復合益生菌制劑和菊粉對育肥牛生長性能、養(yǎng)分消化、瘤胃發(fā)酵和血液代謝的影響

劉永青 劉 辰 馮澤偉 張 凱 劉 強*

(1.呂梁學院生命科學系，離石 033001；2.山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801)

飼糧中添加復合益生菌制劑(complex probiotic preparation，CPP)和菊粉(inulin，IN)能提高育肥肉牛生長性能、抗氧化性能和免疫功能，推動養(yǎng)殖業(yè)的安全快速發(fā)展[1-2]。反芻動物中應用較多的益生菌有酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌等。Malik等[3]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加CPP(釀酒酵母∶嗜酸乳桿菌=1∶3)提高了13月齡雄性水牛平均日增重(ADG)和飼料效率；彭濤等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.4%的CPP(植物乳桿菌和酵母菌)提高了舍飼山羊血清免疫球蛋白含量，改善了機體抗氧化性能，并有提高ADG的趨勢；高堂亮[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5×1010CFU/d微生態(tài)制劑(枯草芽孢桿菌∶地衣芽孢桿菌∶植物乳酸菌=2∶2∶1)提高了肉牛生長性能和干物質(zhì)(DM)表觀消化率，降低了后腸大腸桿菌數(shù)量。目前，IN在雞、豬和大鼠上的研究主要集中于腸道[6-9]，在反芻動物上的研究主要針對幼齡動物。rne等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加6 g/d的IN提高了23日齡犢牛ADG，并改善了胃腸道和形態(tài)學指標；Samanta等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加IN提高了腸道雙歧桿菌數(shù)量，抑制了大腸桿菌繁殖，促進了養(yǎng)分消化吸收，提高了犢牛ADG。由于犢牛瘤胃尚未發(fā)育完全，IN在反芻動物上的研究僅局限于高精料飼糧背景下IN對育肥牛瘤胃酸中毒調(diào)節(jié)的探索[12]。

鑒于CPP和IN在提高動物生長性能和調(diào)節(jié)瘤胃環(huán)境等方面的共同點，當前高精料飼糧背景下如何激發(fā)飼喂CPP育肥牛的生長性能具有重要的意義。因此，本試驗以西門塔爾雜交肉牛為研究對象，探討飼糧中添加CPP和IN對育肥期肉牛生長性能、養(yǎng)分消化、瘤胃發(fā)酵和血液代謝的影響，以期為CPP和IN的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

CPP購自江蘇某生物技術(shù)有限公司，活菌數(shù)為1.5×1010CFU/g，其中，酵母菌∶枯草芽孢桿菌∶乳酸桿菌=2∶2∶1。IN購自重慶某股份有限公司，純度為90%。

1.2 試驗設計

采用2×2雙因子完全隨機設計，主因子分別為CPP(飼糧中不添加或添加20 g/d的CPP)和IN(飼糧中不添加或添加2%的IN)，CPP和IN添加量分別參照湯志宏等[13]和田可[12]。選取約1周歲、體重(403±12)kg、體況良好、體型一致的西門塔爾雜交肉牛20頭，隨機分為4組，每組5頭牛。各組分別飼喂基礎(chǔ)飼糧、基礎(chǔ)飼糧+CPP、基礎(chǔ)飼糧+IN以及基礎(chǔ)飼糧+CPP+IN?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2016)[14]配制，精粗比為62∶38，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗前分別將CPP和IN混入飼糧中，保證全部食用。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗于2021年4—6月在山西省方山縣宏康牧業(yè)有限責任公司養(yǎng)殖場進行，預試期10 d，正試期60 d。試驗牛均為單欄舍飼，自然通風，統(tǒng)一管理，飼養(yǎng)開始前對所有試驗牛進行驅(qū)蟲和耳號標記。每天07：00和17：00各飼喂1次，自由飲水，定期清理牛舍，保持衛(wèi)生清潔。喂食采用精粗混合的方式，保證一定的剩料量。

1.4 樣品采集與指標檢測

1.4.1 生長性能

正試期每天記錄采食量，晨飼前準確稱量試驗牛的飼糧飼喂量和前1天的剩料量，計算干物質(zhì)采食量(DMI)。于試驗開始和結(jié)束時分別連續(xù)2 d記錄試驗?？崭贵w重，計算ADG和料重比(F/G)。DMI、ADG和F/G計算公式如下：

DMI=DM飼喂量-DM剩料量；

ADG=(末重-始重)/試驗天數(shù)；

F/G=DMI/ADG。

1.4.2 養(yǎng)分表觀消化率

正試期開始每隔5 d采集1次飼糧樣品，通過直腸取樣法收集新鮮糞樣后加入糞重1/4的10%酒石酸。將收集到的飼糧樣品和糞樣65 ℃烘干，回潮24 h，粉碎，制備成分析試樣，測定常規(guī)營養(yǎng)成分含量。DM含量采用直接烘干法測定；粗灰分(CA)和酸不溶灰分(AIA)含量采用灼燒法測定[15]；粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用凱氏定氮法測定；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量采用Van Soest等[16]纖維素分析法測定；粗脂肪(EE)含量采用乙醚浸提法測定。通過內(nèi)源性指示劑法計算養(yǎng)分表觀消化率，計算公式如下：

某養(yǎng)分表觀消化率(%)=100-[100×(飼糧中

AIA含量/糞中AIA含量)×(糞中該養(yǎng)分含量/

飼糧中該養(yǎng)分含量)]。

1.4.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

利用瘤胃管經(jīng)口腔抽取瘤胃液，使用UB-7型酸度計現(xiàn)場測定pH。4層無菌棉紗布過濾，分裝于10 mL離心管，-20 ℃保存待測。采用比色法測定瘤胃氨態(tài)氮(NH3-N)濃度。采用氣相色譜法測定瘤胃揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度，以巴豆酸作為內(nèi)標物，色譜柱類型為SH-Rtx-WAX(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，火焰氫離子檢測器、氣化室溫度分別為220和200 ℃，柱溫140 ℃，上樣量1 μL。

1.4.4 瘤胃菌群

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取瘤胃微生物總DNA[17]，用核酸蛋白測定儀檢測DNA的質(zhì)量和數(shù)量。通過10倍連續(xù)稀釋建立目標微生物的標準曲線[18]，實時定量PCR檢測瘤胃微生物菌群數(shù)量。瘤胃微生物及實時定量PCR引物序列如表2所示。總反應體系為20 μL，包括10 μL SYBR Green Premix Ex TaqTMⅡ，2 μL模板DNA，上、下游引物各0.8 μL(10 μmol/L)，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，6.0 μL超純水。兩步法PCR反應程序：95 ℃預變性60 s，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，通過PCR產(chǎn)物解離曲線檢測擴增特異性。

表2 瘤胃微生物及實時定量PCR引物序列

1.4.5 血清生化和抗氧化指標

通過全自動生化檢測儀測定血清葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)和尿素氮(UN)含量，采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定血清總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.5 統(tǒng)計分析

應用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行一般線性模型下多因素交互方差分析，分析模型如下：

Ycik=μ+Jc+Mi+(JM)ci+Xcik。

式中：μ為群體均數(shù)；Jc為CPP因素的效應；Mi為IN因素的效應；(JM)ci為CPP因素與IN因素的互作效應；Xcik為隨機誤差。不同時間采集的樣品按重復測量處理，各組間平均值的多重比較采用Duncan氏法。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 CPP和IN對育肥牛生長性能的影響

如表3所示，CPP和IN互作顯著提高了育肥牛ADG(P<0.05)，對DMI和F/G無顯著影響(P>0.05)。飼糧中添加CPP或IN顯著提高了育肥牛末重和ADG(P<0.05)，顯著降低了F/G(P<0.05)，對DMI無顯著影響(P>0.05)。

表3 CPP和IN對育肥牛生長性能的影響

2.2 CPP和IN對育肥牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

如表4所示，CPP和IN互作有提高育肥牛CP表觀消化率的趨勢(P=0.063)。飼糧中添加CPP顯著提高了育肥牛DM、NDF和CP表觀消化率(P<0.05)，有提高ADF表觀消化率的趨勢(P=0.077)，對EE和NFC表觀消化率無顯著影響(P>0.05)。飼糧中添加IN顯著提高了育肥牛CP表觀消化率(P<0.05)，對DM、EE、NDF、ADF和NFC表觀消化率無顯著影響(P>0.05)。

表4 CPP和IN對育肥牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

2.3 CPP和IN對育肥牛瘤胃發(fā)酵發(fā)酵參數(shù)和菌群的影響

如表5和表6所示，CPP和IN互作有提高瘤胃溶纖維丁酸弧菌數(shù)量的趨勢(P=0.069)。飼糧中添加CPP顯著提高了瘤胃丙酸和NH3-N濃度(P<0.05)，顯著提高了瘤胃白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量(P<0.05)，顯著降低了瘤胃原蟲數(shù)量(P<0.05)。飼糧中添加IN顯著降低了瘤胃pH(P<0.05)，顯著提高了瘤胃丙酸濃度及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌數(shù)量(P<0.05)，有提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、異丁酸濃度和降低棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量的趨勢(P=0.083、P=0.096和P=0.058)。

表5 CPP和IN對育肥牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

表6 CPP和IN對育肥牛瘤胃菌群的影響

2.4 CPP和IN對育肥牛血清生化和抗氧化指標的影響

如表7所示，CPP和IN互作有提高血清TP含量的趨勢(P=0.089)。飼糧中添加CPP顯著提高了血清GLU、TP含量和T-AOC(P<0.05)，顯著降低了血清UN和MDA含量(P<0.05)。飼糧中添加IN顯著提高了血清GLU和TP含量(P<0.05)，顯著降低了血清UN含量(P<0.05)，有提高血清T-AOC的趨勢(P=0.076)。

表7 CPP和IN對育肥牛血清生化和抗氧化指標的影響

3 討 論

3.1 CPP和IN對育肥牛生長性能的影響

本研究中，飼糧中添加CPP對肉牛DMI沒有顯著影響，與Li等[19]、Geng等[20]研究結(jié)果一致。ADG是反映肉牛生長性能最重要的指標之一，提高ADG可以縮短育成時間，降低F/G，節(jié)約飼養(yǎng)成本。酵母菌及其發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的氨基酸、維生素和有機酸等養(yǎng)分，可促進胃腸有益菌生長和微生物蛋白合成[21]?？莶菅挎邨U菌可迅速消耗腸道中的游離氧，促進乳酸桿菌等有益菌的生長[22]。乳酸桿菌可為胃腸微生物提供防御屏障，阻止過路菌等病原微生物附著胃腸壁，調(diào)節(jié)微生物區(qū)系平衡，提高飼料利用率[23]。本試驗中，飼糧中添加20 g/d的CPP顯著提高了育肥牛末重和ADG，顯著降低了F/G，與鄭瑋才等[24]、張娟利等[25]研究結(jié)果一致。

IN能改善胃腸道微生態(tài)壞境，提高養(yǎng)分消化利用率，從而提高動物生長性能，降低F/G。本試驗中，飼糧中添加IN對育肥牛DMI無顯著影響，但顯著提高了ADG，顯著降低了F/G。田可[12]研究表明，飼糧中添加2%的IN顯著提高了肉牛末重和ADG，顯著降低了F/G，與本研究結(jié)果一致。本試驗飼糧精粗比較高，IN調(diào)節(jié)微生物區(qū)系效果明顯，在穩(wěn)定瘤胃發(fā)酵環(huán)境的同時抑制有害菌黏附胃腸道壁，為有益菌繁殖提供底物，促進飼料營養(yǎng)消化吸收，從而提高生長性能。

CPP和IN都有調(diào)節(jié)胃腸微生物區(qū)系平衡和提高養(yǎng)分消化利用的效果，同時IN可刺激CPP的微生物區(qū)系調(diào)控功能，增強有益微生物的促生長作用[26-27]。本試驗中，CPP和IN互作顯著提高了育肥牛ADG，可能與高精料飼糧下蛋白質(zhì)利用效率增加有關(guān)。

3.2 CPP和IN對育肥牛養(yǎng)分表觀消化率的影響

益生菌及其分泌的多種消化酶可將不易消化的大分子物質(zhì)降解為易消化的小分子物質(zhì)，提高飼料消化利用率；益生菌代謝物中包含的維生素、氨基酸及短鏈脂肪酸等物質(zhì)促進飼料在體內(nèi)的消化吸收；乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌等有益菌可以為機體提供多種利于其生長發(fā)育的物質(zhì)，產(chǎn)生有機酸并增強胃腸蠕動，增強機體對養(yǎng)分的吸收。楊朋飛等[28]、高堂亮[5]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加微生態(tài)制劑可提高奶牛DM和CP表觀消化率；Qiao等[29]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加100 g/d 活地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物顯著增加了荷斯坦奶牛有機物(OM)、NDF和ADF表觀消化率。本試驗中，飼糧中添加20 g/d的CPP顯著提高了育肥牛DM、CP和NDF表觀消化率，得益于酵母菌的營養(yǎng)活性、芽孢桿菌的纖維分解活性和生物奪氧特性、乳酸桿菌的抑菌活性，與上述研究結(jié)果一致。

田可[12]研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧中添加IN顯著提高了肉牛CP和NDF表觀消化率，可能因為IN作為底物支持部分微生物的生長，以及代謝產(chǎn)物調(diào)控胃腸道代謝功能，促進養(yǎng)分的消化吸收。本試驗中，飼糧中添加2%的IN只顯著增加了育肥牛CP表觀消化率，對NDF表觀消化率影響不顯著，可能原因為飼糧成分差異。Brambillasca等[30]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加IN對仔豬DM、OM、CP、EE、NDF和ADF表觀消化率均無顯著影響，可能與動物種類和發(fā)育階段有關(guān)。

梁金逢等[31]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加甘露寡糖和CPP提高了CP和EE表觀消化率，使得飼料中含氮物質(zhì)更多地向蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化。本試驗中，CPP和IN互作有提高CP表觀消化率的趨勢，可能與IN刺激CPP調(diào)控胃腸道營養(yǎng)消化吸收有關(guān)。

3.3 CPP和IN對育肥牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)和菌群的影響

湯志宏等[13]研究報道，飼糧中添加CPP提高了奶牛瘤胃NH3-N和微生物蛋白濃度；彭華[32]研究報道，飼糧中添加納豆枯草芽孢桿菌提高了奶牛瘤胃丙酸濃度，降低了瘤胃乙酸濃度。本試驗中，飼糧中添加CPP顯著提高了肉牛瘤胃丙酸和NH3-N濃度，與上述研究結(jié)果一致。而張志軍[33]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加CPP顯著提高了綿羊瘤胃TVFA、乙酸濃度及乙酸/丙酸，可能與飼糧成分、益生菌種類及活性有關(guān)。謝明欣等[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧精粗比為7∶3時添加CPP(枯草芽孢桿菌和釀酒酵母)導致乳酸利用菌(溶纖維丁酸弧菌)和纖維降解菌(白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌)數(shù)量先減少后增加，可能因為纖維降解菌降解纖維素時產(chǎn)生大量氫氣(H2)，抑制纖維菌的降解速度，導致乳酸利用菌和纖維降解菌數(shù)量減少；CPP保證纖維降解速率不降低，有利于飼糧中纖維素的利用和降低乳酸的積累。楊東吉等[35]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加釀酒酵母培養(yǎng)物改變了斷奶仔豬盲腸微生物相對豐度，有提高蛋白質(zhì)水解菌(棲瘤胃普雷沃氏菌)相對豐度的趨勢，提高了CP表觀消化率，促進了養(yǎng)分的吸收。本試驗中，飼糧中添加CPP顯著增加了肉牛瘤胃白色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量，顯著降低了瘤胃原蟲數(shù)量，使得飼料降解更充分，減少能量的損失，導致瘤胃丙酸和NH3-N濃度顯著上升，提高微生物蛋白的合成。

IN被胃腸道部分有益菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，具有調(diào)節(jié)胃腸道pH、抑制有害菌繁殖、調(diào)節(jié)機體能量代謝、促進礦質(zhì)元素吸收等生理功能，對于不能直接利用IN的微生物亦產(chǎn)生影響。Pablack等[8]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加3%的IN顯著增加了分娩母豬糞便中腸球菌數(shù)量，顯著降低了糞便pH。田可[12]研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧中添加2%的IN顯著降低了瘤胃pH，顯著增加了瘤胃丙酸、丁酸和異丁酸濃度。低pH有利于發(fā)揮IN的特性，有助于高精料飼糧下肉牛對養(yǎng)分的利用，同時飼糧的精料占比決定了瘤胃的發(fā)酵類型。本試驗中，飼糧中添加IN顯著降低了瘤胃pH，顯著增加了瘤胃丙酸濃度和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌數(shù)量，與上述研究結(jié)果一致。高精料飼糧中添加IN可提高瘤胃菌群的相對豐度和多樣性，是導致肉牛高ADG和低F/G的原因之一。IN在抑制有害菌的同時壯大部分有益菌群，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量的增加表明IN可優(yōu)化高精料飼糧下的瘤胃菌群，增加降解纖維和利用乳酸的能力[36]。

CPP中酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌通過生物奪氧、競爭抑制等手段抑制病原菌繁殖，促進有益菌生長；IN通過與病原菌外源凝集素特異結(jié)合，減少其在胃腸壁的黏附；IN刺激下的CPP可發(fā)酵生成更多的生理活性物質(zhì)，兩者共同促進有益菌的繁殖[37]。本試驗中，CPP和IN互作有提高瘤胃溶纖維丁酸弧菌數(shù)量的趨勢，提高了乳酸利用的能力。

3.4 CPP和IN對育肥牛血清生化和抗氧化指標的影響

本試驗中，飼糧中添加CPP顯著提高了血清GLU、TP含量和T-AOC，降低了血清UN和MDA含量。血清GLU含量是反映動物生理狀態(tài)的重要指標，飼糧中添加CPP使瘤胃丙酸含量升高，為肉牛肝臟糖異生提供了能量，可能是血清GLU含量上升的原因。血清TP含量是衡量動物飼糧蛋白質(zhì)利用效率的重要指標，血清UN含量反映瘤胃中氮的利用程度，本試驗中，飼糧中添加CPP提高了動物對飼糧蛋白質(zhì)的消化利用，使得瘤胃微生物蛋白合成增加，蛋白質(zhì)的瘤胃外流速度提高，機體蛋白質(zhì)分解減弱，氮利用率增加。張翔飛[38]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.1%的活性干酵母可顯著提高肉牛血清TP、ALB、球蛋白和GLU含量，降低血清UN含量。血清T-AOC反映機體抗氧化能力的大小，MDA是膜質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，反映組織過氧化損傷程度。彭濤等[4]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.4%的CPP顯著提高了舍飼山羊血清TP、球蛋白含量，顯著提高了血清T-AOC和SOD活性，顯著降低了血清MDA含量，與本研究結(jié)果一致。

Attia等[39]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加35 mg/kg的IN可提高母兔血清TP、ALB、球蛋白和GLU含量，降低血清UN、膽固醇含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。IN可降低動物和人的血液脂肪和膽固醇含量，可能與IN通過改善胃腸道菌群失調(diào)和利用腸道菌群代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)能量代謝有關(guān)。IN代謝產(chǎn)物為短鏈脂肪酸，其中丙酸鹽可抑制脂類合成、促進糖異生和蛋白質(zhì)合成[40]。同時，IN本身能促進益生菌繁殖，抑制病原菌增殖，增加胃腸菌群相對豐度，提高蛋白質(zhì)合成效率。本試驗中，飼糧中添加2%的IN顯著提高了血清GLU和TP含量，顯著降低了血清UN含量，提高了氮利用率。

本試驗中，CPP和IN互作有提高肉牛血清TP含量的趨勢。IN對CPP生長有促進作用，提高益生菌對飼糧蛋白質(zhì)的消化利用，促進瘤胃微生物蛋白的合成，同時降低UN生成，提高機體氮的利用率。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加CPP提高了瘤胃白色瘤胃球菌、琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量，增加了瘤胃丙酸和NH3-N濃度，提高了DM、CP和NDF表觀消化率，從而提高了育肥牛生長性能和飼料效率。

② 飼糧中添加IN提高了瘤胃琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量，增加了瘤胃丙酸濃度，提高了CP表觀消化率，從而提高了育肥牛生長性能和飼料效率。

③ CPP與IN互作有提高瘤胃溶纖維丁酸弧菌數(shù)量和CP表觀消化率的趨勢，從而提高了育肥牛生長性能。