乳酸菌和留茬高度對受風災倒伏全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物組成的影響

楊晶晶 孫 蕓 吳慶宇 王 健 張嘉賓 孫海霞 曹 陽*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，大慶 163319；3.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081)

隨著全球氣候變化不斷加劇，除了沿海地區(qū)頻繁發(fā)生自然災害，近年來內(nèi)陸也常遭受臺風、暴雨等的侵襲。2020年8月27日臺風“巴威”、9月3日臺風“美莎克”、9月8日臺風“海神”陸續(xù)登陸黑龍江省，大多數(shù)農(nóng)作物遭受臺風以及強降雨的影響，全省受災面積約為3 022萬畝(1畝≈666.67 m2，絕產(chǎn)面積102萬畝，減產(chǎn)面積2 920萬畝)，初步估損金額27.52億元[1]。其中，部分地區(qū)玉米發(fā)生倒伏情況嚴重，不同程度的倒伏不僅增加了全株玉米收割時的難度，而且嚴重影響了收獲作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[2]。玉米植株遭遇倒伏之后，接觸土壤，土沙本身降低飼料品質(zhì)，同時泥土中生存著大量的微生物。通常1 g土壤中有幾億至幾百億個微生物，其種類和數(shù)量隨土層深度的不同而變化[3]。微生物從種類上看，包括細菌、真菌、放線菌、原生動物、藻類以及病毒等；從數(shù)量上來看，以細菌最多，霉菌次之，放線菌和酵母菌最少[4-6]。植株倒伏還會破壞玉米葉片在空間的正常營養(yǎng)分布，引起葉片部分的光合速率迅速下降，阻礙水分和養(yǎng)分從根系到葉片部分的輸送，進而影響了從葉片到果穗部分光合產(chǎn)物的運輸[7-8]。如果莖稈發(fā)生較為嚴重的倒折情況，就會造成傷口及以上部分植株死亡，籽粒灌漿和光合速率停止，玉米產(chǎn)量急劇下降甚至造成絕收[9-11]。風災倒伏玉米多數(shù)水分含量比較高，不及時收獲容易發(fā)生腐爛，造成粗飼料資源浪費。青貯是將青綠多汁飼料進行充分的壓實密封，使其與外部空氣隔絕形成厭氧環(huán)境，促進青綠飼料發(fā)酵以達到長期保存的目的，是減少青綠飼料營養(yǎng)成分損失最主要和應用最為廣泛的方法之一[12]。青貯后的全株玉米能值高、易消化、適口性好，已成為反芻家畜飼糧中主要成分[13]。因此，最經(jīng)濟可行的措施是將倒伏全株玉米調(diào)制成青貯飼料，以供草食家畜食用。

本試驗通過對倒伏與直立玉米植株、添加乳酸菌和不同留茬高度對其營養(yǎng)成分、青貯發(fā)酵品質(zhì)以及附著微生物展開研究，探索各指標的內(nèi)在關系，明確倒伏玉米最優(yōu)的青貯條件，為提高粗飼料的利用率、生產(chǎn)高品質(zhì)安全的倒伏全株玉米飼料產(chǎn)品以及為其他受災倒伏玉米青貯調(diào)制提供科學的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

對黑龍江省大慶市大同區(qū)、讓胡路區(qū)和紅崗區(qū)3個地點的倒伏及直立蠟熟期全株玉米分別進行采樣，玉米品種均為中原單32。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)制劑(日本雪印種苗株式會社生產(chǎn))由日本國立畜產(chǎn)草地研究所提供，活菌數(shù)為109CFU/g，使用方法和劑量依據(jù)其包裝說明書。

1.2 試驗設計

原料指標采用兩因素(2受災狀況×4留茬高度)、青貯飼料指標采用三因素(2受災狀況×2添加×4留茬高度)完全隨機試驗設計，倒伏、直立(對照)全株玉米留茬高度為10、20、30和40 cm，將樣品切碎至2～3 cm，各處理莖稈、葉、籽實充分混合均勻，并進行植物乳桿菌制劑添加和無添加處理。植物乳桿菌制劑的添加方法為菌粉與無菌水按1∶400比例混合均勻配制成菌液，并將菌液按1∶100比例添加于青貯原料中，即菌劑最終添加量為0.000 25%。以上各處理分別稱重200 g，然后裝入聚乙烯包裝袋(160 mm×250 mm)中進行真空密封包裝，每個處理設定3個重復，于室溫[(24±2)℃]條件下貯藏30 d后，取樣測定分析相關指標。

1.3 指標測定

1.3.1 感官品質(zhì)評定

參照青貯飼料質(zhì)量評定標準[14]，對開袋后各處理的全株玉米青貯樣品的顏色、氣味、質(zhì)地以及有無霉變等方面進行感官品質(zhì)評價。

1.3.2 常規(guī)營養(yǎng)成分指標

將開袋后的各處理全株玉米青貯樣品置于電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG-9240B型，上海森信實驗儀器有限公司)中恒重(65 ℃)。采用微型植物破碎機(FZ-102型，臨沂正衡華玻儀器有限公司)將樣品粉碎至0.5 mm備用。參照AOAC(1990)[15]的方法，采用電熱恒溫鼓風干燥箱測定樣品中干物質(zhì)(DM)含量，采用自動凱氏定氮儀(K1100F，濟南海能儀器股份有限公司)測定樣品中粗蛋白質(zhì)(CP)含量，采用索氏提取器測定樣品中粗脂肪(EE)含量，采用馬弗爐(SX2-4-10，天津中環(huán)實驗電爐有限公司)測定樣品中有機物(OM)含量。參照Van Soest等[16]的方法，采用纖維分析儀(ANKOM A200i，北京安科博瑞科技有限公司)測定樣品中中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。

1.3.3 發(fā)酵品質(zhì)測定

取10 g各處理青貯樣品置于聚乙烯袋中，加入90 mL滅菌蒸餾水，用均質(zhì)器(BAGMIXER-400W，Interscience，法國)拍打90 s直至充分混勻[17]。采用便攜式pH計(FG2-FK型，上海巴玖實業(yè)有限公司)對浸提液的pH進行測定。取部分浸提液進行過濾，濾液經(jīng)高速冷凍離心機(6 500×g、4 ℃)離心5 min，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。參照Cao等[18]的方法，采用高效液相色譜儀(LC-100)分析測定乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)以及丁酸(BA)的含量。

1.3.4 微生物數(shù)量分析

采用平板計數(shù)法對各處理全株玉米青貯中乳酸菌(lactic acid bacteria)、芽孢桿菌(Bacillus)、好氧性細菌(aerobic bacteria)、酵母菌(yeast)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、霉菌(mold)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)進行計數(shù)[19]。取10 g樣品裝入聚乙烯包裝袋中，加入90 mL無菌蒸餾水，利用均質(zhì)器(BAGMIXER-400W，Interscience，法國)均質(zhì)90 s，并進行連續(xù)倍數(shù)梯度稀釋(10、102、103、104和105倍)。取稀釋后的浸提液20 μL，滴加到提前預備的培養(yǎng)基上。乳酸菌和丁酸梭菌分別使用MRS瓊脂培養(yǎng)基和強化梭菌鑒別瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物科技有限公司)，置于厭氧培養(yǎng)箱(30 ℃、48 h)中培養(yǎng)；酵母菌和霉菌使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、大腸桿菌使用淺藍肉湯瓊脂培養(yǎng)基、好氧性細菌和芽孢桿菌使用標準瓊脂培養(yǎng)基(Nissui Ltd.，日本)，置于恒溫培養(yǎng)箱(30 ℃、48 h)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)芽孢桿菌和丁酸梭菌前，需將浸提液在75 ℃水浴15 min。經(jīng)過培養(yǎng)后的微生物在適當稀釋倍數(shù)產(chǎn)生30～300個菌落的情況下，進行菌落計數(shù)，并用對數(shù)lg(CFU/g FM)(FM表示鮮物質(zhì)基礎)表示菌落數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進行匯總和整理，原料指標采用兩因素、青貯飼料指標采用三因素完全隨機設計，使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件中一般線性模型(GLM)對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，并用Duncan氏法對平均值進行多重比較。結果以“平均值±標準差”表示。P<0.01為極顯著水平，P<0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 留茬高度對倒伏與直立全株玉米原料中營養(yǎng)成分及微生物組成的影響

由表1可知，青貯前，倒伏組全株玉米原料中NDF和ADF含量略高于直立組(P>0.05)，而DM、CP以及EE含量則低于直立組(P>0.05)，其中，倒伏玉米在留茬30 cm時CP含量最高。不同留茬高度對玉米NDF含量也有影響，倒伏組留茬10 cm時顯著高于留茬30和40 cm時(P<0.05)，倒伏組留茬20 cm時顯著高于留茬40 cm時(P<0.05)，直立組留茬10和20 cm時均顯著高于留茬30和40 cm時(P<0.05)。

表1 留茬高度對倒伏與直立全株玉米原料中營養(yǎng)成分的影響

由表2可知，隨著留茬高度的增加，直立組全株玉米原料中酵母菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，并且在留茬40 cm時顯著高于倒伏組(P<0.05)，所有玉米原料均未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、丁酸梭菌以及霉菌，受災狀況和留茬高度對酵母菌數(shù)量有顯著交互作用(P<0.05)。

表2 留茬高度對倒伏與直立全株玉米原料中微生物組成的影響

2.2 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯感官品質(zhì)的影響

由表3可知，全株玉米青貯均無霉變，大多呈黃綠色，除倒伏和直立30 cm留茬及添加處理有較濃的酸香味外，其余各處理均為適宜酸香味，且莖葉柔軟、濕潤。

表3 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯感官品質(zhì)的影響

2.3 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯營養(yǎng)成分的影響

由表4可知，倒伏組玉米青貯CP含量低于直立組，其中倒伏組10和20 cm留茬處理顯著低于直立組(P<0.05)。添加乳酸菌后，玉米青貯DM含量高于無添加處理，其中倒伏組20 cm留茬及添加處理顯著高于無添加處理(P<0.05)；倒伏組10和20 cm留茬及添加處理CP含量均顯著高于無添加處理(P<0.05)。隨著玉米留茬高度的增加，玉米青貯CP含量顯著提高(P<0.05)，其中倒伏組30和40 cm留茬及無添加處理顯著高于10和20 cm留茬及無添加處理(P<0.05)，直立組40 cm留茬及添加處理顯著高于10 cm留茬及添加處理(P<0.05)。倒伏組10和20 cm留茬處理(添加和無添加)玉米青貯NDF含量均顯著高于30和40 cm留茬處理(P<0.05)；直立組10 cm留茬處理(添加和無添加)NDF含量顯著高于30和40 cm留茬處理(P<0.05)，并且20 cm留茬處理顯著高于40 cm留茬處理(P<0.05)；倒伏組10 cm留茬及添加處理玉米青貯OM含量顯著低于30和40 cm留茬及添加處理(P<0.05)。

表4 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯營養(yǎng)成分的影響

2.4 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表5可知，倒伏組玉米青貯LA含量低于直立組，其中20、30和40 cm留茬處理均顯著低于直立組(P<0.05)；倒伏組30和40 cm留茬處理玉米青貯AA含量均顯著低于直立組(P<0.05)。添加乳酸菌后，玉米青貯pH顯著降低(P<0.05)，而LA含量提高，其中直立組20和30 cm留茬處理均顯著高于無添加處理(P<0.05)。不同留茬高度對玉米青貯LA含量也有影響，其中倒伏組10 cm留茬及添加處理玉米青貯LA含量顯著高于30和40 cm留茬及添加處理(P<0.05)；直立組40 cm留茬及無添加處理玉米青貯LA含量顯著高于20和30 cm留茬及無添加處理(P<0.05)，直立組30 cm留茬及添加處理玉米青貯LA含量顯著高于40 cm留茬及添加處理(P<0.05)。倒伏組10 cm留茬及添加處理玉米青貯AA含量顯著高于30和40 cm留茬及添加處理(P<0.05)。所有玉米青貯均未檢測出BA，乳酸菌添加和留茬高度對玉米青貯LA含量有顯著交互作用(P<0.05)。

表5 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.5 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯微生物組成的影響

由表6可知，倒伏組30 cm留茬及添加處理玉米青貯乳酸菌數(shù)量顯著高于無添加處理(P<0.05)，直立組20和30 cm留茬及添加處理玉米青貯酵母菌數(shù)量均顯著低于無添加處理(P<0.05)，而直立組20 cm留茬及添加處理玉米青貯大腸桿菌數(shù)量顯著低于無添加處理(P<0.05)，所有玉米青貯均未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、丁酸梭菌和霉菌。

表6 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯微生物組成的影響

3 討 論

3.1 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯感官品質(zhì)的影響

優(yōu)質(zhì)青貯的顏色接近原料的色澤，酸香氣味，可見清晰的莖葉結構，濕潤不黏手[20]。楊麗萍等[21]認為添加微生物制劑的試驗組青貯氣味及色澤優(yōu)于對照組。本試驗得出，不同留茬高度對倒伏及直立全株玉米青貯感官品質(zhì)影響不大。趙雪嬌[22]、李明超[23]也得出不同留茬高度對玉米青貯感官品質(zhì)沒有影響，與本試驗結果一致。

3.2 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯營養(yǎng)成分的影響

全株玉米青貯的營養(yǎng)成分是判定玉米青貯品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標之一。青貯能很好地保存飼料的CP，增強動物的適口性，優(yōu)質(zhì)的青貯玉米DM及CP含量較高，而纖維含量較低[24]。本試驗得出，玉米受災狀況對其營養(yǎng)成分有一定的影響，倒伏玉米原料DM、CP含量低于直立玉米，青貯后的倒伏玉米CP、DM以及NDF含量均低于直立玉米，而ADF含量高于直立玉米。這說明玉米發(fā)生倒伏后其營養(yǎng)價值降低，原因可能是玉米植株倒伏阻礙了水分和營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)的運輸，從而影響收獲玉米的產(chǎn)量及質(zhì)量。

添加劑可以減少全株玉米青貯過程中營養(yǎng)物質(zhì)的損耗。本試驗中，添加乳酸菌后玉米青貯NDF和ADF含量低于無添加處理，而CP含量高于無添加處理，說明添加乳酸菌可以降低粗纖維含量，提高CP含量，這與張相倫等[24]、毛翠等[25]和Li等[26]的研究結果一致。

王麗學等[27]認為全株玉米收割時的留茬高度一般為15～30 cm。留茬過低或過高均會影響玉米青貯的效果，當留茬過低收割時，塵土容易被帶入進去，引起梭菌等有害微生物大量增殖，致使青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)差，營養(yǎng)成分流失嚴重；不過，雖然較高的留茬高度能夠提升玉米的青貯品質(zhì)，但這會使可收獲生物量下降，此時種植利益就難以得到保障[28-29]。本試驗中，倒伏玉米原料在留茬30 cm時CP含量最高；青貯后在留茬30 cm時ADF含量最低，并且CP含量顯著高于留茬20 cm時，NDF含量顯著低于留茬20 cm時。這表明，隨著留茬高度的增加，CP含量提高，NDF和ADF含量則表現(xiàn)為降低趨勢，這與王麗學等[27]、王永軍等[30]、Neylon等[31]和Oba等[32]的研究結果一致。

3.3 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

有機酸的含量是反映青貯飼料品質(zhì)優(yōu)劣的另一個重要指標，其中LA、AA和BA的含量最為重要[33]。研究表明，含有大量的LA、少量AA和不含有BA是優(yōu)質(zhì)青貯飼料的共同特點[33]。本試驗中，青貯后倒伏玉米pH高于直立玉米，LA、AA含量均低于直立玉米，且添加乳酸菌后pH降低，LA、AA含量提高；而對于不同的留茬高度，各指標含量沒有明顯變化趨勢，且均未檢測出BA，這與李文才等[28]、Neylon等[31]和董起飛[34]的研究結果一致。

3.4 乳酸菌和留茬高度對倒伏與直立全株玉米青貯微生物組成的影響

在青貯過程中，主要包括的微生物有乳酸菌、好氧性細菌、酵母菌以及霉菌[22]。乳酸菌是一種重要的益生菌，當pH降到4以下時，乳酸菌開始大量繁殖，最終維持在107數(shù)量級[35]。本試驗中，青貯后倒伏玉米乳酸菌數(shù)量低于直立玉米，在留茬30 cm時乳酸菌較多，好氧性細菌和大腸桿菌等有害菌數(shù)量較少，且在添加乳酸菌后，好氧性細菌以及酵母菌數(shù)量減少，而乳酸菌數(shù)量明顯增加，這與楊云貴等[36]、陸永祥等[37]的研究結果一致。添加乳酸菌降低了青貯體系內(nèi)的pH，從而抑制有害菌的生長活動，大部分青貯飼料中乳酸菌數(shù)量都不充足，因此乳酸菌制劑就成為一種很重要的微生物菌種添加劑，添加適當?shù)膭┝磕軌蛴行岣咔噘A品質(zhì)，而且無毒、無腐蝕性，對環(huán)境不造成危害，比化學添加劑更容易被人們所接受[38-39]。

4 結 論

本試驗條件下，在倒伏玉米植株上沒有發(fā)現(xiàn)霉菌，添加乳酸菌制劑可以改善倒伏全株玉米的青貯品質(zhì)、減少營養(yǎng)成分損失；同時，倒伏全株玉米留茬高度為30 cm左右會收獲較高品質(zhì)的青貯飼料。