腹膜纖維化動物模型的研究進展及中醫(yī)藥的干預

孟立鋒，劉前程，吳敏華，劉 鑫，周少華

(1. 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530023；2. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是終末期腎臟病(end stagerenal disease，ESRD)患者有效的腎臟替代療法，在我國已得到廣泛應用。據(jù)統(tǒng)計，我國PD人口已逾9萬人，占全球 PD 患者總?cè)藬?shù)的33%[1]。盡管近年來PD患者生存率及技術存活率顯著提高[2]，但是，由于腹膜炎、腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)、透析液的不相容性等原因?qū)е略S多患者無法接受長期PD。其中，PF所導致的超濾衰竭(ultrafiltration failure,UFF)是PD患者退出PD最重要的原因。臨床研究已經(jīng)確定了幾種防治PF的策略，包括使用新型腹膜透析液[3]、腹透液添加藥物單體[4]、間充質(zhì)干細胞治療[5]和羅格列酮[6]、維生素B1衍生物都具有有益的作用，但是PF的最佳治療方案尚未確立，PF仍然威脅PD患者生命。獲得PF的病理生理知識并制訂相應的治療策略是改善患者預后的關鍵，許多關于PF的研究都依賴于體內(nèi)動物模型或基于體外細胞系統(tǒng)，理想的PF動物模型其疾病進展和特征應與PF患者相似。本文從腹膜纖維化發(fā)病機制、實驗動物造模方法、每種模型的優(yōu)缺點及中醫(yī)藥抗腹膜纖維化的應用等方面，總結(jié)了近年來常用的感染性腹膜炎、非感染性腹膜炎致腹膜纖維化大鼠模型的研究進展，旨在為腹膜纖維化的發(fā)生機制、抗纖維化藥物的篩選等研究中的動物模型選擇提供參考。

1 PF 的發(fā)病機制

盡管PF的主要病因不清楚，但很可能是多因素作用的結(jié)果。PD期間，反復發(fā)作的腹膜炎癥、低生物相容性腹膜透析液的長期暴露、PD開始前尿毒癥本身均可能導致腹膜結(jié)構(gòu)改變，包括間皮下增厚和血管病變[7]。持續(xù)暴露于這些危險因素最終可能導致PF，但是尚不明確這些因素中每個因素對腹膜損傷發(fā)展的貢獻程度。

腹膜炎癥的反復發(fā)作在PF的發(fā)生、發(fā)展進程中十分重要。首先，反復發(fā)作的腹膜炎癥是PD患者死亡的重要原因。雖然腹膜炎的病死率僅3%，但它的發(fā)生率卻很高，每43～47例患者就有1例患者每月發(fā)生1次，據(jù)報道，16%～18%的PD患者因為感染PD相關性腹膜炎癥而死亡[8-10]。其次，反復發(fā)作的腹膜炎癥是PD患者腹膜免疫功能下降的重要因素。ESRD選擇PD患者體內(nèi)通常存在不同程度的微炎癥狀態(tài)，腹膜長期暴露于低生物相容性腹膜透析液中，對腹膜的結(jié)構(gòu)和免疫功能均產(chǎn)生一定的影響，表現(xiàn)為T細胞中TH2 和 TH1 細胞失去平衡，促炎癥因子上調(diào)、抗炎癥因子下調(diào)最終導致免疫紊亂，免疫功能下降。第三，反復發(fā)作的腹膜炎癥是PD患者殘余腎功能下降的風險之一。腹膜炎癥發(fā)作的次數(shù)與殘余腎功能水平具有相關性，發(fā)生腹膜炎的次數(shù)越多殘余腎功能水平越低，最終完全無尿。第四，反復發(fā)作的腹膜炎癥PD患者腹膜損傷的重要原因。腹膜炎能引起腹膜硬化、腹膜纖維化及其導致的腹膜超濾功能衰竭等嚴重后果，導致PD患者退出PD。

有研究顯示，低生物相容性腹膜透析液，特別是那些高滲、高葡萄糖濃度、乳酸含量，低pH值、葡萄糖降解產(chǎn)物(GDPs)和晚期糖基陽離子終產(chǎn)物(AGEs)的溶液可以刺激各種炎癥因子上調(diào)，如白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)等[11]。這些高表達的因子反過來又能促進炎性細胞活化進而加重腹膜損傷，引起腹膜纖維增生。此外，GDPs本身對腹膜細胞有毒性，還能加快AGEs的合成，最終結(jié)果是過表達的AGEs與糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，導致RAGE激活并參與介導氧化應激的多種信號通路促進了活性氧(ROS)的上調(diào)，引起組織損傷并激活TGF-β/Smad信號傳導通路。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)被證實為激活纖維化途徑的關鍵分子[12]，可介導腹膜損傷、炎癥及纖維化之間的相互轉(zhuǎn)化從而加重腹腔粘連。此外，TGF-β1刺激間皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，誘導腹膜間皮細胞(PMC)發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)等致使纖維化的發(fā)生[13]，并減少降解細胞外基質(zhì)(ECM)的酶的產(chǎn)生，包括膠原酶、肝素酶和溶血素。因此低生物相容性腹膜透析液在PF的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

上述研究表明，反復發(fā)作的腹膜炎癥、低生物相容性腹膜透析液的長期暴露等因素在腹膜損傷發(fā)展到腹膜功能衰竭中起著至關重要的作用。PF動物模型的建立對改善腹膜炎所致的腹膜損傷、腹膜纖維化有重要意義，對闡明PF的機制和發(fā)展以及測試PF的防治有重要的意義。已開發(fā)出具有與PD相關性腹膜炎(包括感染性和非感染性腹膜炎)致PF相同的病理特征的動物模型。

2 動物模型

動物模型應基于實際PF中與臨床相關的危險因素，迄今為止，由于難以完全再現(xiàn)PF的病理學，已經(jīng)使用了幾種不同的方法，模仿腹膜炎改變腹膜組織來誘導腹膜纖維化。動物模型中建議的腹膜纖維化模型方法包括PD相關的感染性腹膜炎模型、非感染性腹膜炎模型。

2.1感染性腹膜炎模型 感染性腹膜炎是由細菌、真菌或其他微生物感染引起的，包括使用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等[14-15]，注射方式為反復腹膜內(nèi)注射或植入導管將真菌、細菌注入腹腔，從而誘導急性腹膜炎癥。這些急性傳染性腹膜炎模型主要用來闡述腹膜急性炎癥或腹膜急性損傷的機制，通常不用于研究PF。Hautem等[16]報道直接腹腔注射細菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)10 mg/kg誘導腹膜炎，模擬PD合并間歇性炎癥刺激致PF，LPS造模方法與臨床PD相關性PF比較接近。還有一些學者利用聚維酮碘等增塑劑、酸性溶液和化學刺激物，例如脫氧膽酸鹽、二氧化硅或家用漂白劑誘導腹膜炎癥致腹膜纖維化[17-18]，但報道較少。

感染性腹膜炎致PF模型主要研究了腹膜急性炎癥和急性腹膜損傷的機制，能復制出部分PD相關性腹膜炎致PF的特征，可以用于觀察不同藥物對腹膜炎癥的療效或用于測試防治腹膜炎癥的新藥。此外，它還可以用于查找腹膜炎癥的早期指標。該造模方法的優(yōu)點是手術過程簡單，建立模型所需的時間相對較短。缺點是這些造模方法并未涉及新血管的生成，還容易造成導管堵塞、模型嚴重感染等后果，病死率較高，因此并未得到廣泛的應用。

2.2非感染性腹膜炎模型 隨著PD技術的進步,腹膜感染發(fā)生率降低,非感染性腹膜炎動物模型亟待構(gòu)建。各種因素刺激，如高糖腹膜透析液(PDF)、脂多糖、葡萄糖酸鹽氯己定(CG)或甲基乙二醛(MGO)，都被認為與腹膜纖維化有關。有學者使用脂多糖LPS(0.6 mg/kg)腹腔連續(xù)注射7 d引起腹膜損傷模型，結(jié)果表現(xiàn)為腹膜厚度增加，TGF-β1顯著升高，ECM大量沉積，腹膜超濾顯著降低，D4/D0明顯降低[19-20]；有研究者采用每日腹腔內(nèi)注射4.25% PDF(100 mL/kg)誘導大鼠腹膜炎癥[21]；另有報道使用尿毒癥大鼠模型采取高糖PDF(100 mL/kg)和LPS(0.6 mg/kg)的造模方法可以建立PD大鼠PF模型，表現(xiàn)為腹膜增厚、成纖維細胞增生、ECM大量沉積，血管增生等纖維化表現(xiàn)[22]；此外，有研究使用0.1%葡萄糖酸鹽氯己定CG(1 mL/100 g)腹腔連續(xù)注射3周后成模，可見模型TGF-β1、α-SMA表達增加[23-24]；有學者在模型大鼠腹膜內(nèi)注射4.25% PDF(100 mL/kg)和20 mM甲基乙二醛(MGO)連續(xù)2周誘導PF[25]。另有報道，有一種由機械刮擦腹膜引起腹膜急性炎癥從而誘導PF的模型，Nishimura等[26]和Mizuno等[27]首先報道了非感染性腹膜炎刮擦方法誘發(fā)的PF模型，Hewitson等[28]改進了這種機械刮擦模型，在刮擦腹膜的基礎上每天添加5次酵母聚糖(5 mg/d)誘導腹膜炎、腹膜纖維化。Guo等[29]和Liu等[30]分別使用復制子缺陷并攜帶轉(zhuǎn)化生長因子β1基因腺病毒，通過腹膜內(nèi)注射1次給予，引起腹膜纖維化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的組織學改變。

在非感染性腹膜炎模型中，MGO、CG、PDF+LPS等腹腔注射的方法優(yōu)點是手術過程簡單，重復性較好，但反復穿刺可能有腹膜機械損傷及刺破內(nèi)臟的風險。經(jīng)導管注射可以避免這種反復穿刺的機械損傷，并且將導管植入腹腔最能真實地模擬臨床PD情況。此外，腹腔置管還能用來了解在PD過程中導管對腹膜的作用情況。缺點是外科手術難度較大，如果喂食，可能由于較高的感染風險而導致病死率增加[31]。轉(zhuǎn)基因動物PF大鼠模型雖出現(xiàn)血管增生、腹膜高轉(zhuǎn)運等表現(xiàn)，但價格較貴、且要求的材料及技術水平較高，限制了其推廣應用?，F(xiàn)以所查文獻做腹膜炎動物模型特點的簡單評估，見表1。

表1 感染性、非感染性腹膜炎動物模型的特點

2.3動物模型的局限性 盡管以非生物相容性透析液(如PDF+LPS)注射的實驗模型考慮了腹膜長期暴露于生物不相容的腹膜透析液、PD 微炎癥狀態(tài)、PD開始前尿毒癥本身對PF的影響。但應使用正確反映PF發(fā)病機制(尤其是腹膜炎癥和新生血管形成)的合適的動物模型來探討合適的PF治療方法。然而，單純利用腹膜在非生物相容性腹透液長期暴露的方法很難制作出與人類PF相一致的動物模型。其中一個因素是時間跨度：腹膜透析患者需要很長時間才能發(fā)生PD相關性PF，但在動物模型中誘導的腹膜纖維化改變卻發(fā)生在很短的時間內(nèi)，一般在4周以內(nèi)。此外，用于造模的試劑通常被注射到腹膜腔內(nèi)，反復穿刺會對腹膜組織造成機械性損傷[32]及多次腹腔注射本身引起的感染均可能干預實驗結(jié)果。

在使用動物模型時，物種和品系的選擇至關重要。在 PD相關性PF或腹膜炎的模型中多使用齲齒動物：大鼠或小鼠。大鼠和小鼠模型之間的主要區(qū)別是建立模型所需的時間長短以及所用藥物的量。通常要獲得相同的結(jié)果，大鼠模型需要的藥物和時間更多。大鼠的優(yōu)勢在于它可以獲得相對較多的樣品，但其需要的藥物及時間也更多。另一方面，由于轉(zhuǎn)基因模型的載體多為小鼠，使用小鼠進行機制研究將更具有優(yōu)勢[33]。因此，動物種類和品系的差異可能會影響活體研究的結(jié)果，需要在動物模型中仔細評估腹膜結(jié)構(gòu)和功能。

3 PF動物模型的中醫(yī)藥治療策略

長期使用 PD 治療最終會導致PF、超濾失敗和 PD 中斷。當前沒有有效的療法來預防或延遲這種病理過程，其原因為對PF的發(fā)病機制認識有限及治療途徑狹窄。研究表明，臨床上許多現(xiàn)代抗纖維化藥物可能有效，但存在一些較大的不良反應，如干咳、血肌酐水平增高等[34]; 中醫(yī)中藥具有療效好、毒副作用較小及價格便宜等優(yōu)點，成為近年來防治PD相關性腹膜纖維化研究熱點[35]。中醫(yī)藥的應用在纖維化動物模型抗纖維化研究中取得長足進展。

3.1中藥策略 近年來，通過應用不同的PF動物模型，發(fā)現(xiàn)許多中藥，包括中藥單體、中藥復方及中成藥等對PD相關性PF防治具有重要作用。其中，利用動物模型結(jié)合其他交叉學科、新技術，如中醫(yī)中藥治療PF機制可呈現(xiàn)在代謝組學、蛋白質(zhì)組學、基因組學、腸道菌群、免疫等方面，并取得一定的進展，見表2。通過探究中醫(yī)藥治病機制的過程也可為全面認識PF提供了更好的研究方向。

表2 PF動物模型在抗纖維化中醫(yī)藥研究中的應用

3.2針灸策略 通過中藥的應用，我們可以看出中醫(yī)藥在防治腹膜炎癥、PF中的潛力和優(yōu)勢。但PF患者病情急、相關并發(fā)癥多，口服藥物可能具有的腎臟毒性，不利于殘余腎功能的保護。研究顯示，針灸可以改善PD患者腎功能，提高患者生活質(zhì)量。姜新龍等[36]通過臨床發(fā)現(xiàn)針灸可改善患者臨床癥狀，減輕尿蛋白生成,改善腎功能；Yu等[37]發(fā)現(xiàn)針刺治療后，SCr下降、腎小球濾過率上升患者腎功能得到改善；聶峰等[38]針灸患者后發(fā)現(xiàn)，患者24 h尿蛋白定量下降明顯，SCr明顯降低，患者腎功能得到改善。

3.3中醫(yī)“證候”的腹膜纖維化動物模型 辨證論治是中醫(yī)的特色，在中醫(yī)藥抗PD相關性PF中據(jù)有重要地位;建立中醫(yī)PF“證候”的動物模型，是中醫(yī)藥抗PD相關性PF研究的難點之一。一些學者結(jié)合中醫(yī)基礎理論，就建立腹膜纖維化對應的中醫(yī)“證候”動物模型進行了有益探討。孟立鋒等[39]采5/6腎切除聯(lián)合腹腔注射PDF造模法，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)毛發(fā)稀疏、反應遲鈍、喜好蜷臥等癥狀，且逐漸出現(xiàn)形體消瘦等癥狀，建立了中醫(yī)脾氣虧虛證的PF動物模型。鄭登勇等[40]認為PF中醫(yī)亦屬于“微型癥積”“血瘀證”范疇，PDF聯(lián)合LPS腹腔注射可建立血瘀證型PF動物模型。此外，還有研究認為痰瘀交結(jié)是腹膜纖維化的主要病機，采取PDF加紅霉素腹腔注射可建立痰瘀交結(jié)證型PF模型[41]。

4 小結(jié)與展望

獲得PF的病理生理知識并制訂相應的防治手段對改善患者預后至關重要；使用PF動物模型并評估可能導致PF的危險因素對研究PF病理生理過程至關重要；建立標準PF模型對于分析數(shù)據(jù)并使之適應臨床至關重要。但由于臨床PD相關性PF發(fā)病的復雜性，目前暫無公認的用于PF研究的標準模型，也難以完全復制PF的病理生理過程，各研究中模型動物的選擇、造模方法、給藥途徑、模型評價方法等也存在較大差別。研究者基于不同的研究目的、研究方向去選擇合適的PF動物模型，在現(xiàn)有的嚙齒類動物外，重視非嚙齒類PF動物模型的研究，更精準地模擬PD患者臨床狀況，是今后研究的重點之一。PF動物模型應用于中醫(yī)藥抗PD相關性PF的研究取得了一定的進展，表明中醫(yī)藥在一定水平可以改善腹膜超濾功能，延緩腹膜超濾衰竭發(fā)生的時間，彌補了當前PDF和PD技術本身的欠缺，有著不錯的研究遠景。當前，大多數(shù)研究偏重于相應的藥理實驗研究，選擇動物模型的標準也未十分明確。如何將傳統(tǒng)中醫(yī)理論與現(xiàn)代新技術和交叉學科聯(lián)合應用，從而深入探究PD相關性PF的病理、藥物作用機制，是一個很有意義的探索方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。