飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清免疫和抗氧化指標(biāo)以及肌肉成分的影響

王海波 占今舜 霍俊宏* 鐘小軍 劉宇航 趙生國(guó)

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌 330200；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

黃酮類(lèi)化合物是植物光合細(xì)胞中普遍存在的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、具有多種生物活性的植物提取物或次生代謝產(chǎn)物。作為天然、綠色的抗氧化劑，黃酮類(lèi)化合物能提高機(jī)體免疫和抗氧化能力，同時(shí)還具有抗菌、抗病毒、抗炎和改善動(dòng)物生長(zhǎng)的功能[1-3]。黃酮類(lèi)化合物可直接作用于瘤胃中的產(chǎn)甲烷細(xì)菌，抑制甲烷的產(chǎn)生，提高反芻動(dòng)物能量利用率[4]；還能通過(guò)影響DNA和RNA的合成抑制微生物繁殖[5]；通過(guò)調(diào)節(jié)體液免疫、細(xì)胞免疫及免疫相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路增強(qiáng)肉雞的免疫能力[6]；清除脂質(zhì)過(guò)氧化物，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，消除自由基，抑制自由基生成酶的合成[2]，提高奶牛血清抗氧化酶活，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[7]。因此，黃酮類(lèi)、酚類(lèi)和生物堿等次生代謝物因具有獨(dú)特的藥理作用和營(yíng)養(yǎng)保健功效，在開(kāi)發(fā)新型動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)添加劑方面受到研究者的廣泛關(guān)注。

蘆丁(蕓香苷、維生素P)是植物中含量最為豐富的類(lèi)黃酮化合物，廣泛存在于植物根、莖葉、花、果實(shí)和種子中，不僅有鎮(zhèn)痛、抗炎作用[8-9]，還能夠作為保健品，保護(hù)神經(jīng)、腎臟和肝臟，提高機(jī)體的抗氧化能力[10]和免疫能力[8]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁能顯著提高肉雞的體增重[11]；促進(jìn)瘤胃代謝和消化能力，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能[12]；提高小鼠心臟抗氧化能力[13]，并清除腸道多余的活性氧，保護(hù)腸道免受損傷，改善斷奶仔鼠腸絨毛形態(tài)[14-15]，促進(jìn)胸腺和脾臟等免疫器官的發(fā)育[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁可以改善蛋雞產(chǎn)蛋后期的蛋品質(zhì)(蛋殼厚度)以及加工品質(zhì)(蛋清凝膠的回復(fù)性、硬度、膠性和蛋清的起泡性)[17]；并能夠改善奶牛體內(nèi)氨基酸的合成與蛋白質(zhì)代謝[18]。機(jī)體的蛋白質(zhì)容易發(fā)生氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能特性降低，從而降低肉的嫩度、風(fēng)味、保水保油性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，適量的蘆丁對(duì)抑制豬肉脂肪和蛋白質(zhì)氧化以及改善其品質(zhì)特性具有較好的作用[19-20]。本課題組前期研究飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、激素水平及瘤胃發(fā)酵的結(jié)果表明，飼糧添加蘆丁能夠調(diào)控湖羊體內(nèi)激素分泌，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵[21]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究蘆丁經(jīng)過(guò)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)或微生物代謝轉(zhuǎn)化后對(duì)湖羊血清免疫球蛋白含量、抗氧化能力和肌肉脂肪酸組成的影響，以期為蘆丁在湖羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用蘆丁為寧波某醫(yī)藥有限公司提供，提取自槐米，純度≥95%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇3月齡左右、健康且體重(約17.31 kg)相近的湖羊36只，隨機(jī)分為3個(gè)組，每組12只(公母各占1/2，公母分欄飼養(yǎng))。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加50和100 mg/kg BW蘆丁的飼糧。試驗(yàn)預(yù)試期14 d，正試期56 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2019年8—10月在江西省贛州市綠林灣農(nóng)牧有限公司湖羊養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場(chǎng)的規(guī)定執(zhí)行，每天飼喂2次，分別在08：30和17：30定時(shí)飼喂(足量飼糧)，羊只自由采食和飲水，隔天早上稱(chēng)取余料。

1.4 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧參考我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)配制，其中飼糧精粗比為60∶40，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。粗料為鍘碎的紫象草(干物質(zhì)中含10.98%的粗蛋白質(zhì)、2.90%的粗脂肪、14.07%的粗灰分、61.23%的中性洗滌纖維和34.67%的酸性洗滌纖維)。將蘆丁與精料拌勻后先飼喂，然后再喂鍘碎的鮮草。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

試驗(yàn)結(jié)束后，每組選擇接近平均體重(對(duì)照組、50 mg/kg蘆丁組和100 mg/kg蘆丁組的平均體重分別為29.63、30.80和29.93 kg)的湖羊(公羊)空腹(禁食12 h、禁水2 h)采血；然后每組選取4只湖羊快速屠宰，采集背最長(zhǎng)肌測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.5.1 血清免疫和抗氧化指標(biāo)

正試期第14、35和56天08：00，每組選取6只湖羊進(jìn)行空腹頸靜脈采血5 mL，靜置2 h，3 500 r/min離心10 min收集血清，-20 ℃保存直至分析，并送于北京華英生物技術(shù)研究所測(cè)定血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、丙二醛(MDA)含量以及過(guò)氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性。

1.5.2 肌肉氨基酸含量

取1.0 g肌肉于水解管中，加入20 mL HCl(濃鹽酸和純水以1∶1體積比混合)，并將封口(氮?dú)?的水解管放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中110 ℃水解23 h后冷卻，移入25 mL比色管定容。取1 mL清液，85 ℃水浴吹干后加1 mL水，吹干后加入10 mL 0.02 mol/L HCl搖勻，取500 μL樣品加入250 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈衍生1 h后加入2 ml正已烷，振蕩，靜置，分層。取下層液經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過(guò)膜，采用Agilent 1260液相色譜儀測(cè)定肌肉中氨基酸含量。

1.5.3 肌肉脂肪酸含量

將肌肉樣品置于研缽中，加入液氮研磨后稱(chēng)取1.0 g，加入100 mg焦性沒(méi)食子酸和幾粒沸石后與95%乙醇(2 mL)混勻后加入鹽酸(10 mL)混勻，75 ℃水浴40 min，冷卻至室溫。再與95%乙醇(10 mL)混勻后轉(zhuǎn)至分液漏斗，用50 mL乙醚石油醚混合液沖洗并轉(zhuǎn)入分液漏斗，加蓋振搖5 min靜置10 min。隨后，將醚層提取液收集到250 mL燒瓶中(反復(fù)重復(fù)沖洗3次)，最后用乙醚石油醚混合液沖洗漏斗，收集到已恒重的燒瓶中水浴蒸干，103 ℃烘箱中干燥2 h。然后，加入2%氫氧化鈉甲醇溶液2 mL，85 ℃水浴30 min后加入14%三氟化硼甲醇溶液3 mL，85 ℃水浴30 min后降到室溫。取上層清液100 μL，用正已烷定容到1 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)膜后采用Agilent 7890A氣相色譜儀測(cè)定肌肉中脂肪酸含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步整理后，采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用LSD法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清免疫指標(biāo)的影響

飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清免疫指標(biāo)的影響見(jiàn)表2。由表可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊試驗(yàn)第14、35和56天血清中IgA、IgG和IgM含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清免疫指標(biāo)的影響

2.2 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清抗氧化指標(biāo)的影響見(jiàn)表3。由表可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊試驗(yàn)第14、35和56天血清中CAT、T-SOD活性以及MDA含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)，但飼糧添加100 mg/kg BW蘆丁顯著影響第14、35和56天血清中GSH-Px活性(P<0.05)。與對(duì)照組相比，100 mg/kg蘆丁組試驗(yàn)第14天血清中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，50 mg/kg蘆丁組試驗(yàn)第35天血清中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，100 mg/kg蘆丁組試驗(yàn)第56天血清中GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01)。

表3 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌肉品質(zhì)的影響

2.3.1 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌基本營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌基本營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響見(jiàn)表4。由表可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌中水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量均無(wú)顯著影響(P>0.05).

表4 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌基本營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

2.3.2 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌氨基酸含量的影響

飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌氨基酸含量的影響見(jiàn)表5。由表可知，湖羊背最長(zhǎng)肌中測(cè)出7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸。與對(duì)照組相比，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌中總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和鮮味氨基酸含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)；其中，背最長(zhǎng)肌中苦味、甜味和鮮味氨基酸分別占氨基酸總量達(dá)到40.94%、32.96%和26.11%以上。此外，與對(duì)照組相比，100 mg/kg蘆丁組背最長(zhǎng)肌中總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和鮮味氨基酸的含量均較高，而50 mg/kg蘆丁組對(duì)應(yīng)氨基酸的含量相對(duì)較低，但差異均不顯著(P>0.05)。

表5 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌氨基酸含量的影響

2.3.3 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌脂肪酸含量的影響

飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌脂肪酸含量的影響見(jiàn)表6。由表可知，與對(duì)照組相比，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌中測(cè)定的14種脂肪酸含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)，且含量較高的脂肪酸為油酸和棕櫚酸。此外，與對(duì)照組相比，100 mg/kg蘆丁組背最長(zhǎng)肌中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的含量均較高，而50 mg/kg蘆丁組脂肪酸含量相對(duì)較低，但差異均不顯著(P>0.05)。

表6 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌脂肪酸含量的影響

3 討 論

3.1 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

黃酮類(lèi)化合物作為植物體的組分，廣泛存在于自然界中。通過(guò)對(duì)人體和動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗菌等方面發(fā)揮著重要功能。血清中免疫球蛋白的功能隨免疫球蛋白含量的升高而增強(qiáng)[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠通過(guò)刺激體液免疫和細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫[9]，且飼糧中添加黃酮化合物能夠提高幼猴(IgA、IgG和IgM[24])、揚(yáng)州鵝(IgG[25])和仔豬(IgM和IgG[26])血清中免疫球蛋白的含量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊血清中免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)的含量無(wú)顯著影響。這可能是由于蘆丁與黃酮類(lèi)化合物并非同一物質(zhì)，且試驗(yàn)動(dòng)物及階段、劑量等因素也不盡相同的原因所致。

正常生理狀況下，機(jī)體主要依靠酶系和非酶系內(nèi)源性自由基清除劑及外源添加劑來(lái)抵消或清除體內(nèi)自由基，以維持機(jī)體自由基動(dòng)態(tài)平衡，其中常見(jiàn)的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px和CAT[27]；而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，MDA含量降低則表明脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)機(jī)體造成的損傷降低[28]。黃酮類(lèi)物質(zhì)可通過(guò)消除自由基或直接捕獲反應(yīng)鏈中的自由基[29]，抑制與自由基生成有關(guān)的酶等途徑提高機(jī)體抗氧化能力[30-31]。Yuan等[32]在仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)，杜仲黃酮能夠提高血清SOD、GSH-Px和CAT活性，將超氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮能提高培養(yǎng)液中GSH-Px活性，降低MDA含量，抑制細(xì)胞凋亡，提高上皮細(xì)胞抗氧化能力[33]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁能夠顯著提高湖羊血清GSH-Px活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，降低動(dòng)物的氧化應(yīng)激，預(yù)防因動(dòng)物機(jī)體氧化導(dǎo)致的疾病發(fā)生[31]，降低機(jī)體感染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)；而飼糧添加蘆丁對(duì)其他抗氧化指標(biāo)(CAT、T-SOD活性以及MDA含量)無(wú)顯著影響，可能與蘆丁調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)通路過(guò)程中主要調(diào)控了GSH-Px等相關(guān)酶基因的表達(dá)[34]或者與蘆丁的添加量、動(dòng)物的種類(lèi)以及年齡有關(guān)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌肉品質(zhì)的影響

水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量直接影響肉品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味，且水分含量和保水性呈負(fù)相關(guān)[35]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁不會(huì)影響湖羊背最長(zhǎng)肌基本營(yíng)養(yǎng)成分(水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪)含量的變化，這與前期陳仁偉[36]研究發(fā)現(xiàn)的沙蔥黃酮對(duì)肉羊背最長(zhǎng)肌中基本營(yíng)養(yǎng)成分含量影響的結(jié)果一致。前期的研究結(jié)果表明，蘆丁有利于改善動(dòng)物對(duì)飼糧中氨基酸的利用，提高奶牛體內(nèi)氨基酸合成與蛋白質(zhì)代謝[37]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌中氨基酸的含量無(wú)顯著影響，且含量最高的是苦味氨基酸，這與王圓圓等[35]的研究結(jié)果相似；同時(shí)，背最長(zhǎng)肌中必需氨基酸/非必需氨基酸值達(dá)到0.64以上，且必需氨基酸/總氨基酸值達(dá)到0.39，滿(mǎn)足聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)理想蛋白質(zhì)模式要求(必需氨基酸/非必需氨基酸值達(dá)到0.60以上，且必需氨基酸/總氨基酸值達(dá)到0.40以上[38])。研究表明，苦味氨基酸參與降壓和機(jī)體蛋白質(zhì)代謝，并能預(yù)防脂肪肝、糖尿病和肥胖等疾病的發(fā)生[39]，且豐富的苦味氨基酸利于機(jī)體健康[35]。脂肪酸含量是衡量羊肉風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值的重要指標(biāo)，改善反芻動(dòng)物肌肉脂肪酸的含量和組成是調(diào)控羊肉風(fēng)味的重要手段，脂肪酸受諸多因素(營(yíng)養(yǎng)、基因、品種、性別和年齡等)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中營(yíng)養(yǎng)組分能調(diào)控機(jī)體脂肪的代謝、沉積和抗氧化功能[40]，添加黃酮類(lèi)化合物能提高血清抗氧化酶活性，分解產(chǎn)生肌苷酸，防止風(fēng)味物質(zhì)的流失[41]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌已測(cè)定出的14種脂肪酸含量均無(wú)顯著影響。這可能是由于蘆丁與黃酮類(lèi)化合物并非同一物質(zhì)，并與試驗(yàn)動(dòng)物、階段和使用劑量等因素不同，造成本試驗(yàn)中飼糧添加蘆丁對(duì)背最長(zhǎng)肌中脂肪酸和氨基酸的含量無(wú)顯著影響。研究表明，月桂酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸等飽和脂肪酸能夠引起血液中膽固醇和低密度脂蛋白含量升高，過(guò)量的低密度脂蛋白會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚，致血管堵塞[42-43]，增加心血管疾病(特別是冠狀動(dòng)脈硬化)的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌中飽和脂肪酸含量無(wú)顯著影響，說(shuō)明飼糧添加蘆丁不會(huì)改變肌肉中飽和脂肪酸含量，不會(huì)造成健康問(wèn)題。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加蘆丁對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌中脂肪酸、氨基酸及血清中免疫球蛋白的含量均無(wú)顯著影響，但能提高血清抗氧化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。