凍干甲型肝炎減毒活疫苗規(guī)格變更后（復(fù)溶后0.5 mL/瓶）的穩(wěn)定性

王藝博，李勇，侯麗娟，岳立廣，李莉，王擁軍，王春雨，徐艷玲

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130012

甲型病毒性肝炎（hepatitis A）簡(jiǎn)稱甲肝，是由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）引起的以肝臟損傷為主的急性腸道傳染性疾病［1-2］，臨床上主要表現(xiàn)為畏寒、發(fā)熱、惡心、疲乏，食欲減退，肝腫大，肝功能異常，黑尿和黃疸等癥狀［3］。甲肝一般不會(huì)引起慢性感染［4-5］，其主要傳播途徑為“糞-口”途徑，也有報(bào)道稱其可通過(guò)血源傳播，但這種情況十分罕見(jiàn)［6］。

甲肝在病毒性肝炎中的發(fā)病率及感染率很高。在防控甲肝的過(guò)程中，WHO推薦最有效的方法就是接種甲肝疫苗［7-8］。2008年，甲肝疫苗被列入國(guó)家計(jì)劃免疫，接種對(duì)象進(jìn)一步擴(kuò)大至嬰幼兒，表明甲肝疫苗在我國(guó)甲肝疫情防控上起重要作用，同時(shí)也對(duì)甲肝疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量提出了更高的要求，且甲肝疫苗的市場(chǎng)需求也進(jìn)一步提升。

凍干甲型肝炎減毒活疫苗是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的疫苗，其具有模擬病毒自然感染人體的優(yōu)點(diǎn)［9］，可同時(shí)誘導(dǎo)人體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，且經(jīng)多年大規(guī)模應(yīng)用，其安全性及有效性均能達(dá)到要求。

生物制品的穩(wěn)定性研究是藥品研發(fā)的重要內(nèi)容，可作為產(chǎn)品有效期設(shè)定的依據(jù)，也可作為產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂的基礎(chǔ)。本研究旨在探討凍干甲型肝炎減毒活疫苗規(guī)格變更后（由復(fù)溶后1.0 mL/瓶變更為復(fù)溶后0.5 mL/瓶）成品的穩(wěn)定性，并與市售凍干甲型肝炎減毒活疫苗（復(fù)溶后1.0 mL/瓶）的穩(wěn)定性進(jìn)行比對(duì)分析。

1 材料與方法

1.1疫苗 規(guī)格變更后的凍干甲型肝炎減毒活疫苗試驗(yàn)疫苗（批號(hào)：S20140301、S20140302、S20140303，規(guī)格為復(fù)溶后每瓶0.5 mL，以下簡(jiǎn)稱試驗(yàn)疫苗）和市售凍干甲型肝炎減毒活疫苗（批號(hào)：20140201、20-140202，規(guī)格為復(fù)溶后每瓶1.0 mL，以下簡(jiǎn)稱市售疫苗）均由長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗二室制備。

1.2主要試劑及儀器 甲型肝炎病毒抗原檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20130820）購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司；澄明度檢測(cè)儀（型號(hào)：YB-2）購(gòu)自天津大學(xué)精密儀器廠；水分儀（型號(hào)：V30）和酸度計(jì)（型號(hào)：Seven multi）購(gòu)自梅特勒-托利多公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：iMarK）購(gòu)自日本BIO-RAD公司；滲透壓摩爾測(cè)定儀（型號(hào)：030）購(gòu)自德國(guó)Gonotec公司。

1.3長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn) 將3批試驗(yàn)疫苗成品分別于（5±3）℃放置，每隔3個(gè)月抽樣檢測(cè)，持續(xù)做至樣品檢測(cè)結(jié)果不合格為止，其中0、6、12、18及24個(gè)月依照《中國(guó)藥典》三部（2010版）［10］進(jìn)行成品的全面檢定，包括鑒別試驗(yàn)、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)、無(wú)菌檢查及病毒滴度、外觀和可見(jiàn)異物、水分、三氯甲烷殘留量、牛血清白蛋白殘留量、抗生素殘留量、細(xì)菌內(nèi)毒素、pH值、滲透壓摩爾濃度檢測(cè)；其余時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行外觀和可見(jiàn)異物、水分、病毒滴度及pH值的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)檢定。

1.4加速穩(wěn)定性試驗(yàn) 將3批試驗(yàn)疫苗成品于（25±2）℃放置6個(gè)月，分別于0、1、2、3及6個(gè)月取樣檢測(cè)，其中0、2及6個(gè)月進(jìn)行成品的全面檢定，其余時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行外觀和可見(jiàn)異物、水分、病毒滴定及pH值的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)檢定。

1.5試驗(yàn)疫苗與市售疫苗的穩(wěn)定性對(duì)比 將3批試驗(yàn)疫苗與2批市售疫苗的穩(wěn)定性研究試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，穩(wěn)定性數(shù)據(jù)包括（5±3）℃放置0、9、18個(gè)月的產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果，其中0、18個(gè)月為全面檢測(cè)，9個(gè)月為關(guān)鍵指控指標(biāo)的檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，比較（5±3）和（25±2）℃放置不同時(shí)間點(diǎn)的試驗(yàn)疫苗關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1長(zhǎng)期穩(wěn)定性

2.1.1外觀 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置30個(gè)月，外觀均為白色疏松體，復(fù)溶后無(wú)異物，與試驗(yàn)前相比無(wú)差異。

2.1.2水分含量 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置27個(gè)月，水分含量均為2.4%；放置30個(gè)月，水分含量略有升高，但均低于3.0%的限度值。水分檢測(cè)結(jié)果均合格，各時(shí)間點(diǎn)3批疫苗的水分含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.091，P=0.913）。見(jiàn)表1。

表1 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置不同時(shí)間的水分含量（%）Tab.1 Moisture contents（%）of three batches of experimental vaccine stored at（5±3）℃for various months

2.1.3病毒滴度 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置27個(gè)月，其中1批病毒滴度低于6.50 lgCCID50/劑；放置30個(gè)月，3批試驗(yàn)疫苗的病毒滴度均低于6.50 lgCCID50/劑。各時(shí)間點(diǎn)3批試驗(yàn)疫苗的病毒滴度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.051，P=0.950），見(jiàn)表2。

表2 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置不同時(shí)間的病毒滴度（lgCCID50/劑）Tab.2 Virus titers（lgCCID50/dose）of three batches of experimental vaccine stored at（5±3）℃for various months

2.1.4pH值 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置30個(gè)月，各取樣時(shí)間點(diǎn)樣品的pH值在6.9～7.0之間，均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。各時(shí)間點(diǎn)3批試驗(yàn)疫苗的pH值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.001，P=1.000）。見(jiàn)表3。

表3 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置不同時(shí)間的pH值Tab.3 The pH values of three batches of experimental vaccine stored at（5±3）℃for different various months

2.1.5全面檢測(cè) 3批試驗(yàn)疫苗于（5±3）℃放置0、6、12、18、24個(gè)月的全面檢測(cè)結(jié)果均合格。

2.2加速穩(wěn)定性

2.2.1外觀 3批試驗(yàn)疫苗于（25±2）℃放置6個(gè)月，外觀均為白色疏松體，復(fù)溶后無(wú)異物，與試驗(yàn)前相比無(wú)差異。

2.2.2水分含量 3批試驗(yàn)疫苗于（25±2）℃放置6個(gè)月，水分含量隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，放置6個(gè)月后，水分含量接近3.0%的限度值，但仍處于合格水平。各時(shí)間點(diǎn)3批試驗(yàn)疫苗的水分含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.007，P=0.993）。見(jiàn)表4。

表4 3批試驗(yàn)疫苗于（25±2）℃放置不同時(shí)間的水分含量（%）Tab.4 Moisture contents（%）of three batches of experimental vaccine stored at（25±2）℃for various months

2.2.3病毒滴度 3批試驗(yàn)疫苗于（25±2）℃放置的病毒滴度隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)，放置6個(gè)月后，病毒滴度在6.50 lgCCID50/劑及以上，仍在合格范圍內(nèi)。3批試驗(yàn)疫苗各時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.371，P=0.698）。見(jiàn)表5。

表5 3批試驗(yàn)疫苗于（25±2）℃放置不同時(shí)間的病毒滴度（lgCCID50/劑）Tab.5 Virus titers（lgCCID50/dose）of three batches of experimental vaccine stored at（25±2）℃for various months

2.2.4pH值 3批試驗(yàn)疫苗于（25±2）℃放置6個(gè)月，pH值平穩(wěn)，未發(fā)生變化，均為7.0，達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.5全面檢測(cè) 3批試驗(yàn)疫苗于（25±2）℃放置0、2、6個(gè)月的全面檢測(cè)結(jié)果均合格。

2.3試驗(yàn)疫苗與市售疫苗的穩(wěn)定性對(duì)比 試驗(yàn)疫苗與市售疫苗于（5±3）℃放置0個(gè)月，全面檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)；放置9個(gè)月，外觀均為白色疏松體、復(fù)溶后無(wú)異物，水分含量均低于3.0%的限度值，符合規(guī)定，病毒滴度均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，pH值檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定；放置18個(gè)月，除滲透壓摩爾濃度因質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不同存在差異外，其他各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均無(wú)明顯差異。見(jiàn)表6。

表6 試驗(yàn)疫苗與市售疫苗于（5±3）℃放置0、9和18個(gè)月的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Tab.6 Control test results of experimental and commercial vaccines stored at（5±3）℃for 0，9 and 18 months

3 討論

甲肝的發(fā)病率與社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活水平和環(huán)境衛(wèi)生情況密切相關(guān)［11］。我國(guó)近年來(lái)隨著甲肝疫苗的廣泛應(yīng)用，甲肝的感染率和發(fā)病率呈明顯下降趨勢(shì)［12］，但仍存在散發(fā)流行和局部暴發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。2020年，遼寧省甲肝疫情暴發(fā)，感染人數(shù)較上一年同期上升67.62%［13］。可持續(xù)地接種甲肝疫苗，使易感人群形成免疫屏障，是最有效的疫情防控手段。

穩(wěn)定性研究是貫穿整個(gè)藥品研發(fā)階段和支持藥品上市及上市后研究的重要內(nèi)容，通過(guò)對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，可設(shè)定產(chǎn)品的有效期，判斷產(chǎn)品工藝、制劑處方、包裝材料選擇的合理性，同時(shí)也可作為產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，規(guī)格變更后的凍干甲型肝炎減毒活疫苗（由復(fù)溶后1.0 mL/瓶變更為復(fù)溶后0.5 mL/瓶）無(wú)論是長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)還是加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均合格，符合《中國(guó)藥典》三部（2010版）中相關(guān)規(guī)定。將該試驗(yàn)疫苗（0.5 mL/瓶）與市售凍干甲型肝炎減毒活疫苗（1.0 mL/瓶）進(jìn)行穩(wěn)定性對(duì)比研究可知，該疫苗與市售凍干甲型肝炎減毒活疫苗在所有質(zhì)量參數(shù)上均一致，符合市售疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。表明將凍干甲型肝炎減毒活疫苗的規(guī)格由復(fù)溶后1.0 mL/瓶變更為復(fù)溶后0.5 mL/瓶，在工藝和質(zhì)量上可行且穩(wěn)定。

復(fù)溶后為0.5mL/瓶的疫苗與復(fù)溶后為1.0mL/瓶的疫苗相比，具有可減輕接種時(shí)的疼痛感，有利于計(jì)劃免疫的推廣和應(yīng)用；提高疫苗的安全性；減少疫苗注射過(guò)程中活病毒外溢；減少輔料用量，從而降低生產(chǎn)的成本等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，通過(guò)查閱生物制品一類疫苗批簽發(fā)數(shù)據(jù)可知，因每種疫苗生產(chǎn)廠家不同，26個(gè)國(guó)家計(jì)劃免疫一類疫苗（包括糖丸及其他劑型）中，規(guī)格為0.5 mL/劑的疫苗多達(dá)15個(gè)，占58%，表明0.5 mL規(guī)格的疫苗是計(jì)劃免疫中疫苗發(fā)展的趨勢(shì)，更有利于計(jì)劃免疫的接種和實(shí)施。

綜上所述，本文對(duì)凍干甲型肝炎減毒活疫苗規(guī)格變更后（復(fù)溶后0.5 mL/瓶）的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，為該疫苗的質(zhì)量提升奠定了基礎(chǔ)。