實驗性自身免疫性葡萄膜炎的中醫(yī)藥干預(yù)研究進展

王琦妙，張遠龍，龐雅菊

(天津市眼科醫(yī)院/天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點實驗室，天津 300020)

葡萄膜炎是一類嚴重致盲的眼病，自身免疫是其主要致病原因之一，因其難治、病程久、反復(fù)發(fā)作等特點，一直以來困擾著患者及醫(yī)生。實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)是研究人類自身免疫性葡萄膜炎的實驗動物模型，通過用視網(wǎng)膜抗原在易感動物中誘導(dǎo)，臨床特征明顯、可重復(fù)性好，易于追蹤研究與指標量化，是藥物干預(yù)治療評估的理想模型[1-2]。國內(nèi)外研究中，有對相關(guān)細胞因子在EAU發(fā)病機制中作用的研究[3-5]。有對EAU發(fā)病特征的研究[6]，有對治療方法及新制劑開發(fā)的研究等[7-8]。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫功能治療葡萄膜炎方面有著獨特的優(yōu)勢，且中醫(yī)藥干預(yù)葡萄膜炎的實驗研究也一直在進行，現(xiàn)將中醫(yī)藥干預(yù)EAU的研究綜述如下。

1 單藥干預(yù)

中藥成分復(fù)雜，為了更好地研究其對自身免疫性葡萄膜炎的作用，學(xué)者從中提取有效成分進行實驗研究，觀察其治療效果，并進一步探討作用機制。

雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TP)又稱雷公藤甲素，是從雷公藤、昆明山海棠等物質(zhì)中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎和免疫抑制作用[9]。有實驗研究，在以0.1 mg/(kg·d)(腹膜內(nèi))TP干預(yù)EAU小鼠，發(fā)現(xiàn)連續(xù)用TP 28 d小鼠與用環(huán)孢素霉A免疫抑制作用相當，而這種免疫抑制作用在免疫后14～28 d用TP干預(yù)的小鼠中明顯下降。用藥28 d的小鼠引流淋巴結(jié)和炎癥眼中Th1型細胞因子(IL-12p40、IFN-γ和TNF-α)的K2特異性淋巴細胞增殖和mRNA表達均降低?？紤]TP可通過下調(diào)Th1型應(yīng)答對EAU實現(xiàn)抑制作用[10]。

白楊素多是從木蝴蝶中提取的一種天然黃酮類化合物，具有抗炎作用且無毒。孟祥達等[11]對白楊素治療EAU及機制進行探討，對白楊素組小鼠自免疫前3 d至免疫后21 d按25 mg/kg的劑量每日給予白楊素灌胃，發(fā)現(xiàn)服用白楊素小鼠視網(wǎng)膜炎癥評分降低，玻璃體及視網(wǎng)膜炎性細胞浸潤減輕，說明白楊素可保護視網(wǎng)膜組織免受炎癥細胞破壞。TUNEL法對視網(wǎng)膜細胞凋亡情況評估，顯示白楊素不能促進視網(wǎng)膜細胞凋亡，故認為白楊素對EAU的治療作用不是通過促進炎細胞凋亡途徑實現(xiàn)。進一步檢測視網(wǎng)膜Th1和Th17細胞分泌的炎性因子及轉(zhuǎn)錄因子表達量，結(jié)果顯示白楊素可抑制JAK-STAT途徑激活因子IFN-γ、TNF-α、IL-6的表達，抑制STAT1、STAT3的磷酸化，從而抑制Th1、Th17細胞分泌IFN-γ、IL-17A。證明白楊素對EAU的治療作用機制可能與抑制STAT途徑的激活有關(guān)。

火把花根片又稱昆明山海棠，主要由生物堿類、萜類、皂苷、內(nèi)酯等成分組成，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。研究顯示，火把花根可能通過抑制樹突狀細胞分泌TNF-α和IL-6及淋巴細胞增殖來發(fā)揮預(yù)防和治療EAU的作用[12]。

白芍總苷(total glucosides of peony,TGP)是芍藥根中提取的一類糖苷類物質(zhì)，具有抑制自身免疫反應(yīng)、止痛、抗炎及免疫調(diào)節(jié)的功效，在自身免疫疾病中應(yīng)用廣泛。景?，摰萚13]使用TGP干預(yù)EAU進行實驗研究，在造模后3～28 d給予大鼠3 mL/100 g TGP溶劑灌胃，TGP干預(yù)組大鼠眼部炎癥情況明顯低于模型組，免疫后7 d、12 d、21 d、28 d每組隨機處死3只大鼠，對肝臟細胞研究發(fā)現(xiàn)TGP可能通過刺激自然殺傷細胞發(fā)揮抗炎作用，減輕EAU；也可促進IL-4分泌，減少IFN-γ的分泌，加速EAU炎癥的消退。

2 復(fù)方內(nèi)治

自身免疫性葡萄膜炎多病因不明確，臨床表現(xiàn)多變、病程演變復(fù)雜，西醫(yī)治療藥物多為非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑，這些藥物在治療的同時給身體帶來的不良反應(yīng)也較嚴重。于是中藥對自身免疫性葡萄膜炎的優(yōu)勢就凸顯出來，而在此類研究中，中藥經(jīng)典及經(jīng)驗復(fù)方制劑的治療占多數(shù)。

清開靈是在名方“安宮牛黃丸”基礎(chǔ)上開發(fā)的復(fù)方制劑，清熱解毒化濕，祛痰通絡(luò)開竅，可促進組織細胞代謝，有抗炎免疫作用。有研究對實驗性葡萄膜炎兔眼炎癥評分，并于造模后1，3，7，10，14天對房水及外周血中IL-2、TNF-α含量進行測量，顯示清開靈具有改善兔實驗性葡萄膜炎的臨床體征，抑制房水和外周血IL-2、TNF-α的作用[14]。

近年來，幾個研究團隊用新制柴連湯、祛風(fēng)活血丸、龍膽瀉肝湯對EAU的治療進行了較詳細的研究。

張智軍教授團隊用新制柴連湯加減對兔EAU模型血清細胞因子IL-12、IL-17、IFN-γ的影響進行研究，以地塞米松作為對照，并分為中藥大劑量組和中藥小劑量組干預(yù)治療，觀察實驗動物炎癥反應(yīng)并測定細胞因子含量，發(fā)現(xiàn)新制柴連湯可減輕實驗兔葡萄膜炎炎癥，中藥大劑量組與對照組在減輕炎癥方面作用相當，但對照組復(fù)發(fā)率高。中藥大劑量組可降低兔血清IL-12、IL-17、IFN-γ水平，實驗兔葡萄膜炎的嚴重程度與IL-12 濃度高低可能呈正相關(guān)性；中藥大劑量組抑制血清中IL-17效果良好，小劑量組抑制作用欠佳；中藥對IFN-γ的調(diào)節(jié)呈一定的量效關(guān)系，以上可能是新制柴連湯治療葡萄膜炎機制[15-17]。

喻京生教授團隊用祛風(fēng)活血丸對EAU大鼠的干預(yù)進行系列研究[18-19]。祛風(fēng)活血丸由熟地黃、當歸、川芎等8味中藥組成，具有祛風(fēng)清熱、養(yǎng)血活血功效。研究以祛風(fēng)活血丸對EAU鼠灌胃治療，測量血清炎性因子IL-35與IL-10、IL-15與IFN-γ的表達，發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)活血丸能夠減輕鼠 EAU 的發(fā)病并加速眼部炎癥消退，其機制可能是通過調(diào)節(jié)IL-35與IL-10的活性及濃度，抑制促炎因子表達及促抗炎性因子的分化與表達的雙重功能發(fā)揮抗炎作用。IFN-γ影響正常機體的生理平衡和自身免疫的穩(wěn)定，在正常眼內(nèi)無明顯表達，在葡萄膜炎眼組織中可明確檢測到；IL-15可促進IFN-γ分泌，抑制調(diào)節(jié)性T細胞的凋亡，結(jié)果顯示祛風(fēng)活血丸能抑制IL-15、IFN-γ的表達，改善EAU病理過程。進一步通過檢測血清Fas、Fasl的表達及視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Caspase-3蛋白的表達量研究中藥干預(yù)EAU的機制與細胞凋亡有關(guān)[20-21]。喻京生等[22]取EAU大鼠視網(wǎng)膜組織做免疫組化，通過不同組別干預(yù)及表達量的研究發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)活血丸能通過調(diào)節(jié)TGF-β2的狀態(tài)，對EAU發(fā)揮治療作用。實時熒光定量核酸擴增(real-time quautitative PCR,qRCR)法對EAU大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA和RORγt mRNA相對表達量進行檢測，顯示祛風(fēng)活血丸可能通過抑制葡萄膜炎性Th17相關(guān)炎癥因子IL-17 mRNA、IL-23 mRNA和RORγt mRNA的表達來發(fā)揮抗炎作用[23]。同樣用qRCR法對大鼠視網(wǎng)膜組織中miRNA-155、miRNA-146a和miRNA-182的相對表達量檢測，發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)活血丸能抑制miRNA-155、miRNA-146a表達，促進miRNA-182表達，從而考慮其可通過影響以上三種RNA的表達調(diào)控EAU的進程，并推測這3種RNA可能作為潛在的治療葡萄膜炎藥物的作用靶點[24]。還對視網(wǎng)膜組織中JAK2、STAT3 mRNA的表達量進行測量，結(jié)果祛風(fēng)活血丸大劑量組JAK2、STAT3 mRNA表達均降低，考慮JAK2、STAT3 mRNA為祛風(fēng)活血丸干預(yù)EAU的又一作用靶點，可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號通路，達到抗炎作用[25]。

畢宏升教授團隊對龍膽瀉肝湯干預(yù)EAU的治療作用進行研究。龍膽瀉肝湯(longdan xiegan decoction,LXD)主要瀉肝膽實火，具有免疫調(diào)控作用。檢測EAU大鼠治療前后血液、淋巴結(jié)及脾臟中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-17的變化，發(fā)現(xiàn)LXD能通過抑制IFN-γ、TNF-α、IL-17相關(guān)炎癥因子的表達發(fā)揮抗炎作用，促進IL-10的表達，加速自身免疫炎癥的恢復(fù)[26]。治療前后檢測大鼠房水蛋白及血清中的白蛋白、球蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)LXD組房水蛋白濃度明顯低于模型組；組織病理學(xué)觀察，模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞程度高于LXD組，故認為LXD能減輕EAU大鼠前房炎癥細胞浸潤，保護眼部組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)眼部免疫狀態(tài)[27]。以上在體實驗已證實LXD治療葡萄膜炎有效，進一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)的方法探討LXD分子機制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示LXD治療葡萄膜炎，主要通過MAPK信號通路、促性腺激素信號通路和雌激素信號通路，減少炎癥因子的產(chǎn)生和細胞浸潤，調(diào)節(jié)機體免疫狀況，調(diào)控葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展[28]。Notch信號通路也是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和自身免疫疾病的重要通路。研究證實Th17/Treg比例失調(diào)與Notch表達升高有關(guān)[29]。劉濱等[30]發(fā)現(xiàn)EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)中Notch1、Notch2、Notch4蛋白表達水平在LXD干預(yù)后顯著降低。殷學(xué)偉等[31]研究LXD對EAU大鼠Notch信號通路活化的抑制作用及對Th17/Treg表達水平的影響，發(fā)現(xiàn)LXD能下調(diào)EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)、眼組織中Notch1、DLL4分子表達，抑制Notch信號通路活化，降低IL-10和IL-17 mRNA及蛋白的表達水平，調(diào)節(jié)Th17/Treg比例平衡，促進全身及眼內(nèi)免疫平衡。在對各組別EAU大鼠血清中C4、MBL2蛋白表達水平及脾臟和淋巴結(jié)CD4+/CD8+細胞比例進行檢測，顯示LXD可有效調(diào)整CD4+/CD8+細胞比例，降低血清C4蛋白表達，上調(diào)MBL2蛋白表達水平，從而促進補體系統(tǒng)平衡的恢復(fù)，加快葡萄膜炎的改善[32]。

3 外用藥物

EAU模型從機制上講，病變主要累及眼后節(jié)，以Lewis大鼠造模的EAU模型會出現(xiàn)較嚴重的眼前節(jié)炎癥。對這類模型進行外用中藥滴眼劑干預(yù)也有明顯的療效。

研究者從昆明山海棠中提取生物堿制備不同濃度雷公藤總生物堿滴眼液，以典必殊滴眼液作為對照，于免疫后9 d開始點眼，每6 h 1次。每3 d各組取2只大鼠4只眼球行常規(guī)切片和HE染色，通過對眼前節(jié)炎癥評分和病理組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)0.05%雷公藤總生物堿滴眼液可有效抑制大鼠EAU眼病理改變，與典必殊滴眼液治療無明顯差異[33]。

田慶梅等[34]觀察清開靈眼用凝膠對EAU的治療作用，免疫后第7天開始點眼，每日3次，連續(xù)用藥7 d。通過對眼部炎癥反應(yīng)評分及組織病理學(xué)的觀察，清開靈組可減輕大鼠EAU炎癥，但較妥布霉素地塞米松組效果略差。對大鼠脾臟淋巴結(jié)CD4+、CD8+值及Th1、Th17細胞比進行測定，考慮清開靈減輕炎癥反應(yīng)的機制主要是抑制CD4+細胞的增生和分化，CD4+/CD8+降低，Th1、Th17效應(yīng)細胞分化被抑制，減少相應(yīng)炎性細胞因子分泌。

4 穴位埋線法

有研究證實，針灸對慢性炎癥性疾病有雙向調(diào)節(jié)作用。穴位埋線是在傳統(tǒng)針灸及穴位注射基礎(chǔ)上改進，用特制的針具把可吸收的羊腸線埋入穴位，產(chǎn)生生物化學(xué)反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[35]。

郝小波教授團隊對穴位埋線干預(yù)EAU大鼠進行研究，穴位埋線于造模后第2天進行，依據(jù)大鼠穴位圖譜選擇脾俞(第12胸椎下兩旁)、肋間(左右側(cè)各一穴)、腎俞(第2腰椎下兩旁，左右側(cè)各一穴) 進行埋線操作，穴位埋線組與模型組炎癥反應(yīng)均在造模后13 d達到高峰，穴位埋線組炎癥評分低于模型組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組織病理學(xué)顯示，在第9，13，18，23天虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜炎癥模型組均比穴位埋線組嚴重；采集大鼠心臟血液并分離淋巴結(jié)中T淋巴細胞，流式細胞儀分析，第13天CD4+T細胞占比最高，CD8+T細胞占比最低[35-36]。對造模后第9，13，18，23天大鼠心臟血中IFN-γ、IL-4 mRNA的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)穴位埋線可在炎癥期提升以IL-4為代表的炎癥保護因子的分泌，抑制以IFN-γ為代表的炎癥保護因子，從而減輕炎癥反應(yīng)，糾正Th1/Th2失衡[37]。

5 小 結(jié)

自身免疫性葡萄膜炎為CD4+T細胞所介導(dǎo)，大量實驗表明葡萄膜炎主要原因是機體產(chǎn)生了針對自身抗原特異性的T淋巴細胞，主要包括Th1、Th2、Th17細胞亞群。中醫(yī)藥治療葡萄膜炎優(yōu)勢在于毒副作用少、復(fù)發(fā)率低，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)不少中藥具有免疫調(diào)節(jié)作用，EAU動物模型的成熟，為中醫(yī)藥治療葡萄膜炎實驗研究奠定了基礎(chǔ)。從葡萄膜炎自身免疫性疾病特點出發(fā)，發(fā)揮中醫(yī)藥特色，對治療機制進行深入探討，主要體現(xiàn)在對Th1、Th17細胞的獨立或協(xié)同抑制作用，對Th2細胞的保護作用及Treg細胞的介導(dǎo)抑制作用。立足于中醫(yī)藥學(xué)基本理論，應(yīng)用現(xiàn)代實驗學(xué)科研技術(shù)開發(fā)中醫(yī)藥資源寶庫，已成為中醫(yī)藥發(fā)展的重要目標。