超聲波輔助獼猴桃蛋白酶對毛肚的嫩化效果研究

熊乙帆，王曉瓊，李明元

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 610039）

毛肚即牛胃，特指牛胃部中的第3 個間隔瓣胃[1]，作為牛的副產(chǎn)物，經(jīng)過加工后其“脆嫩化渣”的口感受到廣大消費者的喜愛，與毛肚的加工方式相關(guān)的研究具有廣闊的發(fā)展?jié)摿2?3]。同時，毛肚中含有豐富的營養(yǎng)如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素及Ca、P、Fe 等[4?5]。因未處理的毛肚生硬難嚼[6]，對毛肚進(jìn)行合理的嫩化處理是必要的工序，同時為了滿足消費者對健康食品日益增長的需求,相比傳統(tǒng)的堿法嫩化，酶法嫩化是目前探究的主要方向。

目前市面上已經(jīng)廣泛應(yīng)用了食品級NaOH 嫩化毛肚，該方法雖簡單實用；但會使毛肚的營養(yǎng)成分嚴(yán)重流失，且毛肚會因為過度腐蝕而失去骨骼強度[7?9]，并且NaOH 對人體健康有一定的損害。近幾年興起的蛋白酶處理毛肚正慢慢受到消費者的信賴。木瓜蛋白酶作為主要的外源酶已被廣泛地應(yīng)用[10?12]，木瓜蛋白酶因價格低廉使其成為酶嫩化毛肚的主要嫩化劑。獼猴桃蛋白酶是最近興起的新型肉類嫩化劑。王海麗等[13]研究表明，軟棗獼猴桃蛋白酶能顯著改善牛肉的嫩度。Aminlari 等[14]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃蛋白酶顯著提高了牛肉的氮溶指數(shù)并增強了其保水性能。Toohey 等[15]研究表明，通過注射獼猴桃蛋白酶溶液，能顯著降低牛肉剪切力，并具有更低的紅度值。Han 等[16]研究發(fā)現(xiàn)在羔羊胴體中注入獼猴桃汁后，增強了蛋白水解活性，顯著降解了肌原纖維蛋白。此外，超聲波作為新興的嫩化輔助措施已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。Bilek 等[17]綜述了超聲波的空化氣泡對肉類溶酶體的破壞，使肌原纖維蛋白受到破壞，以此降低肉的剪切力。Dickens 等[18]研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理過的雞胸肉剪切值顯著低于水對照組的剪切值。李蘭會等[19]研究發(fā)現(xiàn)40 kHz，功率1 000 W，強度1.33 W/cm2的超聲波水浴處理，明顯提高了宰后山羊肉塊的嫩化速率，可使山羊肉提前3 d 成熟，硬度降低，彈性升高。楊性民等[20]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波能顯著改善蝦干的嫩度并較好地保持了蝦干的營養(yǎng)成分，降低氨基酸含量，顯著減少蝦干剪切力。

關(guān)于超聲波輔助酶對肉類進(jìn)行嫩化的研究[21?22]目前已有報道。王清波等[21]研究表明，超聲波與木瓜蛋白酶有較強的協(xié)同作用，能顯著降低牛肉剪切力49.0%，縮短嫩化時間。師文添等[22]研究表明，超聲波與復(fù)合蛋白酶能顯著改善生鮮豬肉的嫩度。但是超聲波與獼猴桃蛋白酶協(xié)同嫩化毛肚的研究尚未報道。綜上所述，超聲波輔助獼猴桃蛋白酶具有廣闊的發(fā)展前景，本文通過比較木瓜蛋白酶、獼猴桃蛋白酶、NaOH 溶液在超聲波輔助下對毛肚剪切力、蒸煮損失率的影響，并探究不同獼猴桃蛋白酶用量、處理溫度、超聲波功率對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響，以期為毛肚嫩化技術(shù)提供參考，同時也有助于推動毛肚產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的毛肚購于成都海霸王市場，?18 ℃以下配送，符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，購買后，貯藏在?18 ℃凍庫。

獼猴桃蛋白酶（300 U/mg），上海麗臣商貿(mào)有限公司；木瓜蛋白酶（300 U/mg），南寧龐博生物工程有限公司；食品級NaOH，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8 恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市瑞華儀器有限公司；LC-SY5001 型電磁爐，佛山市順德區(qū)韓泰電器有限公司；TA-XT PLUS 型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems 公司；VS22-80AA 型超聲波清洗儀，無錫沃信儀器制造有限公司；PHSJ-6L 型pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 毛肚預(yù)處理

將毛肚從?18 ℃冷凍室取出，在0～4 ℃條件下進(jìn)行解凍至毛肚中心溫度達(dá)到0 ℃以上，去除掉毛肚表面雜質(zhì)，并用小刀刮去毛肚外部的脂層薄膜，洗凈，順著毛肚的肌纖維方向?qū)⑵淝谐? cm×6 cm×6 cm 的毛肚片，然后將其置于沸水鍋中燙煮30 s 進(jìn)行定型，撈出冷卻至室溫，用濾紙吸干毛肚表面水分，切成5 g 小片，待用。

1.3.2 超聲波輔助下不同嫩化劑對毛肚剪切力、蒸煮損失率的影響

分別將5 g 毛肚放入200 mL，25 ℃，0.6%獼猴桃蛋白酶溶液、0.6%木瓜蛋白酶溶液、0.6%NaOH溶液中浸泡，根據(jù)已有文獻(xiàn)[6，9，12，22]固定酶處理時間為30 min，然后將浸泡液和毛肚裝入13 cm×19 cm的高溫蒸煮袋中抽真空，再進(jìn)行40 kHz、300 W 超聲波水浴處理15 min 后撈出。對處理后的毛肚進(jìn)行剪切力、蒸煮損失率測定，平行測定3 次，取平均值，分組采用水作為空白對照組C、獼猴桃蛋白酶組T1、木瓜蛋白酶組T2、NaOH 溶液組T3，比較幾種處理方式對毛肚嫩化效果的影響。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)的測定

將毛肚切成20 mm×20 mm×20 mm 的切塊，分成3 組，每組取10 個平行樣品，使用TA-XT PLUS型質(zhì)構(gòu)儀采用HDP/BSK 探頭對剪切力進(jìn)行測定，采用TA36 探頭測定硬度、咀嚼型、彈性。設(shè)置參數(shù)：測前及測后速度為3 mm/s，測中速度為1 mm/s，壓縮樣品高度80%，時間2 s，觸發(fā)類型自動，觸發(fā)力5 g，平行測定3 次，取平均值。

1.3.4 蒸煮損失的測定

參照GB 5009.3—2016 食品中水分的測定相關(guān)操作，將嫩化處理后的毛肚分成3 組，每組取10 個平行樣品，對蒸煮過程中流出的汁液進(jìn)行分析。用總流出液表示蒸煮損失，損失率越低表示保水性越好，蒸煮前稱重得m1，蒸煮后瀝干流出液稱重得m2，計算蒸煮損失率R，見式(1)。

式中：R為蒸煮損失率；m1為蒸煮前質(zhì)量；m2為蒸煮后瀝干流出液質(zhì)量。

1.3.5 超聲波輔助獼猴桃蛋白酶嫩化毛肚實驗

1.3.5.1 超聲波輔助下不同獼猴桃蛋白酶用量對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

將預(yù)處理后的毛肚放入20 ℃獼猴桃酶溶液中浸泡30 min，調(diào)節(jié)酶用量分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，再放入40 kHz、50 W 超聲波清洗儀中進(jìn)行水浴處理15 min。

1.3.5.2 超聲波輔助下不同處理溫度對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

將預(yù)處理后的毛肚放入0.5%獼猴桃蛋白酶溶液中浸泡30 min，調(diào)節(jié)溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，再放入40 kHz、50 W 超聲波清洗儀中進(jìn)行水浴處理15 min。

1.3.5.3 不同超聲波功率對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

將預(yù)處理后的毛肚放入50 ℃，0.5%獼猴桃蛋白酶溶液中進(jìn)行浸泡30 min，調(diào)節(jié)超聲波處理功率分別為0、50、100、150、200、250、300 W，頻率40 kHz 的超聲波進(jìn)行水浴處理15 min。

1.3.6 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

組間數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 軟件中的One-way ANOVA 程序，顯著水平為0.05，當(dāng)P＜0.05 時差異顯著，結(jié)果以（a、b、c）表示，不同字母表示有顯著差異性。試驗數(shù)據(jù)采用Origin8.5 進(jìn)行統(tǒng)計并繪圖。所有實驗重復(fù)兩次。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助下不同嫩化劑對毛肚剪切力及蒸煮損失率的影響

由圖1 可知，超聲波輔助下獼猴桃蛋白酶、木瓜蛋白酶、NaOH 溶液對毛肚剪切力、蒸煮損失率影響均顯著（P<0.05），NaOH 溶液處理下剪切力達(dá)到最低值12.1 N，但NaOH 溶液處理后的毛肚蒸煮損失遠(yuǎn)大于對照組（P<0.05），蒸煮損失率達(dá)到67.2%。李凜等[3]研究表明NaOH 溶液通過破壞毛肚內(nèi)部組織使毛肚吸入大量水分以提高嫩度，因此NaOH溶液的過度腐蝕會導(dǎo)致毛肚保水性嚴(yán)重下降，使其蒸煮后水分大量流失，與實際生活中堿發(fā)毛肚經(jīng)漂燙后縮水嚴(yán)重、口感較差現(xiàn)象相符。同時，NaOH本身作為一種強堿對人體健康有一定損害。獼猴桃蛋白酶相比木瓜蛋白酶具有更大剪切力影響（P<0.05），比對照組下降了33%。Kamphuis 等[23]研究表明，獼猴桃蛋白酶具有較好的結(jié)締組織溶解效率，而毛肚作為內(nèi)臟，其結(jié)締組織占比較高，因此嫩化效果更好。同時，獼猴桃蛋白酶與木瓜蛋白酶同屬植物半胱氨酸蛋白酶，具有相似的組成序列和作用方式[12]；因此均降低了毛肚的蒸煮損失率，而獼猴桃蛋白酶相比木瓜蛋白酶使毛肚的蒸煮損失率更小（P<0.05），更好地保留了毛肚中的水分，蒸煮損失率達(dá)到最低值17.8%。黃彩燕等[12]研究表明，獼猴桃蛋白酶具有高度專一性，能夠提高肉類嫩度，并具有一定的保水性。周珠法等[24]等研究表明，木瓜蛋白酶能顯著提高牛肉的持水力，降低烹飪失水率。明建等[25]研究表明，蛋白酶處理顯著降低了牛肉蒸煮損失率、剪切力、咀嚼性、彈性等物性指標(biāo)。

圖1 超聲波輔助下不同嫩化劑對毛肚剪切力、蒸煮損失的影響

綜上所述，超聲波輔助下獼猴桃蛋白酶處理的毛肚剪切力較小，保水性更好，嫩化效果明顯，所以選擇其進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 超聲波輔助獼猴桃蛋白酶嫩化毛肚實驗

2.2.1 超聲波輔助下不同獼猴桃蛋白酶用量對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

由表1 可知，當(dāng)獼猴桃蛋白酶用量在0%～0.1%時，毛肚剪切力、硬度、彈性未發(fā)生顯著性變化（P>0.05），說明低含量獼猴桃蛋白酶對毛肚質(zhì)構(gòu)影響不大；隨著獼猴桃蛋白酶用量的增加，剪切力、硬度和咀嚼性變小，彈性變大，毛肚的質(zhì)構(gòu)得到顯著優(yōu)化（P<0.05）。王清波等[21]研究表明酶使牛肉肌肉組織的細(xì)胞膜受壓破壞，使Ca2+離子釋放，激活鈣激活蛋白酶使蛋白質(zhì)水解，肌肉及肌肉組織間連接被破壞，彈性和嫩度增加。當(dāng)獼猴桃蛋白酶用量在0.6%時毛肚質(zhì)構(gòu)指標(biāo)大幅度下降，相比0.5%時平均下降27.13%，可能是由于在獼猴桃蛋白酶用量大于0.5%時，毛肚內(nèi)肌原細(xì)胞結(jié)構(gòu)被大幅度破壞，細(xì)胞間質(zhì)大量流出，導(dǎo)致口感嚴(yán)重下降。

表1 超聲波輔助下不同酶用量對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

綜上所述，當(dāng)獼猴桃蛋白酶用量為0.5%時，毛肚質(zhì)構(gòu)屬性最佳，因此選擇0.5%進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.2 超聲波輔助下不同處理溫度對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

由表2 可知，當(dāng)溫度在20～50 ℃時，隨著溫度的升高，毛肚的剪切力、硬度和咀嚼性變小,彈性變大，質(zhì)構(gòu)得到顯著優(yōu)化（P<0.05），可能是因為隨著溫度的升高，獼猴桃蛋白酶的酶活力得到進(jìn)一步釋放，促進(jìn)了酶處理效率；當(dāng)溫度在50～70 ℃時，隨著溫度的升高毛肚剪切力顯著上升（P<0.05），質(zhì)構(gòu)指標(biāo)變差，口感下降。Han 等[16]研究表明，獼猴桃蛋白酶在高溫條件下變性失活，羊肉肌纖維收縮加劇，細(xì)胞間隙減小，彈性下降。

表2 超聲波輔助下不同處理溫度對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

綜上所述，當(dāng)溫度為50 ℃時，毛肚剪切力最小，硬度、咀嚼性較小，彈性較大，因此選擇50 ℃進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.3 不同超聲波功率對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

由表3 可知，當(dāng)超聲波功率在0～50 W 時，毛肚質(zhì)構(gòu)指標(biāo)變化不顯著（P>0.05），可能是因為低功率超聲波無法穿透毛肚外表層，無法有效作用于毛肚內(nèi)部肌原纖維；隨著功率的升高，毛肚剪切力、咀嚼性、彈性都得到顯著優(yōu)化（P<0.05）。Dickens 等[18]研究表明，超聲波能破壞雞胸肉肌原纖維蛋白、結(jié)締組織、溶酶體，剪切力和咀嚼性下降。由表3可知，超聲波對毛肚的硬度影響不顯著（P>0.05），可能與超聲波的作用機制有關(guān)，空化效應(yīng)無法改變毛肚外表層硬度，具體原理待驗證。當(dāng)功率在300 W 時，毛肚剪切力、咀嚼性顯著上升（P<0.05），彈性顯著下降（P<0.05），導(dǎo)致口感嚴(yán)重下降。這與師文添等[22]的研究結(jié)論相符。他們發(fā)現(xiàn)超聲波同酶對嫩化生鮮豬肉有一定協(xié)同作用，但超聲波功率過高會破壞酶結(jié)構(gòu)，使其活性降低，嫩化效果下降。

表3 不同超聲波功率對毛肚質(zhì)構(gòu)的影響

綜上所述，當(dāng)超聲波功率為250 W 時，毛肚質(zhì)構(gòu)屬性最佳，因此選擇250 W 作為最佳功率。

3 結(jié)論

超聲波輔助下NaOH 溶液、獼猴桃蛋白酶、木瓜蛋白酶均使毛肚剪切力顯著下降（P<0.05），NaOH 溶液處理下剪切力達(dá)到最低值12.1 N；但是NaOH 溶液使毛肚蒸煮損失率高達(dá)67.2%，且嚴(yán)重影響漂燙后毛肚的品質(zhì)與口感。獼猴桃蛋白酶相比木瓜蛋白酶對剪切力的影響更大（P<0.05），相比對照組下降了33%，嫩化效果明顯。同時，獼猴桃蛋白酶使毛肚蒸煮損失率降低，具有一定保水性，因此超聲波輔助獼猴桃蛋白酶效果最佳。超聲波輔助獼猴桃蛋白酶處理毛肚的最佳條件是獼猴桃蛋白酶用量0.5%、溫度50 ℃、超聲波功率250 W，此條件下毛肚質(zhì)構(gòu)屬性最佳，口感最好。本實驗結(jié)果證實，超聲波輔助獼猴桃蛋白酶對毛肚的嫩化效果顯著，同時可以提高毛肚的保水性、減少蒸煮損失，提高口感，可作為一種新型的毛肚嫩化技術(shù)。