不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞生長性能和腸道發(fā)育的影響

沈一茹 鐘 光 胡 艷 張 珊 燕 磊 施壽榮*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225125；2.新希望六和飼料股份有限公司，青島 266100)

作為抗生素替代品，酸化劑已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料中，因其可有效提高動(dòng)物的消化道適應(yīng)能力和腸道健康，已成為一種高效、無污染、無殘留的替代促生長型抗生素的保健型飼料添加劑[1-2]。在家禽生產(chǎn)中合理使用酸化劑，可通過抵御細(xì)菌的侵入來維護(hù)禽類的腸道健康，進(jìn)一步提高其生長性能[3]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，飲水中添加酸化劑可通過改善盲腸微生物區(qū)系、提高消化酶活性，從而提高肉雞對(duì)飼料中養(yǎng)分的利用率，改善其生長性能[4-5]；此外，在蛋雞生產(chǎn)中添加飲水型酸化劑，可顯著降低蛋雞的死亡率，并促進(jìn)蛋黃的沉積[6]。飼糧中添加飼料型酸化劑，可調(diào)節(jié)肉雞的胃腸道酸堿平衡，提高采食量，進(jìn)而促進(jìn)其生長性能；改善夏季蛋雞雞蛋的新鮮度，提高其抗氧化能力[7]。目前，對(duì)于家禽飼糧中酸化劑的使用研究均集中于單一添加方式酸化劑對(duì)其生長性能的影響，較少有研究比較相同的酸化劑在不同添加方式下對(duì)肉雞生長性能和腸道發(fā)育的影響。因此，本試驗(yàn)通過飲水添加和飼糧添加2種不同酸化劑添加方式，比較其對(duì)肉雞生長性能和腸道發(fā)育的影響，以期為酸化劑在肉雞生產(chǎn)中的高效使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

選用1日齡、體重相近的健康白羽肉雞512只，隨機(jī)分為4組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16只雞。正常對(duì)照組(normal control group，NC組)飼喂基礎(chǔ)飼糧和基礎(chǔ)飲用水；陽性對(duì)照組(positive control group，PC組)飼喂基礎(chǔ)飼糧+20 mg/kg維吉尼亞霉素和基礎(chǔ)飲用水；飲水酸化劑組(water acidifier group，WA組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飲用水中酸化劑添加量為0.1%，添加方式為每日定量混入基礎(chǔ)飲用水中；飼糧酸化劑組(feed acidifier group，F(xiàn)A組)飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.2%酸化劑和基礎(chǔ)飲用水，用酸化劑替代基礎(chǔ)飼糧中等量的玉米。基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型顆粒料，參照NRC(1994)雞的營養(yǎng)需要，按1～21日齡和22～42日齡2個(gè)階段進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。每日監(jiān)測各組飲用水pH，4組飲用水pH見表2。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 4組飲用水pH

飼養(yǎng)試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)季節(jié)為春季，所有雞只均在同一棟雞舍內(nèi)，采用地面平養(yǎng)的飼養(yǎng)方式，自由采食和飲水。7、14日齡分別接種新-傳二聯(lián)苗和法氏囊疫苗，21、28日齡分別飲水免疫新-傳二聯(lián)苗和法氏囊疫苗。試驗(yàn)期42 d。

1.2 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)用酸化劑主要成分為甲酸、甲酸銨、乙酸、丙酸和山梨酸復(fù)合組成。酸化劑和維吉尼亞霉素均由荷蘭某國際集團(tuán)提供。

1.3 樣品采集

分別于21和42日齡，每個(gè)重復(fù)選取1只接近平均體重的肉雞，剖開腹腔，在每只雞的相同部位取同樣長度的十二指腸、空腸和回腸組織，迅速置于多聚甲醛(4%)溶液中用于制作組織切片；用冰浴的生理鹽水沖洗腸腔，用沖洗過的載玻片刮取腸黏膜，置于凍存管中，迅速投入液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于基因表達(dá)測定。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 生長性能

試驗(yàn)從開始到結(jié)束，觀察、記錄雞群的健康狀況及臨床變化，記錄雞只的攝食和死亡情況，統(tǒng)計(jì)各組雞只的死亡數(shù)，計(jì)算死亡率(mortality)。分別在1、21、42日齡稱取各組雞只的體重，稱量前禁食12 h，計(jì)算各組雞只在1～21日齡、22～42日齡、1～42日齡階段的平均日增重(ADG)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)階段各組的投料量，計(jì)算各組雞只在1～21日齡、22～42日齡、1～42日齡的平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。計(jì)算歐洲效益指數(shù)(European profit index，EPI)，計(jì)算公式為：

EPI=[(體重×成活率)/(料重比×

出欄日齡)]×10 000。

1.4.2 腸道形態(tài)

腸道切片使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法[8]，使用正置顯微鏡放大40倍進(jìn)行觀察，每張切片觀察并量取10根有代表性的絨毛，量取不同腸段絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨隱比(V/C)，計(jì)算公式為：

絨隱比=絨毛高度/隱窩深度。

1.4.3 腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量

十二指腸、空腸和回腸組織采用高碘酸-無色品紅染色法(periodic acid-schiff，PAS)[9]，每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)視野放大100倍進(jìn)行觀察。拍照時(shí)應(yīng)選取組織中有代表性的視野。應(yīng)用Image Pro Plus軟件，每個(gè)視野至少選取5根有代表性的絨毛，記錄選取的絨毛中杯狀細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算1 000個(gè)上皮細(xì)胞內(nèi)所含有的杯狀細(xì)胞數(shù)量。

1.4.4 腸道緊密連接蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定空腸黏膜中閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)、密閉蛋白(Occuludin)、封閉蛋白-1(Claudin-1)、封閉蛋白-2(Claudin-2)和封閉蛋白-3(Claudin-3)的mRNA相對(duì)表達(dá)量?？俁NA的提取使用Trizol法進(jìn)行提取，RNA純度與濃度使用核酸檢測儀(Beckman，美國)檢測，使用試劑盒(TaKaRa，日本)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA留存待用。引物購于上海Invitrigen公司，引物序列見表3。使用10.0 μL反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國)進(jìn)行測定。選擇β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表3 引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因子方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)組間差異顯著性及影響效應(yīng)，使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞生長性能的影響

由表4可知，與NC組相比，WA和FA組的歐洲效益指數(shù)分別提高了8.91%和10.84%(P<0.05)，且與PC組無顯著差異(P>0.05)。與NC組相比，F(xiàn)A組的死亡率降低了66.60%(P<0.05)，料重比有降低趨勢(P=0.089)，且與PC組無顯著差異(P>0.05)；與WA組相比，F(xiàn)A組的死亡率降低了50.15%(P<0.05)，其他生長性能指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示，酸化劑通過飲水添加和飼糧添加在促進(jìn)肉雞生長性能的作用上均可替代抗生素，但飼糧添加的效果優(yōu)于飲水添加。

表4 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞生長性能的影響

2.2 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

由表5可知，與NC組相比，WA和FA組的21日齡十二指腸隱窩深度分別降低了23.35%和30.84%(P<0.05)，21日齡十二指腸絨隱比分別提高了29.73%和33.28%(P<0.05)，且與PC組無顯著差異(P>0.05)。與NC組相比，WA和FA組的42日齡十二指腸絨隱比分別提高了28.83%和27.62%(P<0.05)，且與PC組無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示，酸化劑通過飲水添加和飼糧添加均可有效提高肉雞十二指腸的腸道發(fā)育，尤其是對(duì)肉雞育雛期的作用效果明顯。

表5 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞十二指腸形態(tài)的影響

由表6可知，與NC組相比，F(xiàn)A組的42日齡空腸絨隱比提高了27.83%(P<0.05)，且與PC組無顯著差異(P>0.05)；WA組的空腸形態(tài)指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示，酸化劑通過飼糧添加在空腸的作用效果優(yōu)于飲水添加。

表6 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞空腸形態(tài)的影響

由表7可知，與NC組相比，F(xiàn)A組的21日齡回腸絨隱比顯著提高(P<0.05)，21日齡回腸隱窩深度有降低趨勢(P=0.065)，且與PC組無顯著差異(P>0.05)；WA組的回腸形態(tài)指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果提示，酸化劑通過飼糧添加在回腸的作用效果優(yōu)于飲水添加。

表7 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞回腸形態(tài)的影響

2.3 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量和緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

由表8可知，與NC組相比，F(xiàn)A組的21日齡十二指腸和空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著提高(P<0.05)，42日齡空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著提高(P<0.05)；WA和FA組的42日齡回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量有提高趨勢(P=0.051)。以上結(jié)果提示，酸化劑通過飼糧添加對(duì)腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響優(yōu)于飲水添加。

表8 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

由表9可知，與NC組相比，WA和FA組的21日齡空腸封閉蛋白-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著提高(P<0.05)，F(xiàn)A組的21和42日齡空腸封閉蛋白-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。以上結(jié)果提示，酸化劑通過飲水添加和飼糧添加對(duì)早期腸道緊密連接蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用，并優(yōu)于抗生素。

表9 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞空腸黏膜緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞生長性能的影響

自2020年7月我國畜牧業(yè)飼料嚴(yán)格禁抗以來，多種飼料添加劑紛紛問世，包括益生菌、酶制劑、植物提取物和酸化劑等。這些添加劑因其功能不同，作用機(jī)制也不盡相同，但它們的最終目的都是替代飼料中促生長型抗生素的作用，以期在飼料無抗條件下保持動(dòng)物的生長性能[10]。其中，酸化劑作為高效、無污染、無殘留的添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。本研究結(jié)果表明，不同添加方式的酸化劑可有效提高肉雞的歐洲效益指數(shù)，與添加抗生素?zé)o顯著差異，這與之前研究結(jié)果一致，即可通過降低肉雞腸道pH[11]、減少腸道有害菌的增長[12]、提高其對(duì)飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率[13]等多個(gè)方面的作用有效提高肉雞的生長性能[14]。本試驗(yàn)使用的酸化劑主要成分為甲酸及其銨鹽，甲酸作為短鏈有機(jī)酸的一種，具有較強(qiáng)的抑菌殺菌能力，在市場上使用范圍較廣。過量添加甲酸則存在腐蝕性強(qiáng)和氣味大等缺點(diǎn)，而適量添加甲酸及其銨鹽能有效提高飼糧的適口性，促進(jìn)采食，并使其在體內(nèi)游離出甲酸，起到殺菌和降低胃腸道pH的作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與飲水添加相比，酸化劑通過飼糧添加可顯著降低死亡率，有降低全期料重比的趨勢，其效果接近于添加抗生素，說明酸化劑通過飼糧添加對(duì)生長性能的影響優(yōu)于飲水添加。本試驗(yàn)在飲用水中添加酸化劑后，飲水pH降至3.9左右。研究發(fā)現(xiàn)，飲水型酸化劑可通過降低脂肪酶活性和腸道有害菌數(shù)量來提高肉雞的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率[15]。因此，本試驗(yàn)中酸化劑通過飲水添加也表現(xiàn)出較好的替抗效果，但偏酸性的水可能影響了飲水的適口性，進(jìn)而導(dǎo)致其添加效果不如飼糧添加。另外，酸化劑通過飼糧添加除了以上效果外，還能夠提高肉雞腸道總蛋白酶和小腸蛋白酶活性[16]。本試驗(yàn)中，酸化劑通過飼糧添加的效果優(yōu)于飲水添加，除了適口性的原因，推測可能與2種添加類型的酸化劑在腸道的停留時(shí)間有關(guān)，停留時(shí)間越久，其對(duì)腸道的作用效果越好，腸道的蛋白酶活性和吸收能力越強(qiáng)，進(jìn)而表現(xiàn)出的生長性能越好。

3.2 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞腸道形態(tài)的影響

小腸是肉雞消化道中消化和吸收飼料營養(yǎng)物質(zhì)的主要部位，而腸道形態(tài)中的絨毛高度和隱窩深度則反映了飼料中營養(yǎng)物質(zhì)與小腸的接觸面積。絨毛增高，腸道吸收面積增加；隱窩變淺，腸上皮成熟率上升；腸道黏膜的絨隱比增加，可進(jìn)一步表明腸道發(fā)育的完善和腸道吸收功能的增強(qiáng)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，酸化劑通過飼糧添加對(duì)肉雞21和42日齡的十二指腸、空腸和回腸的腸道形態(tài)均有較優(yōu)的改善效果，而飲水添加的改善效果集中于十二指腸，提示其主要作用于小腸前段。近年來多項(xiàng)研究報(bào)道，飼糧中添加酸化劑可有效增加十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度，降低隱窩深度，其對(duì)腸道形態(tài)改善的部位和程度根據(jù)所添加的酸化劑的水平和種類有不同程度的改變。不同種類的有機(jī)酸可以刺激腸道上皮細(xì)胞增生，并與腸道內(nèi)的無機(jī)鹽結(jié)合形成有機(jī)酸，提升腸道絨毛高度，增加腸道的有效吸收面積，進(jìn)而提高生長性能[5, 18]。而近年來關(guān)于飲水中添加酸化劑的研究則主要報(bào)道其對(duì)肉雞空腸的絨毛高度和隱窩深度的改善[15,19]，較少有報(bào)道其對(duì)小腸后段的有益影響[20]。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果相似，酸化劑通過飼糧添加對(duì)多個(gè)腸道形態(tài)均有改善作用，而飲水添加對(duì)腸道形態(tài)的作用范圍較小。原因可能為酸化劑通過飼糧添加在腸道內(nèi)移動(dòng)過程緩于飲水添加，其作用時(shí)長和作用范圍增加，進(jìn)而表現(xiàn)出更優(yōu)的腸道形態(tài)改善作用。酸化劑在腸道內(nèi)制造的酸性環(huán)境可有效抑制有害菌對(duì)腸道黏膜的侵害，減少飼料在腸道內(nèi)的發(fā)酵，降低食糜黏度，增強(qiáng)其可消化性，有利于腸道黏膜的生長，減少損傷[21]。另有研究表明，與未添加酸化劑的肉雞相比，飲水中添加0.25%的有機(jī)酸可降低肉雞腸道的pH、糞便水分和十二指腸的食糜黏度[22]，而飼糧中添加0.25%的有機(jī)酸也可顯著降低十二指腸的腸道pH和食糜黏度[23]，但未有報(bào)道比較2種添加形式之間的腸道pH和食糜黏度的區(qū)別。

3.3 不同添加方式的酸化劑對(duì)肉雞腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量和緊密鏈接蛋白表達(dá)的影響

廣泛分布于小腸上皮細(xì)胞之間的杯狀細(xì)胞是腸道屏障的重要指標(biāo)之一。杯狀細(xì)胞可形成分泌大量的黏蛋白，釋放進(jìn)入腸道后可成為潤滑性的黏液涂布于上皮表面，保護(hù)上皮細(xì)胞形成腸道完整性和健康的第1道屏障[24]。腸道屏障的緊密連接則是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的屏障結(jié)構(gòu)，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的通透性而選擇吸收水分、離子及營養(yǎng)物質(zhì)。腸道的緊密連接蛋白的完整性則對(duì)腸道上皮細(xì)胞之間的連接和維持腸道上皮的完整性方面發(fā)揮了重要的作用[25]。因此，腸道的杯狀細(xì)胞數(shù)量和緊密連接蛋白可以作為腸道屏障功能和腸道發(fā)育的重要評(píng)判指標(biāo)。酸化劑的添加可增加肉雞腸道中短鏈脂肪酸含量，短鏈脂肪酸在腸道內(nèi)不僅可作為營養(yǎng)物質(zhì)供能，更能調(diào)控腸道的細(xì)胞代謝[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同添加方式的酸化劑均有提高回腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的趨勢，但酸化劑通過飼糧添加可顯著提高肉雞空腸杯狀細(xì)胞數(shù)量，其效果優(yōu)于添加抗生素。研究表明，酸化劑對(duì)仔豬杯狀細(xì)胞的促生長作用等于甚至優(yōu)于抗生素[27]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。有報(bào)道稱酸化劑可提高禽類的免疫功能[28]，而抗生素則會(huì)影響動(dòng)物腸道免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[29]，導(dǎo)致腸道菌群紊亂，證明酸化劑對(duì)腸道屏障的作用優(yōu)于抗生素。進(jìn)一步對(duì)肉雞空腸黏膜的緊密連接蛋白表達(dá)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，酸化劑通過飼糧添加可顯著提高肉雞空腸封閉蛋白-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以上結(jié)果與腸道形態(tài)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。研究表明，酸化劑可通過提高豬的小腸上皮細(xì)胞腸道緊密連接蛋白含量來修復(fù)腸道損傷，進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞間緊密連接，增強(qiáng)腸黏膜的屏障供能[30-31]。

以上結(jié)果說明，酸化劑可通過提高腸道緊密連接蛋白表達(dá)和杯狀細(xì)胞數(shù)量來提高肉雞腸道的屏障功能，而酸化劑通過飼糧添加則可進(jìn)一步放大這種優(yōu)化功能，使肉雞的腸道發(fā)育優(yōu)于飲水添加。

4 結(jié) 論

① 酸化劑通過飼糧添加和飲水添加對(duì)肉雞生長性能的促進(jìn)作用與抗生素相當(dāng)，對(duì)腸道發(fā)育的促進(jìn)作用優(yōu)于抗生素。

② 酸化劑通過飼糧添加對(duì)肉雞生長性能和腸道發(fā)育的改善作用優(yōu)于飲水添加。