初乳添加劑對新生羔羊血清指標(biāo)和免疫球蛋白G吸收效率的影響

田沛知 田星哲 趙曉雅 陳佳欣 史晨迪 嚴(yán) 慧 張英杰 紀(jì)守坤 劉月琴

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，保定 071000)

新生羔羊與母體脫離后，在生理、營養(yǎng)和心理上均面臨著劇烈的轉(zhuǎn)變，也會受到環(huán)境條件和微生物等多方面挑戰(zhàn)，這些因素所形成的應(yīng)激會對新生羔羊的健康和生長性能產(chǎn)生多方面影響。初乳是新生幼畜獲得營養(yǎng)物質(zhì)的唯一來源，也是羔羊被動免疫建立的重要保障，未攝入初乳或初乳攝入不足導(dǎo)致的新生羔羊被動免疫失敗是導(dǎo)致新生羔羊患病與死亡的主要因素之一[1]。初乳中免疫球蛋白G(IgG)是免疫球蛋白的主要組成部分，羔羊?qū)gG的吸收效率是新生羔羊被動免疫建立的重要保證[2]，因此，提高IgG的吸收效率保障新生羔羊的被動免疫是降低新生羔羊患病率和死亡率的重要措施。

新生羔羊小腸對IgG的吸收主要通過FcRn受體介導(dǎo)的胞吞途徑，新生羔羊剛出生時腸道內(nèi)無微生物與病原菌定植，在腸道偏酸性環(huán)境(pH=6.0～6.5)中，分布于腸上皮的FcRn與IgG結(jié)合形成FcRn-IgG復(fù)合體，F(xiàn)cRn-IgG復(fù)合體進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)形成囊泡，進(jìn)而轉(zhuǎn)運至腸上皮細(xì)胞基底端，在基底側(cè)的中性環(huán)境(pH=7.0～7.5)中，F(xiàn)cRn與IgG解離，IgG被釋放進(jìn)入血液循環(huán)，從而完成IgG由腸腔到血液的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運[3-4]。腸道內(nèi)消化大分子的蛋白酶分泌量隨著產(chǎn)后時間的延長逐漸增加，IgG被水解，從而直接影響IgG的吸收[5]。因此，在初乳中添加抗生素、甘露寡糖、甲酸、蛋白酶抑制劑或西沙必利，可能通過降低微生物或病原菌的數(shù)量、降低腸道pH、抑制蛋白酶活性與加快胃腸道蠕動速度這4個方面來提高IgG的吸收效率。然而，初乳添加劑對新生羔羊IgG吸收效率的影響尚不明確，對新生羔羊血清指標(biāo)的影響還鮮有報道。

羔羊通常采用隨母哺乳進(jìn)行飼養(yǎng)，隨母哺乳狀態(tài)下新生羔羊IgG吸收效率的測定是難點。Yvon等[6]的研究表明，新生羔羊?qū)ε３跞楹脱虺跞橹械腎gG具有相同的吸收效率，表明羔羊腸道吸收牛源IgG和羊源IgG具有相同的吸收動力學(xué)參數(shù)。在單虎等[7]的研究中，新生仔豬在飼喂牛初乳后約8 h發(fā)現(xiàn)血液中出現(xiàn)了較高水平的牛源IgG，表明新生幼畜在吸收不同物種來源的IgG后血液中仍保留其免疫原性[8-9]，目前人們基于IgG物種特異性進(jìn)行了大量乳制品和肉制品的摻假鑒定：Ruiz-Valdepeas等[10]報道了一種用于檢測牛、綿羊和山羊的混合乳中來自牛、綿羊和山羊的IgG的方法；Myers等[11]對豬肉、雞肉和牛肉中的IgG進(jìn)行特異性檢測，用于肉類的摻假鑒定。因此，可以利用牛、羊初乳中IgG吸收動力一致性和免疫原特異性，使用牛初乳作為標(biāo)記物進(jìn)行隨母哺乳狀態(tài)下新生羔羊IgG吸收效率的測定。

本試驗通過給自然哺乳狀態(tài)下的新生羔羊定量飼喂添加不同添加劑的牛初乳，將牛初乳作為標(biāo)記物，利用牛源和羊源IgG的抗原特異性通過單向免疫擴(kuò)散來測定新生羔羊血清中牛源IgG含量，從而準(zhǔn)確計算出IgG吸收效率，研究初乳添加劑對新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響，并通過分析血清指標(biāo)間的相關(guān)性對各影響因素的作用機(jī)理進(jìn)行初步探討，為制定合理的新生羔羊飼養(yǎng)管理措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗場地及試驗動物由河北省張家口市蘭海畜牧養(yǎng)殖有限公司提供，試驗時間為2020年11—12月。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

本試驗選取初生重[(3.52±0.31)kg]相近、母羊胎次為2～3胎且當(dāng)次產(chǎn)雙羔、健康狀況良好的新生湖羊公羔羊60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為對照組、抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、乙二胺四乙酸(EDTA)組和西沙必利組。羔羊出生后及時清除羔羊口腔及鼻腔內(nèi)的黏液，使其呼吸順暢，用碘伏在臍帶處消毒，使用干毛巾將羔羊身上粘液擦拭干凈后打上耳號，做好生產(chǎn)記錄(包括產(chǎn)羔時間、母羊胎次、產(chǎn)羔數(shù)、羔羊初生重等)，在產(chǎn)后1 h內(nèi)引導(dǎo)羔羊接近乳房并輔助其采食母乳，羔羊均隨母哺乳。

牛初乳粉購自南京德居生物科技有限公司，其營養(yǎng)成分含量見表1。牛初乳粉與溫水(40 ℃)按照1∶7的比例進(jìn)行配制，攪拌均勻至充分溶解。對照組、抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組分別于牛初乳溶液中添加5 mL生理鹽水、抗生素溶液[12](8 g氨芐青霉素、8 g硫酸新霉素、4 g萬古霉素和4 g甲硝唑混合后溶于1 L生理鹽水中)、甘露寡糖溶液[13](0.5 g/kg BW)、甲酸溶液[14](將85%食品級甲酸與生理鹽水按1∶9的比例混合均勻制成)、EDTA溶液[15](0.5 g/kg BW)和西沙必利溶液[16](0.5 mg/kg BW)，配制好的牛初乳溶液中IgG含量為5.13 mg/mL，于羔羊出生后1 h使用100 mL注射器通過口腔插管飼喂羔羊[17]，飼喂量為100 mL。

表1 牛初乳粉營養(yǎng)成分含量

1.3 樣品采集

羔羊于出生后24 h時頸靜脈采血，使用5 mL促凝采血管收集血液，在室溫下靜置2 h，待血清析出后，在室溫下用離心機(jī)以3 500×g離心15 min收集血清，血清置于-20 ℃保存。

1.4 測定指標(biāo)與方法

血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)和葡萄糖(GLU)含量采用全自動生化分析儀測定；血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、二胺氧化酶(DAO)活性，總抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)、內(nèi)毒素(LPS)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定；血清中牛源和羊源IgG含量采用單向免疫擴(kuò)散法[18]測定。

參考McGovern等[19]的方法進(jìn)行IgG吸收效率的計算：

IgG吸收效率(%)=[血清牛源IgG含量(g/L)×

羔羊體重(kg)×7.5%]/[牛初乳IgG含量(g/L)×

牛初乳哺乳量(L)]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行初步整理，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著；利用R軟件(3.6.3)的GGally程序包進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05表示相關(guān)性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初乳添加劑對新生羔羊血清TP、ALB、GLB和GLU含量的影響

由表2可知，抗生素組和甘露寡糖組羔羊血清GLU含量均顯著高于對照組和甲酸組(P<0.05)；各組間羔羊血清TP、ALB和GLB含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同初乳添加劑對新生羔羊血清TP、ALB、GLB和GLU含量的影響

2.2 不同初乳添加劑對新生羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組羔羊血清MDA含量均顯著高于對照組(P<0.05)，而SOD與GSH-Px活性、T-AOC均顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 不同初乳添加劑對新生羔羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 不同初乳添加劑對新生羔羊血清炎癥細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知，抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組羔羊血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著高于對照組(P<0.05)。

表4 不同初乳添加劑對新生羔羊血清炎癥細(xì)胞因子含量的影響

2.4 不同初乳添加劑對新生羔羊血清LPS含量和DAO活性的影響

由表5可知，抗生素組、甘露寡糖組、甲酸組、EDTA組和西沙必利組羔羊血清LPS含量和DAO活性均顯著高于對照組(P<0.05)。

表5 不同初乳添加劑對新生羔羊血清LPS含量和DAO活性的影響

2.5 不同初乳添加劑對新生羔羊血清免疫指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

由表6可知，甲酸組、甘露寡糖組、西沙必利組羔羊血清牛源IgG含量和IgG吸收效率均顯著低于對照組(P<0.05)，抗生素組、EDTA組羔羊血清牛源IgG含量和IgG吸收效率與對照組差異不顯著(P>0.05)；血清羊源IgG、IgM和IgA含量在各組間差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同初乳添加劑對新生羔羊血清免疫指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

2.6 羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的相關(guān)性

由圖1可知，新生羔羊的IgG吸收效率與血清SOD活性、T-AOC和IgA含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與血清MDA、IL-1β和IL-6含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；腸道通透性指標(biāo)(LPS含量和DAO活性)與血清抗氧化指標(biāo)(SOD、GSH-Px活性及T-AOC)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與血清MDA和炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6)含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；血清炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6)含量與血清抗氧化指標(biāo)(SOD、GSH-Px活性及T-AOC)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與血清MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

BW：初生重 birth weight；TP：總蛋白 total protein；ALB：白蛋白 albumin；GLB：球蛋白 globulin；GLU：葡萄糖 glucose；SOD：超氧化物歧化酶 superoxide dismutase；T-AOC：總抗氧化能力 total antioxidant capacity；MDA：丙二醛 malondialdehyde；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶 glutathione peroxidase；LPS：內(nèi)毒素 lipopolysaccharide；DAO：二胺氧化酶 diamine oxidase；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；IFN-γ：γ-干擾素 interferon-γ；IL-6：白細(xì)胞介素-6 interleukin-6；IgG：免疫球蛋白G immunoglobulin G；IgM：免疫球蛋白M immunoglobulin M；IgA：免疫球蛋白A immunoglobulin A；AEA：IgG吸收效率 IgG absorption efficiency；Corr：相關(guān)系數(shù) correlation coefficient。

3 討 論

3.1 初乳中添加抗生素對新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

羔羊出生前腸道內(nèi)無微生物，羔羊在出生后有大量微生物在腸道黏膜表面迅速定植，而初乳中的微生物是腸道微生物的主要來源[20]。Gelsinger等[20]通過對犢牛進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，初乳中微生物的含量可顯著影響IgG吸收效率，飼喂低微生物含量初乳的犢牛IgG吸收效率顯著高于飼喂高微生物含量初乳的犢牛。這說明可以通過在初乳中添加抗生素來減少微生物含量，從而提高IgG吸收效率。在本研究中，抗生素組新生羔羊的IgG吸收效率雖然高于對照組，但是差異不顯著，并且血清中DAO活性以及LPS、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著高于對照組。血清LPS含量和DAO活性可以反映新生羔羊的腸道通透性和腸道黏膜屏障的損傷程度，而血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6含量則可反映新生羔羊的炎癥反應(yīng)程度[21]，由此推測可能是由于抗生素在殺滅致病菌的同時導(dǎo)致革蘭氏陰性菌裂解死亡釋放出LPS，LPS的大量產(chǎn)生使腸道屏障受損并進(jìn)入血液，引起炎癥反應(yīng)[21]，提示通過在初乳中添加抗生素來提高IgG吸收效率的作用效果有限。

3.2 初乳中添加甘露寡糖對新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

甘露寡糖是一種腸道活性低聚糖，已被證實能夠在吸附病原體的同時通過競爭受體位點來阻止病原體的附著，從而降低其在腸道的定植能力[22]。在單胃動物的研究中，平偉強(qiáng)等[23]和武威等[24]的研究均表明在飼糧中添加甘露寡糖可顯著提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力，改善腸道健康；金亞東等[25]在對成年反芻動物的研究中得到了相同的結(jié)論。但前人對于新生反芻動物的研究結(jié)果具有較大差異：Lazarevic等[26]研究表明，在牛初乳中添加甘露寡糖可以提高犢牛對初乳中免疫球蛋白的吸收，提高犢牛血清中IgG含量，而Villettaz等[27]和Brady等[28]的研究則均表明在代乳品中添加甘露寡糖不能提高IgG的吸收效率。本研究結(jié)果顯示甘露寡糖組新生羔羊IgG吸收效率顯著低于對照組，同時血清中LPS、MDA和炎癥細(xì)胞因子含量均顯著提高，而血清中SOD、GSH-Px活性及T-AOC顯著降低。血清MDA含量可反映由氧自由基引起的機(jī)體氧化損傷程度，而SOD、GSH-Px等抗氧化酶能夠清除機(jī)體產(chǎn)生的活性氧自由基，是衡量新生羔羊抗氧化能力的重要指標(biāo)[21]。上述結(jié)果說明在初乳中添加甘露寡糖對新生羔羊的免疫力和抗氧化能力均產(chǎn)生了不利的影響，其機(jī)制尚不明確。

3.3 初乳中添加甲酸對新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

甲酸作為一種酸化劑被廣泛的應(yīng)用于仔豬與犢牛的飼養(yǎng)中，在調(diào)節(jié)乳pH的同時還能夠有效殺滅部分病原菌[29-30]。殷術(shù)鑫等[30]研究中以甲酸作為酸化劑制備的酸化乳并飼喂?fàn)倥?，發(fā)現(xiàn)飼喂酸化乳犢牛在第60天時血清中IgG和IgM含量均顯著提高，而血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著降低，說明初乳中添加甲酸能夠提高犢牛的免疫力，降低炎癥反應(yīng)。本試驗中甲酸組羔羊血清中SOD、GSH-Px活性及T-AOC顯著低于對照組，血清炎癥細(xì)胞因子含量和腸道通透性顯著高于對照組，血清免疫指標(biāo)與對照組無顯著差異，而血清中牛源IgG含量為0 mg/mL，表明在牛初乳中添加甲酸后新生羔羊?qū)o法吸收初乳中的牛源IgG，原因可能是本研究中的酸化乳pH過低，引起IgG分子空間構(gòu)象發(fā)生改變，造成IgG變性失活[31]，從而導(dǎo)致新生羔羊無法吸收酸化乳中的IgG。

3.4 初乳中添加EDTA對新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

隨著新生羔羊胃腸道的發(fā)育，胃腸道內(nèi)的蛋白酶開始大量分泌，導(dǎo)致IgG被水解，IgG的吸收效率降低[32]。Koleckar等[15]研究表明，EDTA在蛋白酶水解肌紅蛋白的過程中表現(xiàn)出明顯的抑制效果，但目前還沒有將EDTA作為蛋白酶抑制劑來提高IgG吸收效率的報道。本研究結(jié)果顯示，EDTA組羔羊血清中SOD、GSH-Px活性及T-AOC顯著低于對照組，血清炎癥細(xì)胞因子含量與腸道通透性均顯著高于對照組，血清免疫指標(biāo)與對照組無顯著差異，這可能是由于EDTA具有金屬螯合作用，主要抑制金屬蛋白水解酶，對胰蛋白酶和糜蛋白酶的抑制能力較弱[15]，并且EDTA具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在體內(nèi)難以被降解，游離態(tài)的EDTA及其金屬螯合物能夠破壞革蘭氏陰性菌的外膜釋放出LPS，導(dǎo)致腸道屏障受損，引發(fā)炎癥反應(yīng)[33]。

3.5 初乳中添加西沙必利對新生羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的影響

Mokhber-Dezfooli等[34]在皺胃排空速率對犢牛初乳IgG吸收效率的研究中發(fā)現(xiàn)，皺胃的排空速率可以影響初乳中IgG運送到小腸吸收部位的速度。由于皺胃排空速率的增加，使初乳IgG到達(dá)小腸吸收部位的時間縮短，從而使腸腔內(nèi)IgG含量升高，最終提高IgG的吸收效率。Dowling[16]報道了西沙必利能增加貓、犬和馬的胃腸道運動速率，加快腸胃蠕動，但目前還沒有關(guān)于通過促進(jìn)新生羔羊腸胃蠕動來提升IgG吸收效率的報道。本研究結(jié)果顯示，西沙必利組羔羊血清中炎癥細(xì)胞因子含量和腸道通透性均顯著高于對照組，抗氧化能力和牛源IgG含量均顯著低于對照組，原因可能是西沙必利的藥理作用時間開始于服用后30 min[16]，而本試驗中將西沙必利與初乳混合均勻后進(jìn)行飼喂，導(dǎo)致新生羔羊進(jìn)食初乳時藥物還未發(fā)揮作用，并且西沙必利可以導(dǎo)致一定程度肝損傷[35]，引起炎癥反應(yīng)。

3.6 羔羊血清指標(biāo)和IgG吸收效率的相關(guān)性

前人研究表明，血清抗氧化能力與炎癥細(xì)胞因子含量呈顯著負(fù)相關(guān)[36]；炎癥細(xì)胞因子含量與腸道通透性呈顯著正相關(guān)[20]；血清免疫指標(biāo)與抗氧化能力呈顯著正相關(guān)[36]，與本研究結(jié)果一致，本研究同時發(fā)現(xiàn)新生羔羊IgG吸收效率與血清SOD活性、T-AOC和IgA含量呈顯著正相關(guān)，與血清MDA、IL-1β和IL-6含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明提高新生羔羊血清抗氧化能力、降低細(xì)胞炎癥因子含量可能有利于提高IgG吸收效率。

4 結(jié) 論

初乳中添加抗生素、甘露寡糖、甲酸、EDTA和西沙必利均無法提高新生羔羊的IgG吸收效率。新生羔羊IgG吸收效率與血清抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，與血清炎癥細(xì)胞因子含量呈顯著負(fù)相關(guān)，提示提高新生羔羊血清抗氧化能力、降低炎癥細(xì)胞因子含量可能是提高其IgG吸收效率的有效措施。