基于p38MAPK信號通路探討針刺療法對腦卒中后抑郁模型大鼠免疫因子的影響

劉麗莉，史 玲 ，冷 鳳

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟南 250355；2. 威海市中醫(yī)院，山東 威海 264200)

腦卒中后抑郁是腦卒中后引發(fā)的情感障礙綜合征，臨床表現(xiàn)為睡眠障礙、乏力、焦慮等。流調(diào)學(xué)顯示，腦卒中后抑郁占腦卒中發(fā)病患者的近1/3[1]。腦卒中后抑郁發(fā)病機制尚不明確，患者多伴有腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)等炎性因子表達異常，該病的發(fā)生可能與免疫調(diào)節(jié)異常有關(guān)[2-4]。相關(guān)研究表明，針刺能夠明顯改善抑郁模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，調(diào)控免疫因子表達，但其作用機制不明[5-6]?？苣鹊萚7]實驗研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)p38MAPK表達能夠抑制炎癥因子的釋放，從而改善腦卒中后抑郁?；诖?，本研究從p38MAPK信號通路角度探討了電針刺激對腦卒中后抑郁大鼠免疫炎性因子TNF-α、IL-1β及其受體蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)、白細胞介素-1β受體(IL-1βR)表達的影響，旨在為電針治療該病提供客觀依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 3月齡SPF級雌性Wistar大鼠36只，體重(200±20)g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)2020-0001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準，實驗過程及操作均遵守國家健康與醫(yī)學(xué)研究委員會(NHNRC)動物道德準則。

1.2儀器及試劑 纖毛機械刺激針(NC12775，美國StoeltingCo.)；HANS-200A 電針儀(南京濟生)； Benchmark Plus 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-RAD公司)；熒光顯微鏡(DM1000，德國徠卡)；水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；TNF-α ELISA檢測試劑盒(批號：E202002)、IL-1β ELISA檢測試劑盒(批號：E202004)、TRAF6 ELISA檢測試劑盒(批號：E202011)、IL-1βR ELISA檢測試劑盒(批號：E202010)均為上海聯(lián)碩生物科技有限公司生產(chǎn)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(C0003)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；p38 MAPK抗體(YT819)購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3實驗方法 將36只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組及針刺組，每組12只。模型組及針刺組大鼠均參照文獻[8]，采用Koizumi法建立腦卒中模型：采用10%水合氯醛麻醉大鼠后，仰臥位固定大鼠，頸部正中偏右側(cè)備皮，分離頸部肌肉后暴露大鼠氣管，從氣管右下側(cè)動脈處分離頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，手術(shù)線結(jié)扎固定后縫合消毒。術(shù)后24 h測定神經(jīng)功能缺損評分，取評分1～3分大鼠進行慢性不可預(yù)見性溫和刺激+單籠孤養(yǎng)法制備腦卒中后抑郁模型。造模成功后，針刺組將大鼠置于自制鼠袋中固定，參考文獻[8]取穴，暴露針刺穴位，將毫針刺入穴位后接電針儀，疏密波，刺激強度2 mA，2 Hz/100 Hz，每次15 min，1次/d，共干預(yù)14 d；空白組和模型組大鼠不給予干預(yù)。各組大鼠生長環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。

1.4檢測指標及方法

1.4.1免疫炎性因子水平 各組大鼠處死后心臟取血2 mL，置于離心機中， 3 000 r/min離心(離心半徑10 cm)10 min，取上清液，ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6和IL-1βR水平。

1.4.2海馬組織中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表達情況

1.4.2.1TUNEL法檢測 大鼠處死后，迅速取各組大鼠部分海馬組織，剪碎后置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)浸泡24 h，不同濃度乙醇按順序脫水后進行切片操作，脫蠟后將標本置于蘇木精中染色15 min，脫水透明10 min，TUNEL試劑盒檢測海馬組織切片標本中細胞凋亡情況，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.2.2Western blot法檢測 取各組大鼠部分海馬組織，剪碎后加入RIPA裂解緩沖液放置在冰上30 min，提取海馬組織中的總蛋白，然后使用BCA蛋白測定試劑盒測定海馬組織中蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)用SDS-PAGE進行等量分離，然后移至PDVF膜上，置于4 ℃下，添加一抗與β-actin(1∶500)孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶500)，常溫下孵育2 h。使用ECL試劑進行顯影，應(yīng)用QuantityOne軟件分析蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各種大鼠血清免疫炎性因子水平比較 模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6、IL-1βR水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，針刺組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6、IL-1βR水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和腦卒中后抑郁各組大鼠血清免疫炎性因子水平比較

2.2各組大鼠海馬組織中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表達TUNEL染色情況 激光共聚焦顯示，空白組大鼠海馬組織正常，TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表達(綠色熒光)極少；模型組大鼠TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表達明顯增多；針刺組大鼠TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表達明顯較模型組少。見圖1。

2.3各組大鼠海馬組織中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白相對表達量比較 模型組大鼠海馬組織中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白相對表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)，針刺組大鼠海馬組織中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖2。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將腦卒中后抑郁歸為“中風(fēng)”“郁病”等范疇，辨治該病時多從腦、肝、腎等入手。《內(nèi)經(jīng)》指出肝腎同源，“肝藏魂，腎藏志……”說明人類的高級精神、意識及思維活動與肝腎密切相關(guān)。肝主情志，肝失疏泄，則情志失養(yǎng)，久之則肝氣郁結(jié)，痰瘀互結(jié)阻塞腦竅；腎氣不足，無法生精化髓，腦失充養(yǎng)，則神明失用，從而導(dǎo)致卒中后抑郁發(fā)生，臨床表現(xiàn)為情志低落、記憶力下降、神情呆滯等。針刺穴位可供氣進入、傳出、交匯和聚積，常選用百會穴、大椎穴、內(nèi)關(guān)穴、太沖穴治療神志病，可顯著改善抑郁情緒，減輕睡眠障礙[9-10]，但具體機制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，針刺可干預(yù)中樞以及外周迷走神經(jīng)，改變中樞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，調(diào)節(jié)機體免疫相關(guān)細胞因子IL-2、IL-4、IL-10等表達[11-12]。

目前研究認為，腦卒中后抑郁發(fā)病與免疫因子代謝異常等多種因素有關(guān)，其中IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放和機體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系密切，炎癥細胞因子水平升高可引起大腦中吲哚胺-2，3-雙加氧酶升高，導(dǎo)致海馬組織中的5-羥色胺(5-HT) 含量下降，從而誘發(fā)抑郁[13-15]。炎癥在腦卒中后抑郁發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，是修復(fù)受損海馬組織以保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要生理反應(yīng)，而p38MAPK信號通路是炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要途徑[16-17]。p38MAPK是一類分化上保守的絲氨酸/蘇氨酸MAPK，參與調(diào)控基因表達、代謝活動以及細胞的凋亡和分化，其可通過氧化應(yīng)激、活化炎癥因子及觸發(fā)炎癥反應(yīng)等方式參與大腦、間腦、小腦和腦干的病理生理過程，成為各種腦病的致病媒介。非磷酸化狀態(tài)的p38無活性，當神經(jīng)細胞被各種應(yīng)激因素或炎癥因子刺激時，應(yīng)激信號就會激活MAPK激酶；p38MAPK活化可以結(jié)合細胞質(zhì)中的促凋亡蛋白、炎癥受體蛋白等多種反應(yīng)底物，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和特異性細胞因子的表達，誘導(dǎo)細胞分化與凋亡、炎癥反應(yīng)，減緩受損神經(jīng)元凋亡的進程[18-20]。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6、IL-1βR水平及海馬組織中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表達量均明顯升高，說明腦卒中后抑郁p38MAPK信號通路活化，產(chǎn)生大量炎癥因子；針刺組大鼠上述指標水平均明顯低于模型組，證實針刺能夠調(diào)節(jié)腦卒中后抑郁大鼠p38MAPK信號通路的活化，進而影響體內(nèi)免疫因子及其受體蛋白的表達。

綜上所述，針刺治療能夠下調(diào)卒中后抑郁大鼠體內(nèi)免疫炎性因子及其受體蛋白的表達，其機制可能與調(diào)控p38MAPK信號通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。