乳酸鋅和硫酸鋅對豬腸上皮細胞鋅轉(zhuǎn)運載體和屏障功能影響的比較研究

侯若鑫 龍 靜 彭 燦 何流琴* 李鐵軍* 湯文杰 鄺聲耀 印遇龍

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙 410125；2.中國科學院大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學學院，北京 100049；3.湖南師范大學生命科學學院，動物腸道功能調(diào)控湖南省重點實驗室，長沙 410081；4.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長沙 410128；5.四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川省畜科飼料有限公司，成都 610066)

腸道是動物機體內(nèi)消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，也是最大的免疫器官，是阻止病原微生物感染的第1道屏障，具有重要的防御功能。進入腸道中的營養(yǎng)物質(zhì)首先與腸道黏膜直接接觸，腸道黏膜屏障主要由健康完整的腸道上皮細胞和細胞間的緊密連接構(gòu)成，故腸道上皮細胞是維持腸道屏障功能和免疫調(diào)節(jié)功能的主要執(zhí)行者[1]。研究表明，腸道屏障功能紊亂會造成腸道上皮細胞通透性的增加，導致有害物質(zhì)進入細胞后促進炎癥因子的表達和分泌，加速動物機體的炎癥反應[2-3]。因此，調(diào)節(jié)腸上皮細胞的緊密連接蛋白表達和細胞因子含量對維持腸道屏障功能具有十分重要的意義[3]。

鋅是哺乳動物必需的微量元素之一，是機體多種酶的重要組成成分和激活因子，參與細胞內(nèi)信號傳導和代謝增殖，在細胞生長、免疫功能和營養(yǎng)代謝等生理或病理過程中起著關(guān)鍵作用。鋅還是豬飼糧中使用的一種促生長添加劑，能調(diào)節(jié)腸道菌群和減少組胺釋放，有效緩解仔豬斷奶應激[4-7]。研究表明，飼糧中添加鋅可以降低斷奶后仔豬腹瀉的發(fā)生率，改善腸道屏障的結(jié)構(gòu)和功能[8]。動物缺鋅則會損害消化、免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌和皮膚系統(tǒng)，導致T淋巴細胞數(shù)量減少、氧化應激、腸道功能障礙和炎癥細胞浸潤等[9-10]。此外，飼糧中添加有機鋅對動物生長性能的作用效果要優(yōu)于無機鋅。俞成浩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，同等劑量的乳酸鋅對肉兔生長性能的提高效果要好于硫酸鋅。王榮蛟等[12]研究表明，飼糧中添加乳酸鋅可極顯著提高仔豬小腸絨毛高度，降低隱窩深度，改善養(yǎng)分消化利用率，提高仔豬的生長性能。王彬等[13]研究表明，飼糧中添加納米氧化鋅和普通氧化鋅能顯著提高生長育肥豬血清中免疫球蛋白A(IgA)含量，顯著提高血清中白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，提高生長性能，降低腹瀉率。目前關(guān)于乳酸鋅和硫酸鋅對動物腸道健康的作用更多是體現(xiàn)在一些表觀指標上，作用機制與效果的對比研究甚少。因此，本研究以仔豬空腸上皮細胞系IPEC-J2細胞為模型，探討乳酸鋅和硫酸鋅對豬小腸上皮細胞緊密連接蛋白、炎癥細胞因子及鋅轉(zhuǎn)運載體的影響，旨在了解兩者在調(diào)節(jié)仔豬小腸細胞屏障和炎癥反應方面可能發(fā)揮的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

IPEC-J2細胞由中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料工業(yè)中心惠贈。

1.2 試驗材料

乳酸鋅(鋅含量21.5%)、硫酸鋅(鋅含量21.5%)由四川省某飼料有限公司提供；硫酸鋅配制時用基礎培養(yǎng)基DMEM溶解，0.22 μm除菌過濾器過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。細胞基礎培養(yǎng)基DMEM/F-12(1∶1)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(2.5 g/L)以及青(鏈)霉素均購自Gibco公司，總RNA提取反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量試劑盒均購于北京TaKaRa公司，細胞活力試劑盒與炎癥因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.3 IPEC-J2細胞培養(yǎng)

將復蘇的IPEC-J2細胞接種于含有1%雙抗和10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%的二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)中培養(yǎng)，當細胞密度達到80%～90%時消化傳代，進行后續(xù)試驗。

1.4 細胞活力檢測

使用細胞計數(shù)試劑盒(8肽膽囊收縮素，CCK-8)檢測細胞活力(Dojindo，日本)。IPEC-J2細胞以8×103個/孔的密度接種于96孔板中，生長至融合度為80%；然后分別用含0(對照)、1.0、5.0、7.5、10.0和20.0 mg/mL乳酸鋅或硫酸鋅(以鋅計)的DMEM處理細胞，處理時間選擇36 h[14]，每個濃度水平設置8孔重復。處理完成后，將10 mol/L CCK-8溶液加入96孔板培養(yǎng)的細胞中，37 ℃孵育30 min，用酶標儀在450 nm處測定吸光度(OD)值，并計算細胞活力。計算公式如下：

細胞活力=100×[A(加藥)-A(空白)]/

[A(0加藥)-A(空白)]。

式中：A(加藥)表示具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值；A(空白)表示具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的OD值；A(0加藥)表示具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的OD值。

1.5 IPEC-J2細胞處理

試驗共分為3組：對照組、乳酸鋅組和硫酸鋅組，每組3個重復。將消化后的IPEC-J2細胞以均等的濃度接種至6孔板中，共接種6板，待細胞生長至約80%時，棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次，更換為篩選出的7.5 mg/mL乳酸鋅和硫酸鋅培養(yǎng)基處理36 h。每孔加入2 mL處理液，收集細胞培養(yǎng)上清液及細胞，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細胞因子含量測定

收集培養(yǎng)基于離心管，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清待測。根據(jù)IL-6、TNF-α、白細胞介素-1β(IL-1β)、富含半胱氨酸腸蛋白1(CRIP1)、富含半胱氨酸腸蛋白2(CRIP2)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)操作步驟，將標準品工作液和待測樣品加入酶標板中，每孔100 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 min。棄去液體，每孔加入100 μL的生物素化抗體工作液，覆膜，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min。洗板3次。每孔中加入酶結(jié)合工作液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，重復洗板3次。每孔加入底物溶液90 μL，覆膜置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育15 min。最后向每孔加入終止液50 μL，終止反應后30 min之內(nèi)用酶標儀在波長450 nm處測量各孔的OD值。計算炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.7 mRNA相對表達量測定

采用實時熒光定量PCR法測定IPEC-J2細胞TNF-α、IL-6、IL-1β、鋅轉(zhuǎn)運蛋白-1(ZNT-1)、CRIP1、CRIP2、封閉蛋白-1(claudin-1)和閉合蛋白(occludin)的mRNA相對表達量。根據(jù)GenBank提供的豬基因序列，用Primer Express 5.0軟件設計引物。引物序列見表1，引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

按照Trizol試劑盒(TaKaRa公司，日本)使用說明提取總RNA。RNA質(zhì)量和濃度使用超微量核酸分析儀(Biodrop公司，英國)進行檢測，其純度以OD260 nm/OD280 nm值介于1.8～2.0為使用標準。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板使用熒光定量PCR(CFX96，Bio-Rad公司，英國)進行基因擴增。反應程序為：95 ℃ 3 min預變性，95 ℃ 10 s變性；58 ℃ 30 s延伸；40個循環(huán)。各基因的mRNA相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測

當IPEC-J2細胞融合處理完成后，棄去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，冰上裂解10 min，收集細胞于1.5 mL的EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清置于新的EP管中備用；根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積二喹啉甲酸(BCA)試劑A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制適量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白標準品，濃度為2 mg/mL，將標準品分別按0(對照)、1、2、4、8、12、16和20 μL加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL。加25 μL樣品到96孔板的樣品孔中；各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min；測定550 nm波長的OD值。根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。采用BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測定550 nm波長的OD值。根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。取60 μL蛋白上清，加入15 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。制膠電泳后轉(zhuǎn)膜封閉，一抗二抗依次孵育(表2)，增強化學發(fā)光(ECL)顯色曝光，掃描膠片，用凝膠成像處理系統(tǒng)分析claudin-1和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)條帶灰度值。

表2 抗體孵育比例

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2019軟件進行整理和分析，然后使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)，單因素方差分析顯著時，采用Duncan氏法對數(shù)據(jù)進行多重比較，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值(mean)±標準誤(standard error，SE)表示，以P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞活力的影響

由圖1可知，與對照組相比，5.0和7.5 mg/mL乳酸鋅組細胞活力均顯著升高(P<0.05)，且7.5 mg/mL乳酸鋅組細胞活力較對照組提高近50%；1.0、7.5和10.0 mg/mL硫酸鋅組細胞活力均顯著升高(P<0.05)；當濃度為7.5 mg/mL時，乳酸鋅組和硫酸鋅組細胞活力均顯著高于對照組(P<0.05)。綜合考慮，選擇7.5 mg/mL乳酸鋅或硫酸鋅處理36 h進行后續(xù)試驗。

同一折線數(shù)據(jù)點標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)；*表示同一濃度不同鋅源差異顯著(P<0.05)。

2.2 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞炎性因子分泌和表達的影響

由表3可知，與對照組相比，乳酸鋅組細胞內(nèi)促炎癥因子IL-1β和IL-6含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了21.72%和50.37%，而細胞內(nèi)TNF-α含量無顯著影響(P>0.05)；硫酸鋅組細胞內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了40.62%、38.23%和31.30%。

表3 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞炎性因子含量的影響

由表4可知，與對照組相比，乳酸鋅組和硫酸鋅組細胞內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量均有所降低，其中，乳酸鋅組細胞內(nèi)TNF-α的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，硫酸鋅組細胞內(nèi)IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。

表4 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞炎性因子mRNA相對表達量的影響

2.3 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞鋅轉(zhuǎn)運載體的影響

由表5可知，與對照組相比，乳酸鋅組和硫酸鋅組細胞內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運載體CRIP1和CRIP2的含量均有所提高，其中硫酸鋅組顯著提高(P<0.05)。

表5 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞鋅轉(zhuǎn)運載體含量的影響

由表6可知，與對照組相比，乳酸鋅組細胞內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運載體ZNT-1、CRIP1和CRIP2的mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)；硫酸鋅組細胞內(nèi)僅ZNT-1和CRIP2的mRNA相對表達量顯著提高(P<0.05)，且效果都略低于乳酸鋅組。

表6 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞鋅轉(zhuǎn)運載體mRNA相對表達量的影響

2.4 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞緊密連接蛋白的影響

由圖2-A可知，與對照組相比，乳酸鋅組細胞內(nèi)claudin-1 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，乳酸鋅組和硫酸鋅組細胞內(nèi)occludin mRNA相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。由圖2-B和圖2-C可知，與對照組相比，乳酸鋅組細胞內(nèi)緊密連接蛋白claudin-1的蛋白相對表達量顯著提高(P<0.05)，硫酸鋅組細胞內(nèi)claudin-1的蛋白相對表達量無顯著差異(P>0.05)；乳酸鋅組和硫酸鋅組細胞內(nèi)E-cadherin的蛋白相對表達量均無顯著差異(P>0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞活力和物理屏障功能的影響

本研究結(jié)果表明，IPEC-J2細胞中添加1.0～10.0 mg/mL的乳酸鋅或硫酸鋅，均能不同程度地提高細胞活力，但當濃度超過10 mg/mL時則會嚴重影響IPEC-J2細胞活力，這可能是因為過量鋅與其他元素如硒、鐵、鈣和銅產(chǎn)生拮抗性，抑制細胞的增殖并過度影響細胞的通透性，從而破壞了細胞結(jié)構(gòu)[15]。而當濃度為7.5 mg/mL時，細胞活力的提升均達到最高，這可能是因為此時的鋅吸收轉(zhuǎn)運和利用的效率最高，并協(xié)同其他元素共同促進細胞的增殖分化。

緊密連接位于上皮和內(nèi)皮側(cè)膜的最頂端，能夠調(diào)節(jié)水和溶質(zhì)的平衡。claudin-l被鑒定為定位于腸道上皮細胞上緊密連接的完整膜蛋白，可通過減少細胞旁流量來影響細胞屏障功能[16]。E-cadherin是一種在上皮細胞中表達的黏附蛋白，不僅會對組織內(nèi)部細胞黏附狀態(tài)造成影響，還能維持上皮細胞正常的組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)[16]。當緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能被破壞的時候，腸道通透性會有所增加，腸道屏障功能受損[17]。鋅對腸道屏障功能目前已經(jīng)有許多發(fā)現(xiàn)，萬妍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2 000～3 000 mg/kg氧化鋅可以上調(diào)細胞緊密連接蛋白claudin-1和occludin的表達來維持腸道通透性和完整性。本試驗結(jié)果表明，添加乳酸鋅可顯著上調(diào)IPEC-J2細胞緊密連接蛋白claudin-1的表達，維護腸道黏膜結(jié)構(gòu)，從而改善小腸上皮細胞的屏障功能；而乳酸鋅下調(diào)claudin-1 mRNA的表達可能是因為mRNA降解和蛋白量增加負反饋調(diào)節(jié)mRNA表達。同時，本研究中添加硫酸鋅對IPEC-J2細胞claudin-1的表達無顯著影響，這可能是由于無機鋅在消化過程中釋放出的金屬離子易與其他物質(zhì)(如植酸、草酸和磷酸根離子)結(jié)合成不溶性鹽排除體外，從而降低了硫酸鋅的生物利用率。有研究表明，鋅缺乏會導致人結(jié)腸癌細胞Caco-2的occludin和E-cadherin含量大幅度降低[19]；而Davin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，硫酸鋅能上調(diào)Caco-2細胞的蛋白激酶C信號分子，提高occludin和E-cadherin的表達。本研究結(jié)果與上述結(jié)果都不一致，表明添加乳酸鋅和硫酸鋅對occludin mRNA和E-cadherin的表達均無顯著影響，這可能是因為在IPEC-J2細胞中鋅對物理屏障功能的影響不涉及此蛋白的變化，而是在其他細胞中發(fā)揮作用。

3.2 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞免疫屏障的影響

體內(nèi)鋅缺乏會導致腸黏膜免疫屏障受損并伴隨炎癥細胞的浸潤，過度表達的促炎細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α會損害腸道的完整性和上皮細胞的功能[9-10]。本試驗結(jié)果表明，添加乳酸鋅和硫酸鋅均可顯著降低IPEC-J2細胞中IL-1β和IL-6含量，這一結(jié)果與刁慧等[8]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中補充鋅可以降低促炎細胞因子IL-1β、IL-6和白細胞介素-8(IL-8)含量的結(jié)果相一致。馬茂濤[21]研究表明，牡蠣多糖鋅配合物能顯著提高斷奶仔豬空腸黏膜抗炎性因子白細胞介素-2含量，顯著降低空腸黏膜TNF-α含量。Zhao等[22]研究表明，金針菇鋅多糖對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞促炎癥因子TNF-α和IL-6的表達有強烈的抑制作用，提示有機鋅可抑制促炎癥因子的表達。本試驗中，添加乳酸鋅對IPEC-J2細胞TNF-αmRNA表達抑制作用較硫酸鋅更加明顯，這不僅說明鋅可能會介導炎癥信號的轉(zhuǎn)導過程，降低促炎細胞因子的表達和分泌，緩解腸道炎癥反應和提高腸道免疫屏障功能，還說明乳酸鋅和硫酸鋅可能在促炎癥因子轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上發(fā)揮的作用并不一致，且乳酸鋅的作用效果可能更佳。

3.3 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細胞鋅轉(zhuǎn)運功能的影響

鋅離子是親水性帶電離子，在機體內(nèi)不能以簡單的被動擴散方式進行跨膜轉(zhuǎn)運，因此，細胞內(nèi)外鋅離子轉(zhuǎn)運及穩(wěn)態(tài)維持主要依靠鋅轉(zhuǎn)運蛋白來實現(xiàn)。ZNT-1是一種雙功能蛋白，介導鋅從細胞質(zhì)出口到細胞器或細胞外，在促進胞質(zhì)內(nèi)鋅外流的同時還可以抑制鋅通過L型鈣通道[23]。Shusterman等[24]研究發(fā)現(xiàn)，將胚胎小鼠的純合ZNT-1基因敲除，胚胎移植不久后就將死亡，表明ZNT-1是胎兒從母體攝取鋅的一種重要蛋白分子。本試驗結(jié)果表明，乳酸鋅和硫酸鋅處理顯著上調(diào)IPEC-J2細胞ZNT-1的mRNA表達，表明兩者可能對鋅的轉(zhuǎn)運有促進作用，且乳酸鋅的效果更加顯著，這或是由于有機鋅在轉(zhuǎn)錄水平上生物利用率更高的原因。富含半胱氨酸腸蛋白(CRIP)主要存在于小腸中，是一種飽和的鋅離子轉(zhuǎn)運載體，在鋅離子轉(zhuǎn)運吸收、維持管腔結(jié)構(gòu)營養(yǎng)吸收等方面可發(fā)揮重要的作用[25-26]；并且CRIP可參與細胞因子平衡及免疫細胞的分化或成熟，在宿主的免疫防御反應中發(fā)揮重要作用[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同鋅源處理均能提高IPEC-J2細胞CRIP1、CRIP2鋅轉(zhuǎn)運蛋白的含量，但硫酸鋅的提高作用更加顯著；然而，乳酸鋅對CRIP1、CRIP2 mRNA相對表達量的上調(diào)作用則更為顯著。mRNA和蛋白水平是一個相偶聯(lián)的過程，但是兩者沒有必然的一致的趨勢，這可能是因為多種影響因素影響這一過程，比如mRNA的降解、蛋白的降解、自身表達產(chǎn)生阻遏、修飾折疊等。綜上所述，乳酸鋅和硫酸鋅均可不同程度提高鋅轉(zhuǎn)運載體的表達和分泌，可能對鋅從腸細胞頂膜到基底膜的轉(zhuǎn)運有促進作用，因而參與細胞內(nèi)信號傳導和細胞增殖，維持上皮細胞的生長分化，提高機體腸道免疫功能，且硫酸鋅的作用效果更優(yōu)。

4 結(jié) 論

當乳酸鋅和硫酸鋅添加濃度為7.5 mg/mL時，可最大限度提升IPEC-J2細胞活力，調(diào)節(jié)炎癥細胞因子的分泌和表達，一定程度上促進鋅的轉(zhuǎn)運，從而改善腸上皮細胞免疫功能；但僅有添加乳酸鋅可上調(diào)IPEC-J2細胞緊密連接蛋白的表達，改善腸道屏障功能，故乳酸鋅效果優(yōu)于硫酸鋅。