花椒麻素對SD 大鼠肥胖模型脂代謝的影響

張晉森，蘭 林，汪晟羽，吳 韜，何金華，蘇 婷，江龍豐，李玉鋒

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 610039）

藤椒（Zanthoxylum armatum DC），又名竹葉花椒，在我國西南及周邊地區(qū)廣泛種植，具有良好的食藥兩用價值[1]。藤椒主要由揮發(fā)油、生物堿、酰胺類等多種化學(xué)物質(zhì)構(gòu)成[2]，其中酰胺類成分是其主要麻味物質(zhì)，又稱為花椒麻素[3?4]。相關(guān)文獻(xiàn)[5?7 ]表明，花椒麻素具有抑菌、降脂、祛風(fēng)除濕、殺蟲及鎮(zhèn)痛等多種生物學(xué)活性。

心腦血管疾病是目前全世界范圍內(nèi)危害人類生命健康的首要威脅[8]，其中冠心病占比達(dá)34 %[9]，而由脂代謝紊亂引起的肥胖癥、高脂血癥是冠心病的主要誘因[10?12]。目前，有關(guān)脂代謝紊亂的研究[13?14]較多，但關(guān)于花椒麻素對體內(nèi)脂代謝調(diào)節(jié)作用的報(bào)道偏少。本文旨在研究花椒麻素對肥胖癥模型SD 大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝功能的影響，為藤椒防治糖脂代謝性疾病的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼料

SPF 級雄性SD 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量140～160 g，實(shí)驗(yàn)動物來自四川省達(dá)碩動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2020?030。飼喂用指定條件飼料和水，環(huán)境溫度保持在18～26 ℃，相對濕度為30%～70%。所有的動物實(shí)驗(yàn)按照國家科技委員會指定的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

大鼠基礎(chǔ)飼料配方：粗蛋白18.5%，粗脂肪5%，粗纖維3%，粗灰分5.5%，鈣1%，總磷0.78%。高脂飼料配方：粗蛋白≥180 g/kg，粗脂肪≥40 g/kg，粗纖維≤50 g/kg，粗灰分≤80 g/kg，鈣10～18 g/kg，總磷6～12 g/kg。材料由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要試劑及設(shè)備

甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒、總膽固醇(total cholesterol,TC)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)試劑盒由上?？祈樕锾峁?；非諾貝特由成都化夏化學(xué)試劑有限公司提供；花椒麻素樣品（藤椒原料）由四川省巴中市平昌縣藤椒種植示范基地提供。提取方法參照羅凱等[15]的方法并略作修改。

主要儀器與設(shè)備：移液器Finnpipette；洗板機(jī)Tianshi；酶標(biāo)儀Rayto，型號RT-6100。微量高速離心機(jī)（國產(chǎn)），儀器型號TG16W；臺式高速冷凍離心機(jī)，型號TGL16M；恒溫?fù)u床，型號HT-111B；電子分析天平，型號AE1204（國產(chǎn)）；電子分析天平，型號XB220A；81-2 恒溫磁力攪拌器；EasyWeLL 系列細(xì)胞破碎儀，型號JY98-IIIN；臺式高速冷凍離心機(jī)Therm 公司，型號ST16R；日本SANYO,型號MDFU32V 超低溫冰箱；電子天平，型號YP601N。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 主要試劑的配制

將用于灌胃的花椒麻素樣品與食用大豆油按照1 mL/100 g 大鼠體質(zhì)量灌胃量劑量配制成1 mg/mL的花椒麻素溶液。將非諾貝特按照20 mg/mL 的劑量與大豆油配制成非諾貝特溶液。

1.3.2 動物造模與實(shí)驗(yàn)

選取48 只體質(zhì)量均為140～160 g 的8 周齡的健康雄性SD 大鼠飼養(yǎng)在通風(fēng)良好，室溫（24±1）℃，相對濕度48%～58%，12 h/12 h 模擬光照交替的環(huán)境中，自由采食。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將體質(zhì)量相近大鼠隨機(jī)分為6 組。分別為普通飼料對照組（BC 組）、高脂飼料模型組（MC 組）、花椒麻素低/中/高劑量組（LD/MD/HD 組）、非諾貝特陽性對照組（AC 組）。BC 組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，余下所有組別均采用高脂飲食。每日下午13：10～14：10 對低、中、高劑量組大鼠按劑量灌胃4/8/12 mg/(kg?BW)經(jīng)大豆油混合的花椒麻素，BC 組和MC 組大鼠灌胃等量的大豆油，AC 組使用非諾貝特溶解液按照40 mg/(kg? BW)劑量灌胃，灌胃6 周。

1.3.3 樣品收集與前處理

實(shí)驗(yàn)開始至第6 周結(jié)束，大鼠通過摘取眼球收集血液后脊椎脫臼處死，將血液收集于裝有抗凝劑的采血管中，并立即在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心15 min，將血清提取收集于離心試管中并置于?78 ℃冰箱保存。完成血液采集后，解剖大鼠，取出大鼠肝臟并使用低溫生理鹽水沖洗，洗去表面血水后擦拭除去表面水漬，精密稱取肝臟總質(zhì)量，取1.5～2.5 g 肝臟放入樣品袋貯存于?78 ℃冰箱中留樣。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 飼料效率的測定

記錄大鼠的初質(zhì)量、末質(zhì)量及采食量，計(jì)算實(shí)驗(yàn)動物飼料效率。

1.3.4.2 血脂指標(biāo)的測定

將1.3.3 分離得到的血漿置于冰上，待完全解凍后,按照相關(guān)試劑盒操作說明，采用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠血脂指標(biāo)水平，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TG、TC、LDL-C 及HDL-C 含量。按照Cai 等[16?17]的方法，計(jì)算測定大鼠血脂綜合指數(shù)（LCI）與動脈粥樣硬化指數(shù)（AI）。

1.3.4.3 肝臟指標(biāo)的測定

肝臟中總脂含量采用Folch 等[18]的方法進(jìn)行測定。本文按照相關(guān)試劑盒操作說明測定肝臟中甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）的含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以mean±SD 的形式表示，數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA 分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P<0.05 表示有顯著性差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件使用IBM SPSS Statistics 26。

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒麻素對大鼠體質(zhì)量、采食量及飼料效率的影響

實(shí)驗(yàn)造模共用7 周，實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠毛色光滑，活動正常，生長正常，無死亡及活動病態(tài)等現(xiàn)象。初始各組大鼠初始體質(zhì)量相近，個體差異小。各組大鼠體質(zhì)量隨實(shí)驗(yàn)周期的進(jìn)行，逐漸增加，符合其正常生長規(guī)律。模型組質(zhì)量變化顯著高于普通飼料組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，MC 組大鼠體質(zhì)量顯著超過BC 組，說明長時間高脂飲食對大鼠體質(zhì)量有顯著的促進(jìn)作用。在對大鼠分別使用不同劑量的花椒麻素過后，大鼠體質(zhì)量增長趨勢逐漸變慢。與MC 組相比，分別采用低中高不同劑量的花椒麻素飼喂較長時間后，大鼠增重趨勢緩和，但體質(zhì)量無顯著差異(P<0.05)。

表1 中，相較于BC 組，MC 組采食量下降，飼料效率顯著上升(P<0.05)，這與高脂飼料中的配方有關(guān)。高脂膳食有大量脂肪蛋白，容易引起大鼠獲得飽腹感，進(jìn)而采食減少。BC 組采食量最高，采食效率最低。AC 組采食效率最接近BC 組，采食量最低，平均增重最少。相比于MC 組，飼喂低劑量花椒麻素對LD 組采食量影響不明顯，但MD 組、HD組大鼠采食效率隨花椒麻素劑量的提升增重減少，飼料效率降低(P<0.05)。

表1 花椒麻素對采食量、體重變化量和飼料效率的影響

相比MC 組大鼠，AC 組大鼠與各劑量組大鼠的采食效率均顯著減少，AC組大鼠采食量相對減少而花椒麻素組大鼠采食量顯著增加，并且與花椒麻素劑量呈正相關(guān)。同時，LD 組、MD 組、HD 組平均增重呈逐漸下降趨勢，證明花椒麻素具有促進(jìn)飲食與抑制大鼠體質(zhì)量的作用，花椒麻素在實(shí)驗(yàn)過程中對于體質(zhì)量與采食量，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

2.2 花椒麻素對大鼠血脂的影響

花椒麻素對試驗(yàn)大鼠血脂影響如表2 所示，高脂飲食使大鼠的血脂水平顯著升高。其中血清總膽固醇水平升高幅度較甘油三酯更大，成功形成了肥胖模型。由表2 可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，相對于空白對照組（BC），高脂模型組（MC）中TC、TG 含量明顯增加，HDL-C 顯著降低、LDL-C 顯著上升，說明肥胖模型造模效果顯著?；ń仿樗氐汀⒅?、高劑量組TC 水平相對于高脂模型組（MC）分別降低了17.1%、30.84%、26.8% (P<0.05)，TG 水平相對于高脂模型組（MC）分別降低了7.8%、19.03%、26.22%(P<0.05)。相對于MC 組，花椒麻素低、中、高劑量組HDL-C 水平相對增加了2.8%、8.8%、14%，LDL-C水平相對減少5.8%、16.5%、25.7% 。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，花椒麻素對大鼠肥胖癥狀有緩解作用，對調(diào)節(jié)膽固醇代謝效果較好，且與劑量成正相關(guān)，這與前人的研究[19]結(jié)果一致。

表2 花椒麻素對血脂的影響

LCI 和AI 分別反映了高脂血癥的可能性與動脈硬化的趨向性。LCI 值證明，大鼠高脂血癥趨勢得到有效緩解。與對照組（BC）相比，MC 組大鼠AI 顯著上升70%(P<0.05)。相對于高脂模型組（MC），長期灌胃低、中、高劑量花椒麻素的LD組、MD 組、HD 組，其 AI 值分別下降了4.47%、19.07%和29.68%(P<0.05)，其中，中、高劑量組效果顯著。這說明花椒麻素對于由高脂飲食引起的代謝疾病有緩解作用，并且在范圍內(nèi)呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系；因此，長期攝入含花椒麻素的食物可能有助于預(yù)防與肥胖與脂代謝相關(guān)的部分慢性疾病。

2.3 花椒麻素對大鼠肝質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響

由表3 可知，相同周齡的MC 組大鼠肝質(zhì)量顯著高于BC 組。HD、AC 兩組肝臟指數(shù)均顯著低于MC，且其余各高脂組與MC 在肝臟指數(shù)上無顯著差異。LD 組、MD 組、HD 組大鼠肝臟指數(shù)隨著花椒麻素單位劑量濃度升高而逐漸降低，說明高劑量的花椒麻素與非諾類陽性藥物對大鼠肝臟脂肪代謝有積極作用。

表3 花椒麻素對肝臟指數(shù)的影響

在Wang 等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟組織病理結(jié)構(gòu)顯示，花椒烷基酰胺治療使肝臟脂肪變性減輕，高劑量組效果尤為明顯。此外有研究[21?23]證明花椒麻素能顯著提高大鼠肝臟中TRPV1 受體的表達(dá)，而TRPV1 受體與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān),同時也在脂代謝中起到重要作用?；ń仿樗赝ㄟ^激活肝臟組織中的TRPV1 受體提高LXRcx、ABCA1 和ABCG1的表達(dá)水平，可有效防止小鼠血管脂質(zhì)積累和動脈粥樣硬化[24?26]。因此，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果假設(shè)花椒麻素通過干涉肝臟表達(dá)影響SD大鼠的代謝平衡。

2.4 花椒麻素對大鼠肝脂的影響

花椒麻素對高脂膳食大鼠肝脂的影響見表4。與BC 組相比，MC 組肝脂濃度、總脂、TC 以及TG分別增加了27.51%、89.85%、100.00%和 147.12%，通過高脂飲食，肝部脂類含量明顯增多。隨著花椒麻素單位劑量的逐漸增加，大鼠肝脂含量逐漸降低，表明花椒麻素顯著降低了TC、TG 及總脂的濃度，且表現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。其中，HD 相對于MC 其總脂、TC 以及TG 分別下降了29.66%、16.74%和43.78% (P<0.05)，說明花椒麻素對于由長期高脂膳食引起的肥胖與肝臟脂肪蓄積有緩解作用。

表4 花椒麻素對肝臟脂質(zhì)的影響

3 結(jié)論

經(jīng)過高脂膳食造模培養(yǎng)，大鼠血清中甘油三酯、膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇含量指標(biāo)增長明顯，高密度脂蛋白膽固醇濃度降低，同時在肝臟中甘油三酯與膽固醇濃度呈現(xiàn)同樣的上升趨勢，符合研究預(yù)期結(jié)果。在長期飼喂不同劑量的花椒麻素后，各劑量組飼料效率降低，血脂綜合指數(shù)降低，動脈粥樣化趨勢緩解，同時在抑制肝臟脂肪蓄積與膽固醇調(diào)節(jié)方面也呈現(xiàn)出不錯的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明花椒麻素具備調(diào)節(jié)平衡大鼠脂代謝方面的功能。由于花椒麻素影響脂代謝的機(jī)制尚不明確完善，在代謝酶、基因表達(dá)及微生物方面的作用方式亟待探索，后續(xù)將采用病理學(xué)檢查、16SDNA 測序、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多種方式進(jìn)—步探明花椒麻素對SD 高脂膳食大鼠脂代謝及健康的影響機(jī)制。