基于GEO芯片挖掘聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學分析解毒化瘀顆粒治療肝癌的分子機制

姚元謙，呂建林，柳琳琳，毛德文，黃 嫻，黃小英

(1. 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001；2. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，主要為肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinona，HCC)，其病情發(fā)展迅速，病死率高，5年生存率低于15%。我國屬于肝癌高風險地區(qū)，主要與慢性乙型肝炎病毒感染及黃曲霉毒素暴露有關(guān)，經(jīng)統(tǒng)計2020年我國肝癌新發(fā)病例41萬，死亡病例39萬，占全球肝癌死亡病例的51%，是我國惡性腫瘤死亡的第二大誘因[1-2]。目前治療肝癌的手段包括局部的手術(shù)、放療、消融、介入治療，及全身性的化療、細胞免疫、靶向藥物治療等[3-5]，手術(shù)治療是肝癌早期的有效治療手段，可惜大部分患者確診時已是中晚期，故藥物干預是治療肝癌的重要手段。目前西醫(yī)治療不良反應較多，長期服用西藥還可能產(chǎn)生耐藥性，患者預后不佳[6-7]。中醫(yī)藥治療腫瘤有著悠久的歷史，療效確切，具有抑制腫瘤生長、提高患者生活質(zhì)量、減輕臨床癥狀等作用，中西醫(yī)聯(lián)合治療能夠減少西藥毒副作用，降低術(shù)后復發(fā)率，延緩病情進展，中醫(yī)藥防治腫瘤有著不可忽視的重要作用[8-9]。解毒化瘀顆粒是毛德文教授在“毒邪病因”原理指導下總結(jié)得出的臨床經(jīng)驗方，具有解毒祛邪、化瘀消癥之效，全方由茵陳、大黃、白花蛇舌草、赤芍、郁金、石菖蒲組成[10]。此方本是毛德文教授為治療肝衰竭而立，但其治病機制同樣也符合肝癌“毒、瘀、積”的病機治療[11]。此前研究已表明解毒化瘀顆粒治療肝疾病時，可通過NO-cGMP、NF-κB、c-Met等信號通路起到調(diào)控作用，涉及caspase、TNFR I、Gadd45a、SOCS、TGF-β等作用靶點[12]。本次研究整合GEO基因芯片數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)，進一步系統(tǒng)地分析解毒化瘀顆粒治療肝癌的潛在活性成分、作用靶點及調(diào)控途徑，并進行分子模擬驗證。

1 資料與方法

1.1挖掘GEO芯片獲取肝癌靶點 以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)篩選相關(guān)的基因芯片，獲取GSE84402芯片數(shù)據(jù)集，點擊“Series Matrix File”下載芯片數(shù)據(jù)并下載GPL570基因芯片注釋文件。利用R軟件對芯片數(shù)據(jù)進行分組，應用“l(fā)ima”、“pheatmap”程序包，以|logFC|≥1、adj.P.Val<0.05為篩選條件，獲取與肝癌相關(guān)的顯著性差異基因，分別選取上調(diào)基因與下調(diào)基因中的前20個基因繪制熱圖及火山圖。

1.2獲取解毒化瘀顆粒的活性成分及靶點 通過檢索TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、SymMap(www.symmap.org)數(shù)據(jù)庫獲取解毒化瘀顆粒中每味藥物的活性成分，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件進行收集。通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載各活性成分的3D Conformer數(shù)據(jù)文件，若PubChem數(shù)據(jù)庫中未收錄的活性成分則剔除，將3D Conformer數(shù)據(jù)上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行藥物靶點預測。

1.3篩選共同靶點并構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò) 將“1.1、1.2”項下的疾病、藥物靶點導入R軟件，應用“venn”程序包繪制藥物-疾病靶點Venn圖，并映射篩選出藥物-疾病交集靶點。將交集靶點提交至STRING平臺(https://string-db.org/)獲取PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，下載該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的TSV格式文件并導入Cytoscape 3.7.2進行拓撲分析，通過Degree值(連接度)的中位數(shù)篩選出解毒化瘀顆粒治療肝癌的核心靶點。

1.4生物信息富集分析 將“1.3”項下的交集靶點上傳至DAVID平臺(https://david.ncifcrf.gov/)，進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析和基因本體論(GO)功能富集分析，包括生物學過程(BP)、細胞組分(CC)及分子功能(MF)。根據(jù)PValue值選取相關(guān)度最高的分析結(jié)果，應用R軟件進行可視化處理。

1.5構(gòu)建活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò) 為了更清晰地展示解毒化瘀顆粒治療肝癌的作用機制，運用Cytoscape 3.7.2軟件繪制活性成分-基因靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Degree值預測解毒化瘀顆粒治療肝癌的主要活性成分。

1.6分子對接驗證 選取“1.5”項中主要活性成分的前5個作為小分子配體，選取與這5個活性成分連接度最高且是“1.3”項下的核心靶點作為蛋白受體。從TCMSP數(shù)據(jù)下載主要活性成分的MOL2文件，從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載蛋白受體的pdb文件，使用PyMOL軟件刪除蛋白受體的水分子及配體，運用AutoDockTools1.5.6軟件將MOL2文件及pdb文件轉(zhuǎn)換為pdbqt文件，并確定蛋白受體的活性口袋，最后通過AutoDock Vina軟件進行分子對接。

2 結(jié) 果

2.1肝癌GEO芯片差異基因分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE84402芯片數(shù)據(jù)集及基因芯片注釋文件，共收集28個樣本，其中cancertissue組(肝癌組織樣本)14例，non-canceroustissue組(癌旁組織樣本)14例。應用R軟件對芯片數(shù)據(jù)進行標準化及分組，并篩選顯著性差異基因。共獲得差異基因1 423個，其中在肝癌中表達上調(diào)的基因480個(如CCNB1、CDKN3、RACGAP1等)，在肝癌中表達下調(diào)的基因943個(如FCN2、ABCA8、OIT3等)。分別選取上調(diào)基因與下調(diào)基因的前20個繪制熱圖及火山圖，見圖1及圖2，圖中綠色為低表達，黑色為中表達，紅色為高表達。

2.2解毒化瘀顆粒的活性成分及靶點獲取 通過TCMSP、SymMap數(shù)據(jù)庫收集解毒化瘀顆粒中每味中藥的活性成分，共獲得84個活性成分。將活性成分上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行藥物靶點預測，選取每個活性成分中概率前100個靶點進行分析，共獲取2 116個藥物靶點，經(jīng)剔除重復靶點后剩余682個。

2.3交集靶點并構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò) 將藥物-疾病靶點數(shù)據(jù)導入R軟件，繪制Venn圖(見圖3)，并映射篩選出交集靶點122個。將122個交集靶點上傳至STRING平臺構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，下載該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的TSV格式并導入Cytoscape 3.7.2進行拓撲分析，根據(jù)Degree值(連接度)的中位數(shù)篩選出核心靶點，包括雌激素受體1(ESR1)(31)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)(24)、細胞色素P450 3A4酶(CYP3A4)(23)、MMP9(21)、雄激素受體(AR)(20)、CYP1A1(20)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C(PTPRC)(19)、胸苷酸合成酶(TYMS)(19)、周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)(19)、Polo樣激酶1(PLK1)(18)等，提示這些靶點在解毒化瘀顆粒治療肝癌中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，篩選流程見圖4。

2.4生物信息富集分析 將122個交集靶點提交至DAVID平臺進行富集分析，結(jié)果得到生物學進程條目204條，主要包括藥物反應、類固醇代謝過程、外源性代謝過程、環(huán)氧酶P450途徑等生物進程；得到細胞組分條目33條，主要在胞質(zhì)、細胞外泌體、核漿等處發(fā)揮作用；得到分子功能條目73條，主要包括ATP結(jié)合、蛋白同源二聚體化活性、氧化還原酶活性、蛋白激酶結(jié)合等；得到信號通路29條，主要富集在化學致癌作用通路、類固醇激素生物合成通路、細胞色素P450對外源性藥物的代謝作用通路、花生四烯酸代謝等通路上。應用R軟件對主要條目進行繪圖，見圖5及圖6。

2.5構(gòu)建活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò) 為了更加明確解毒化瘀顆粒治療肝癌的活性成分、基因靶點與作用通路之間的關(guān)系，故構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。其中橙色圓形節(jié)點為靶點，深紅色倒三角形節(jié)點為通路，淡紅色正方形節(jié)點為活性成分，節(jié)點越大說明連接度值越大。通過網(wǎng)絡(luò)圖可直觀看出，解毒化瘀顆粒對肝癌具有多途徑、多成分的作用機制。根據(jù)Degree值，預測其治療肝癌的主要活性成分，見表1。

表1 解毒化瘀顆粒治療肝癌的主要活性成分

2.6活性成分與靶點蛋白的分子對接 選取“2.5”項下的主要活性成分與“2.3”項下的核心靶點進行分子對接驗證，運用AutoDock Vina軟件進行對接并預測結(jié)合能力，結(jié)合能越低則構(gòu)象越穩(wěn)定。當結(jié)合能<0 kcal/mol時表明配體與受體間有結(jié)合活性，當結(jié)合能<-5.0 kcal/mol時表明結(jié)合良好[13]。結(jié)果顯示，異鼠李素-MMP9(-7.9 kcal/mol)、β-谷甾醇-ESR1(-8.2 kcal/mol)、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌-CYP1A2(-11.3 kcal/mol)、油酸乙酯- PTPRC(-5.7 kcal/mol)、茵陳黃酮- PTGS2(-8.8 kcal/mol)，提示各分子間具有較強的結(jié)合活性，見圖8。

3 討 論

解毒化瘀顆粒是毛德文教授多年臨證經(jīng)驗凝結(jié)而出，全方由茵陳30 g、大黃(后下)15 g、白花蛇舌草30 g、赤芍50 g、郁金15 g、石菖蒲15 g組成，諸藥相合，使熱去毒解，瘀散痰化，中焦氣機升降有序，肝膽疏泄氣暢血行，三焦通利，共奏解毒化瘀、生新見長之效[12]。前期研究已表明本方對肝臟疾病有防治作用，本次研究整合GEO基因芯片數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)，進一步系統(tǒng)地分析解毒化瘀顆粒治療肝癌的作用機制。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀顆粒治療肝癌的核心靶點有ESR1、PTGS2、CYP3A4、MMP9、AR、CYP1A1、PTPRC、TYMS、CDK1、PLK1等[13]。ESR1作為一種癌基因，是多種惡性腫瘤潛在的腫瘤抑制基因，在乳腺癌、非小細胞肺癌及宮頸癌中，ESR1的表達水平明顯下調(diào)[14-15]。研究表明ESR1也是肝癌的腫瘤抑制基因，低ESR1表達會促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲[16]，相反，ESR1的過度表達可以抑制肝癌細胞發(fā)展，同時誘導肝癌細胞的凋亡[17]。PTGS2與炎癥反應密切相關(guān)，研究認為炎癥反應是促進肝癌發(fā)展的因素，通過抑制PTGS2/COX-2可以防止黃曲霉毒素驅(qū)動肝癌的發(fā)生及進展[18]。CYP3A4是細胞色素P450氧化酶家族成員之一，參與肝臟物質(zhì)代謝過程，60%的臨床藥物都要經(jīng)其代謝轉(zhuǎn)化，它能抑制或增加藥物活性[19]，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌患者的肝癌組織中，CYP3A4的表達顯著降低[20]。MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)成員，參與正常生理過程中細胞外基質(zhì)的分解，MMP9與腫瘤的發(fā)生及進展有關(guān)。當MMP9表達上調(diào)降解細胞外基質(zhì)和基底膜，腫瘤細胞由此進入體循環(huán)形成新的腫瘤灶，同時MMP9促進新血管的生成以維持腫瘤生長[21]。有研究認為MMP9在肝癌生長浸潤及轉(zhuǎn)移過程中關(guān)系密切，可作為腫瘤分子標志物[22]。AR屬于核受體超家族中的類固醇受體，實驗發(fā)現(xiàn)肝癌中的巨噬細胞可能通過改變外泌體中的microRNA(miR-92a-2-5p)來降低肝癌細胞AR的表達，從而促進肝癌細胞的侵襲[23]。TYMS是臨床中腫瘤化療藥物的作用靶點，被認為是氟尿嘧啶類藥物的主要作用部位[24]，研究發(fā)現(xiàn)TYMS基因在肝癌中表達上調(diào)，可促進肝癌細胞DNA的合成，使腫瘤生長、擴散[25]。CDK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞周期調(diào)控中的重要因子。CDK1在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達上調(diào)，且與肝癌患者的預后相關(guān)，高表達的CDK1肝癌患者其預后較差[26]。

交集靶基因GO功能富集分析顯示，解毒化瘀顆粒治療肝癌主要涉及氧化還原過程、外源性代謝過程、環(huán)氧酶P450途徑、胞質(zhì)、細胞外泌體、ATP結(jié)合等方面。通過環(huán)氧酶P450生物途徑能夠?qū)⒒ㄉ南┧岽x為具有生物活性的類花生酸，類花生酸是包括炎癥在內(nèi)的許多生物過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，研究認為其能抑制肝臟炎癥[27]。細胞外泌體是包含了復雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡，其在肝癌細胞的增殖、凋亡、侵襲等方面起著重要的調(diào)控作用[28]，正常細胞源性外泌體對肝癌的生長及轉(zhuǎn)移有抑制作用[29]，而腫瘤細胞源性外泌體對肝癌的進展、擴散及耐藥性有促進作用[30]。KEGG通路富集分析得到29條信號通路，主要富集在化學致癌作用通路、類固醇激素生物合成通路、細胞色素P450對外源性藥物的代謝作用通路、花生四烯酸代謝通路、P53信號通路、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等途徑上，涉及較多的基因依次為CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、PIK3R1、ADH1B等，其中CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4也是PPI拓撲分析中的核心靶點，都為細胞色素P450氧化酶家族成員之一。目前認為黃曲霉毒素是肝癌的重要誘因之一，黃曲霉毒素是具有劇毒性、致畸性、免疫抑制性的化學致癌物，它可能通過化學致癌途徑誘導肝癌發(fā)生[31]。P53信號通路與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，其重要節(jié)點P53基因通常在癌癥患者中發(fā)生突變或失活，從而導致異常腫瘤細胞增殖[32]。有研究證實，通過miR-29b調(diào)控P53信號通路能夠抑制肝癌細胞增殖，并誘導肝癌細胞凋亡[33]。PI3K-Akt信號通路是已被確定的對癌癥有重要作用的主要信號通路之一，該通路在肝癌細胞中呈過度激活狀態(tài)，其通路中的節(jié)點是靶向藥物治療的重要靶點[34]。

進一步構(gòu)建活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀顆粒治療肝癌的主要活性成分可能為異鼠李素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌、油酸乙酯、茵陳黃酮。異鼠李素與β-谷甾醇均有一定的抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡。異鼠李素通過調(diào)控癌基因(P53、Survivin、Caspase-3)、腫瘤信號通路(MEK-ERK通路、MAPK/ERK通路)對腫瘤細胞起到治療作用[35]。研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素對人肝癌細胞有抑制作用，通過增強細胞內(nèi)活性氧水平將肝癌細胞阻滯在G2/M期并誘導其凋亡[36]。試驗證明，β-谷甾醇能夠增加IL-2、IFN-γ水平，抑制IL-6、IL-10水平，從而抑制肝癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移[37-38]。

最后利用分子對接技術(shù)進行虛擬驗證，對主要的活性成分與核心靶點進行對接分析，結(jié)果顯示所有對接結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol，表示各主要活性成分與核心靶點間具有良好的結(jié)合力。

綜上所述，解毒化瘀顆粒中的異鼠李素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9、10-蒽醌、油酸乙酯、茵陳黃酮等活性成分，通過上調(diào)ESR1、CYP3A4、CYP1A1、PTPRC及下調(diào)PTGS2、MMP9、AR、TYMS、CDK1、PLK1等核心靶點，調(diào)控化學致癌作用通路、細胞色素P450代謝通路、花生四烯酸代謝通路、P53信號通路、PI3K-Akt信號通路等途徑，涉及氧化還原過程、環(huán)氧酶P450途徑、細胞外泌體、ATP結(jié)合等生物功能，從而抑制肝癌細胞的增殖、侵襲、擴散及對藥物的耐藥性。本次分析結(jié)果表明解毒化瘀顆粒治療肝癌具有多途徑、多成分、多功能的作用機制，可對未來中醫(yī)藥防治肝癌的研究提供新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。