實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的中醫(yī)藥干預(yù)研究進(jìn)展

王琦妙，張遠(yuǎn)龍，龐雅菊

(天津市眼科醫(yī)院/天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020)

葡萄膜炎是一類嚴(yán)重致盲的眼病，自身免疫是其主要致病原因之一，因其難治、病程久、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，一直以來困擾著患者及醫(yī)生。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)是研究人類自身免疫性葡萄膜炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過用視網(wǎng)膜抗原在易感動(dòng)物中誘導(dǎo)，臨床特征明顯、可重復(fù)性好，易于追蹤研究與指標(biāo)量化，是藥物干預(yù)治療評(píng)估的理想模型[1-2]。國(guó)內(nèi)外研究中，有對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子在EAU發(fā)病機(jī)制中作用的研究[3-5]。有對(duì)EAU發(fā)病特征的研究[6]，有對(duì)治療方法及新制劑開發(fā)的研究等[7-8]。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫功能治療葡萄膜炎方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，且中醫(yī)藥干預(yù)葡萄膜炎的實(shí)驗(yàn)研究也一直在進(jìn)行，現(xiàn)將中醫(yī)藥干預(yù)EAU的研究綜述如下。

1 單藥干預(yù)

中藥成分復(fù)雜，為了更好地研究其對(duì)自身免疫性葡萄膜炎的作用，學(xué)者從中提取有效成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，觀察其治療效果，并進(jìn)一步探討作用機(jī)制。

雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TP)又稱雷公藤甲素，是從雷公藤、昆明山海棠等物質(zhì)中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎和免疫抑制作用[9]。有實(shí)驗(yàn)研究，在以0.1 mg/(kg·d)(腹膜內(nèi))TP干預(yù)EAU小鼠，發(fā)現(xiàn)連續(xù)用TP 28 d小鼠與用環(huán)孢素霉A免疫抑制作用相當(dāng)，而這種免疫抑制作用在免疫后14～28 d用TP干預(yù)的小鼠中明顯下降。用藥28 d的小鼠引流淋巴結(jié)和炎癥眼中Th1型細(xì)胞因子(IL-12p40、IFN-γ和TNF-α)的K2特異性淋巴細(xì)胞增殖和mRNA表達(dá)均降低。考慮TP可通過下調(diào)Th1型應(yīng)答對(duì)EAU實(shí)現(xiàn)抑制作用[10]。

白楊素多是從木蝴蝶中提取的一種天然黃酮類化合物，具有抗炎作用且無毒。孟祥達(dá)等[11]對(duì)白楊素治療EAU及機(jī)制進(jìn)行探討，對(duì)白楊素組小鼠自免疫前3 d至免疫后21 d按25 mg/kg的劑量每日給予白楊素灌胃，發(fā)現(xiàn)服用白楊素小鼠視網(wǎng)膜炎癥評(píng)分降低，玻璃體及視網(wǎng)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，說明白楊素可保護(hù)視網(wǎng)膜組織免受炎癥細(xì)胞破壞。TUNEL法對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況評(píng)估，顯示白楊素不能促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，故認(rèn)為白楊素對(duì)EAU的治療作用不是通過促進(jìn)炎細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步檢測(cè)視網(wǎng)膜Th1和Th17細(xì)胞分泌的炎性因子及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量，結(jié)果顯示白楊素可抑制JAK-STAT途徑激活因子IFN-γ、TNF-α、IL-6的表達(dá)，抑制STAT1、STAT3的磷酸化，從而抑制Th1、Th17細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-17A。證明白楊素對(duì)EAU的治療作用機(jī)制可能與抑制STAT途徑的激活有關(guān)。

火把花根片又稱昆明山海棠，主要由生物堿類、萜類、皂苷、內(nèi)酯等成分組成，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。研究顯示，火把花根可能通過抑制樹突狀細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6及淋巴細(xì)胞增殖來發(fā)揮預(yù)防和治療EAU的作用[12]。

白芍總苷(total glucosides of peony,TGP)是芍藥根中提取的一類糖苷類物質(zhì)，具有抑制自身免疫反應(yīng)、止痛、抗炎及免疫調(diào)節(jié)的功效，在自身免疫疾病中應(yīng)用廣泛。景常瑩等[13]使用TGP干預(yù)EAU進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，在造模后3～28 d給予大鼠3 mL/100 g TGP溶劑灌胃，TGP干預(yù)組大鼠眼部炎癥情況明顯低于模型組，免疫后7 d、12 d、21 d、28 d每組隨機(jī)處死3只大鼠，對(duì)肝臟細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)TGP可能通過刺激自然殺傷細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，減輕EAU；也可促進(jìn)IL-4分泌，減少IFN-γ的分泌，加速EAU炎癥的消退。

2 復(fù)方內(nèi)治

自身免疫性葡萄膜炎多病因不明確，臨床表現(xiàn)多變、病程演變復(fù)雜，西醫(yī)治療藥物多為非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑，這些藥物在治療的同時(shí)給身體帶來的不良反應(yīng)也較嚴(yán)重。于是中藥對(duì)自身免疫性葡萄膜炎的優(yōu)勢(shì)就凸顯出來，而在此類研究中，中藥經(jīng)典及經(jīng)驗(yàn)復(fù)方制劑的治療占多數(shù)。

清開靈是在名方“安宮牛黃丸”基礎(chǔ)上開發(fā)的復(fù)方制劑，清熱解毒化濕，祛痰通絡(luò)開竅，可促進(jìn)組織細(xì)胞代謝，有抗炎免疫作用。有研究對(duì)實(shí)驗(yàn)性葡萄膜炎兔眼炎癥評(píng)分，并于造模后1，3，7，10，14天對(duì)房水及外周血中IL-2、TNF-α含量進(jìn)行測(cè)量，顯示清開靈具有改善兔實(shí)驗(yàn)性葡萄膜炎的臨床體征，抑制房水和外周血IL-2、TNF-α的作用[14]。

近年來，幾個(gè)研究團(tuán)隊(duì)用新制柴連湯、祛風(fēng)活血丸、龍膽瀉肝湯對(duì)EAU的治療進(jìn)行了較詳細(xì)的研究。

張智軍教授團(tuán)隊(duì)用新制柴連湯加減對(duì)兔EAU模型血清細(xì)胞因子IL-12、IL-17、IFN-γ的影響進(jìn)行研究，以地塞米松作為對(duì)照，并分為中藥大劑量組和中藥小劑量組干預(yù)治療，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物炎癥反應(yīng)并測(cè)定細(xì)胞因子含量，發(fā)現(xiàn)新制柴連湯可減輕實(shí)驗(yàn)兔葡萄膜炎炎癥，中藥大劑量組與對(duì)照組在減輕炎癥方面作用相當(dāng)，但對(duì)照組復(fù)發(fā)率高。中藥大劑量組可降低兔血清IL-12、IL-17、IFN-γ水平，實(shí)驗(yàn)兔葡萄膜炎的嚴(yán)重程度與IL-12 濃度高低可能呈正相關(guān)性；中藥大劑量組抑制血清中IL-17效果良好，小劑量組抑制作用欠佳；中藥對(duì)IFN-γ的調(diào)節(jié)呈一定的量效關(guān)系，以上可能是新制柴連湯治療葡萄膜炎機(jī)制[15-17]。

喻京生教授團(tuán)隊(duì)用祛風(fēng)活血丸對(duì)EAU大鼠的干預(yù)進(jìn)行系列研究[18-19]。祛風(fēng)活血丸由熟地黃、當(dāng)歸、川芎等8味中藥組成，具有祛風(fēng)清熱、養(yǎng)血活血功效。研究以祛風(fēng)活血丸對(duì)EAU鼠灌胃治療，測(cè)量血清炎性因子IL-35與IL-10、IL-15與IFN-γ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)活血丸能夠減輕鼠 EAU 的發(fā)病并加速眼部炎癥消退，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)IL-35與IL-10的活性及濃度，抑制促炎因子表達(dá)及促抗炎性因子的分化與表達(dá)的雙重功能發(fā)揮抗炎作用。IFN-γ影響正常機(jī)體的生理平衡和自身免疫的穩(wěn)定，在正常眼內(nèi)無明顯表達(dá)，在葡萄膜炎眼組織中可明確檢測(cè)到；IL-15可促進(jìn)IFN-γ分泌，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示祛風(fēng)活血丸能抑制IL-15、IFN-γ的表達(dá)，改善EAU病理過程。進(jìn)一步通過檢測(cè)血清Fas、Fasl的表達(dá)及視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Caspase-3蛋白的表達(dá)量研究中藥干預(yù)EAU的機(jī)制與細(xì)胞凋亡有關(guān)[20-21]。喻京生等[22]取EAU大鼠視網(wǎng)膜組織做免疫組化，通過不同組別干預(yù)及表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)活血丸能通過調(diào)節(jié)TGF-β2的狀態(tài)，對(duì)EAU發(fā)揮治療作用。實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增(real-time quautitative PCR,qRCR)法對(duì)EAU大鼠視網(wǎng)膜組織中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA和RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，顯示祛風(fēng)活血丸可能通過抑制葡萄膜炎性Th17相關(guān)炎癥因子IL-17 mRNA、IL-23 mRNA和RORγt mRNA的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用[23]。同樣用qRCR法對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織中miRNA-155、miRNA-146a和miRNA-182的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)祛風(fēng)活血丸能抑制miRNA-155、miRNA-146a表達(dá)，促進(jìn)miRNA-182表達(dá)，從而考慮其可通過影響以上三種RNA的表達(dá)調(diào)控EAU的進(jìn)程，并推測(cè)這3種RNA可能作為潛在的治療葡萄膜炎藥物的作用靶點(diǎn)[24]。還對(duì)視網(wǎng)膜組織中JAK2、STAT3 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果祛風(fēng)活血丸大劑量組JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)均降低，考慮JAK2、STAT3 mRNA為祛風(fēng)活血丸干預(yù)EAU的又一作用靶點(diǎn)，可通過調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路，達(dá)到抗炎作用[25]。

畢宏升教授團(tuán)隊(duì)對(duì)龍膽瀉肝湯干預(yù)EAU的治療作用進(jìn)行研究。龍膽瀉肝湯(longdan xiegan decoction,LXD)主要瀉肝膽實(shí)火，具有免疫調(diào)控作用。檢測(cè)EAU大鼠治療前后血液、淋巴結(jié)及脾臟中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-17的變化，發(fā)現(xiàn)LXD能通過抑制IFN-γ、TNF-α、IL-17相關(guān)炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，加速自身免疫炎癥的恢復(fù)[26]。治療前后檢測(cè)大鼠房水蛋白及血清中的白蛋白、球蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)LXD組房水蛋白濃度明顯低于模型組；組織病理學(xué)觀察，模型組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞程度高于LXD組，故認(rèn)為L(zhǎng)XD能減輕EAU大鼠前房炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)眼部組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)眼部免疫狀態(tài)[27]。以上在體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)LXD治療葡萄膜炎有效，進(jìn)一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)的方法探討LXD分子機(jī)制，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示LXD治療葡萄膜炎，主要通過MAPK信號(hào)通路、促性腺激素信號(hào)通路和雌激素信號(hào)通路，減少炎癥因子的產(chǎn)生和細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀況，調(diào)控葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展[28]。Notch信號(hào)通路也是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和自身免疫疾病的重要通路。研究證實(shí)Th17/Treg比例失調(diào)與Notch表達(dá)升高有關(guān)[29]。劉濱等[30]發(fā)現(xiàn)EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)中Notch1、Notch2、Notch4蛋白表達(dá)水平在LXD干預(yù)后顯著降低。殷學(xué)偉等[31]研究LXD對(duì)EAU大鼠Notch信號(hào)通路活化的抑制作用及對(duì)Th17/Treg表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)LXD能下調(diào)EAU大鼠脾臟、淋巴結(jié)、眼組織中Notch1、DLL4分子表達(dá)，抑制Notch信號(hào)通路活化，降低IL-10和IL-17 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)Th17/Treg比例平衡，促進(jìn)全身及眼內(nèi)免疫平衡。在對(duì)各組別EAU大鼠血清中C4、MBL2蛋白表達(dá)水平及脾臟和淋巴結(jié)CD4+/CD8+細(xì)胞比例進(jìn)行檢測(cè)，顯示LXD可有效調(diào)整CD4+/CD8+細(xì)胞比例，降低血清C4蛋白表達(dá)，上調(diào)MBL2蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)補(bǔ)體系統(tǒng)平衡的恢復(fù)，加快葡萄膜炎的改善[32]。

3 外用藥物

EAU模型從機(jī)制上講，病變主要累及眼后節(jié)，以Lewis大鼠造模的EAU模型會(huì)出現(xiàn)較嚴(yán)重的眼前節(jié)炎癥。對(duì)這類模型進(jìn)行外用中藥滴眼劑干預(yù)也有明顯的療效。

研究者從昆明山海棠中提取生物堿制備不同濃度雷公藤總生物堿滴眼液，以典必殊滴眼液作為對(duì)照，于免疫后9 d開始點(diǎn)眼，每6 h 1次。每3 d各組取2只大鼠4只眼球行常規(guī)切片和HE染色，通過對(duì)眼前節(jié)炎癥評(píng)分和病理組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)0.05%雷公藤總生物堿滴眼液可有效抑制大鼠EAU眼病理改變，與典必殊滴眼液治療無明顯差異[33]。

田慶梅等[34]觀察清開靈眼用凝膠對(duì)EAU的治療作用，免疫后第7天開始點(diǎn)眼，每日3次，連續(xù)用藥7 d。通過對(duì)眼部炎癥反應(yīng)評(píng)分及組織病理學(xué)的觀察，清開靈組可減輕大鼠EAU炎癥，但較妥布霉素地塞米松組效果略差。對(duì)大鼠脾臟淋巴結(jié)CD4+、CD8+值及Th1、Th17細(xì)胞比進(jìn)行測(cè)定，考慮清開靈減輕炎癥反應(yīng)的機(jī)制主要是抑制CD4+細(xì)胞的增生和分化，CD4+/CD8+降低，Th1、Th17效應(yīng)細(xì)胞分化被抑制，減少相應(yīng)炎性細(xì)胞因子分泌。

4 穴位埋線法

有研究證實(shí)，針灸對(duì)慢性炎癥性疾病有雙向調(diào)節(jié)作用。穴位埋線是在傳統(tǒng)針灸及穴位注射基礎(chǔ)上改進(jìn)，用特制的針具把可吸收的羊腸線埋入穴位，產(chǎn)生生物化學(xué)反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[35]。

郝小波教授團(tuán)隊(duì)對(duì)穴位埋線干預(yù)EAU大鼠進(jìn)行研究，穴位埋線于造模后第2天進(jìn)行，依據(jù)大鼠穴位圖譜選擇脾俞(第12胸椎下兩旁)、肋間(左右側(cè)各一穴)、腎俞(第2腰椎下兩旁，左右側(cè)各一穴) 進(jìn)行埋線操作，穴位埋線組與模型組炎癥反應(yīng)均在造模后13 d達(dá)到高峰，穴位埋線組炎癥評(píng)分低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理學(xué)顯示，在第9，13，18，23天虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜炎癥模型組均比穴位埋線組嚴(yán)重；采集大鼠心臟血液并分離淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析，第13天CD4+T細(xì)胞占比最高，CD8+T細(xì)胞占比最低[35-36]。對(duì)造模后第9，13，18，23天大鼠心臟血中IFN-γ、IL-4 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)穴位埋線可在炎癥期提升以IL-4為代表的炎癥保護(hù)因子的分泌，抑制以IFN-γ為代表的炎癥保護(hù)因子，從而減輕炎癥反應(yīng)，糾正Th1/Th2失衡[37]。

5 小 結(jié)

自身免疫性葡萄膜炎為CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)，大量實(shí)驗(yàn)表明葡萄膜炎主要原因是機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)自身抗原特異性的T淋巴細(xì)胞，主要包括Th1、Th2、Th17細(xì)胞亞群。中醫(yī)藥治療葡萄膜炎優(yōu)勢(shì)在于毒副作用少、復(fù)發(fā)率低，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)不少中藥具有免疫調(diào)節(jié)作用，EAU動(dòng)物模型的成熟，為中醫(yī)藥治療葡萄膜炎實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。從葡萄膜炎自身免疫性疾病特點(diǎn)出發(fā)，發(fā)揮中醫(yī)藥特色，對(duì)治療機(jī)制進(jìn)行深入探討，主要體現(xiàn)在對(duì)Th1、Th17細(xì)胞的獨(dú)立或協(xié)同抑制作用，對(duì)Th2細(xì)胞的保護(hù)作用及Treg細(xì)胞的介導(dǎo)抑制作用。立足于中醫(yī)藥學(xué)基本理論，應(yīng)用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)學(xué)科研技術(shù)開發(fā)中醫(yī)藥資源寶庫，已成為中醫(yī)藥發(fā)展的重要目標(biāo)。