRNA 與細(xì)胞的增殖、侵襲和分化等生物過(guò)程均有一定關(guān)系，因此了解circRNA有作為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）新生物標(biāo)志物的潛能[3]。本研究分析NSCLC 癌組織和癌旁組織的circRNA 表達(dá)水平與診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月至2021年5月江西省胸科醫(yī)院收治的12 例NSCLC 患者的病理組織標(biāo)本，采集的標(biāo)本需要經(jīng)過(guò)冰凍切片處理，通過(guò)組織HE 染色表現(xiàn)出癌細(xì)胞占比≥70%；選取病理組織外側(cè)5 cm 位置癌旁組織作為對(duì)照樣本，該標(biāo)本中癌細(xì)胞占比應(yīng)為0，通過(guò)免疫組化ABC 染色顯示陰性。其中男8 例，女4 例；平均年齡（62.64±7.62）歲；鱗癌7 例，腺癌5 例；TNM 分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期5 例，Ⅲ期2 例；分化程度低度8 例，中度4 例；吸煙或戒煙患者7 例，不吸煙患者5 例。收集同期47 例NSCLC 患者與47 例健康體檢者血清，予以檢測(cè)血清circRNA。NSCLC 患者中，男34 例，女13 例；平均年齡（61.52±6.45）歲。健康體檢者中，男33 例，女14 例；平均年齡（61.38±6.67）歲。NSCLC 患者與健康體檢者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。受試者或家屬簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②NSCLC 患者經(jīng)過(guò)病理診斷確診[4]；③術(shù)前血常規(guī)、心電圖、肝功、腎功全面檢查后均符合手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)；④健康人員無(wú)癌癥病史及家族史、無(wú)放化療史，可配合完成血清circRNA 檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不全者；②TNM 分期不明確者；③合并其他惡性腫瘤者；④術(shù)前進(jìn)行放化療治療患者；⑤治療、檢查依從性差者；⑥健康人員檢查相關(guān)功能存在異常，有血清circRNA 檢查禁忌。

1.2 方法

1.2.1 癌組織和癌旁組織檢測(cè) ①應(yīng)用TRIzol 試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientife 公司）提取12 例患者癌組織和癌旁組織的總RNA，將RNA 置于230、260、280 nm 位置，測(cè)量吸光度數(shù)值，對(duì)濃度及純度進(jìn)行測(cè)算和評(píng)估。使用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法測(cè)量RNA 的純度和完整性。②應(yīng)用RNaseR（美國(guó)Epicentre 公司）排出組織中總RNA 的線性RNA。應(yīng)用Super RNA Labeling（美國(guó)Arraystar 公司）將RNA 當(dāng)中的cDNA 予以擴(kuò)增并顯示熒光。③排列雜交已經(jīng)染色的組織與Human circRNA Array V2（8×15K）芯片（美國(guó)Arraystar 公司），在清洗液試劑盒（美國(guó)Agilent公司）中徹底清洗。④使用circRNA 芯片（中康博生物科技公司）予以檢測(cè)、收錄圖像、處理數(shù)據(jù)等干預(yù)，

1.2.2 血清檢測(cè) 采集NSCLC 患者及健康體檢者清晨空腹肘靜脈血5 ml，進(jìn)行離心處理，貯存血清備用。隨后使用TRIzol LS 試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientife 公司）提取血清中的總RNA。利用分光光度計(jì)測(cè)量RNA 濃度。將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA 進(jìn)行熒光定量PCR。circRNA 引物為正向引物（F）：ACGAGGCATGGCCAAGATTT，反向引物（R）：TTGATACTAGAGCCCGCTGCC；GAPGH 正向引物F：GAGT CAACGATTTGGTCGT，反向引物（R）：GACAAGCTTCGCGTTCTCAG。引物序列設(shè)計(jì)和合成廠家為Cellcook（中國(guó)廣州）。circRNA 的相對(duì)表達(dá)數(shù)值使用2-ΔΔCt表示。試驗(yàn)次數(shù)=3。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

circRNA 癌組織和癌旁組織異常表達(dá)；circRNA聚類分析；血清circRNA 表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性；NSCLC 的circRNA 診斷價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)；使用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析NSCLC 患者血清circRNA 的診斷價(jià)值，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）；利用G2505c 基因芯片掃描儀（美國(guó)Agilent 公司）掃描組織熒光情況，使用Agilent Feature software 軟件分析數(shù)據(jù)，在R 平臺(tái)上統(tǒng)一數(shù)據(jù)類型，篩選表達(dá)異常的circRNA，制作出火山圖，隨后進(jìn)行聚類分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circRNA 癌組織和癌旁組織異常表達(dá)

在R 平臺(tái)當(dāng)中，通過(guò)DESeq2 軟件共篩選出癌組織和癌旁組織中表達(dá)差距明顯的circRNA 共194 個(gè)（癌組織表達(dá)水平：癌旁組織表達(dá)水平≥2 或≤-2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。制作出火山圖（圖1，封四），其中121 個(gè)顯示上調(diào)（紅色部分），73 個(gè)顯示下調(diào)（藍(lán)色部分）。

2.2 citcRNA 聚類分析

通過(guò)對(duì)癌組織和癌旁組織的標(biāo)本中circRNA 的表達(dá)數(shù)量大小不同進(jìn)行聚類分析，癌組織及癌旁組織的circRNA 表達(dá)量不同，circRNA 能夠清晰分辨NSCLC 癌組織和癌旁組織。繪制聚類分析圖，紅色表示circRNA 表達(dá)量相對(duì)高，綠色表示表達(dá)量相對(duì)低（圖2，封四）。

2.3 血清circRNA 表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性

不同性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分化、病理類型、癌癥分期NSCLC 患者的circRNA 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 血清circRNA 表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性（±s）

表1 血清circRNA 表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性（±s）

注 circRNA：環(huán)狀RNA

臨床特征例數(shù)circRNAt 值P 值性別0.066 0.947男女34 13 2.95±0.52 2.94±0.24年齡（歲）≤60＞60吸煙情況吸煙或戒煙不吸煙腫瘤分化中高度分化低分化病理類型鱗癌腺癌癌癥分期Ⅰ～Ⅱ分期Ⅲ～Ⅳ分期0.418 0.678 16 31 3.04±0.56 2.96±0.65 1.777 0.082 25 22 3.06±0.24 2.87±0.47 0.542 0.590 31 16 2.97±0.56 2.87±0.67 0.885 0.381 26 21 3.04±0.56 2.88±0.68 0.598 0.553 28 19 2.98±0.65 2.87±0.57

2.4 血清circRNA 診斷NSCLC 的效能

NSCLC 患者的血清circRNA 表達(dá)水平高于健康體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.676，P＜0.001）。ROC曲線（圖3）顯示，血清circRNA 診斷NSCLC 的靈敏度為82.98%，特異度為61.70%，AUC=0.795（95%CI：0.682～0.879）。

圖3 血清circRNA 診斷NSCLC 的ROC 曲線圖

3 討論

隨著人口增長(zhǎng)、環(huán)境變化，肺癌的發(fā)病率與死亡率也在不斷升高，即便目前針對(duì)肺癌有最新研究的靶向治療和相關(guān)的免疫療法，但是患者的五年生存率依舊難以提升[5-6]。circRNA 是一類不具備5’末端帽子和3’末端poly（A）尾巴，內(nèi)含共價(jià)鍵構(gòu)成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA 分子[7-8]。circRNA 能夠代表一類新類型的保守內(nèi)源RNA，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物基因表達(dá)的作用[9]。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC 患者癌組織和癌旁組織的異常表達(dá)的circRNA 中有121 個(gè)上調(diào)，73 個(gè)下調(diào)，提示circRNA 可能具有促進(jìn)癌癥發(fā)生和進(jìn)展的效果。通過(guò)聚類分析來(lái)分辨癌組織和癌旁組織，可在一定程度上發(fā)揮補(bǔ)充火山圖的優(yōu)勢(shì)[10-11]。此外，本研究結(jié)果還顯示，NSCLC 癌組織和癌旁組織的在circRNA表達(dá)方面存在一定差異，故能夠借助血清circRNA 對(duì)NSCLC 進(jìn)行診斷，通過(guò)血清circRNA 對(duì)NSCLC 診斷的ROC 曲線圖可見，血清circRNA 診斷NSCLC 的靈敏度為82.98%，特異度為61.70%，AUC=0.795（95%CI：0.682～0.879），提示血清circRNA 具有較高的診斷價(jià)值。

本研究推測(cè)circRNA 會(huì)促進(jìn)疾病進(jìn)展，并且通過(guò)癌組織的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行證明，其可信度較高。circRNA的來(lái)源主要是組織細(xì)胞壞死調(diào)往后，會(huì)通過(guò)囊泡釋放到血液當(dāng)中，產(chǎn)生循環(huán)游離的RNA，因此血清circRNA 的水平高，并且血清中的囊泡存在circRNA 的富集，因此circRNA 在癌組織以及血清當(dāng)中的表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性，今后可針對(duì)血清circRNA 的來(lái)源進(jìn)行進(jìn)一步探究[11-13]。因此在對(duì)NSCLC 患者進(jìn)行診斷的過(guò)程中，可以通過(guò)檢測(cè)血清circRNA 進(jìn)行無(wú)創(chuàng)檢查，可能會(huì)提高診斷的準(zhǔn)確性[14]。血清circRNA 表達(dá)水平與患者臨床指標(biāo)相關(guān)性的結(jié)果顯示，不同性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分化、病理類型、癌癥分期NSCLC 患者的circRNA 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），原因可能是病例數(shù)過(guò)少，或者病例選擇存在偏頗[15]。

綜上所述，circRNA 在NSCLC 癌組織和癌旁組織的表達(dá)具有明顯不同，利用血清circRNA 診斷NSCLC 的準(zhǔn)確率較高，circRNA 水平可能在一定程度上體現(xiàn)病情。