妊娠-泌乳期巴馬香豬腸道菌群結(jié)構(gòu)組成與多樣性的變化

馬 翠 高乾坤 唐 武 祝 倩 張旺宏 孔祥峰*

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

妊娠期和泌乳期母豬的飼養(yǎng)管理水平直接決定了種豬場的生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益。妊娠和泌乳是2個極其復(fù)雜的生理過程，在上述過程中機(jī)體營養(yǎng)代謝會發(fā)生顯著變化，而腸道微生物對宿主的營養(yǎng)代謝發(fā)揮著重要作用[1]。因此，了解不同妊娠和泌乳期母豬腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和多樣性的變化規(guī)律，對提高母豬機(jī)體健康和繁殖性能具有重要意義。妊娠過程中動物腸道菌群組成會發(fā)生顯著變化，這有助于宿主妊娠期間的營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)和免疫適應(yīng)[2]。Wu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，宿主的飲食組成會影響其腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成，其中富含蛋白質(zhì)和動物脂肪的飲食可顯著增加腸道擬桿菌屬相對豐度，而富含碳水化合物的飲食可顯著增加腸道普氏菌屬相對豐度。Koren等[4]和Cheng等[5]均報道，妊娠期腸道菌群的改變與母體妊娠引起的代謝變化密切相關(guān)，這對預(yù)測孕婦早產(chǎn)及其機(jī)體健康具有重要意義。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，長白豬的妊娠進(jìn)程與脂質(zhì)代謝和腸道菌群變化有關(guān)，尤其是與普式菌屬、琥珀弧菌屬、擬桿菌屬等碳水化合物降解菌密切相關(guān)[6]。由此可見，腸道菌群可能是改善母體代謝與機(jī)體健康的重要調(diào)控靶點(diǎn)。而巴馬香豬作為我國優(yōu)良地方小型豬品種之一，其基因純合、耐粗飼、肉質(zhì)優(yōu)良。但目前巴馬香豬的飼養(yǎng)管理較為粗放，多飼喂?fàn)I養(yǎng)價值低且不易被消化的青粗飼料，導(dǎo)致母豬繁殖性能低下，繼而影響?zhàn)B殖場的生產(chǎn)效率[7]。了解妊娠-泌乳期巴馬香豬腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成變化，能為提高其繁殖性能提供依據(jù)。因此，本試驗(yàn)研究了不同妊娠-泌乳期巴馬香豬腸道菌群結(jié)構(gòu)組成與多樣性的變化規(guī)律，對提高母豬的機(jī)體健康水平、繁殖性能及子代生長發(fā)育具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計與飼養(yǎng)管理

動物飼養(yǎng)試驗(yàn)于2018年8月至2019年2月在湖南省常德市石門縣漢唐農(nóng)業(yè)有限公司香豬養(yǎng)殖基地開展。試驗(yàn)選取3～7胎次剛配種的巴馬香豬20頭(其中多為3～5胎次，僅有4頭母豬為6～7胎次)，單欄飼養(yǎng)，分娩前1周轉(zhuǎn)至產(chǎn)房。母豬配種后至妊娠第105天飼喂妊娠母豬飼糧，妊娠第105天至斷奶后第21天飼喂泌乳母豬飼糧。試驗(yàn)期間不使用抗生素或益生菌，每天08:00和17:00飼喂，自由飲水。參照我國《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 65—2004)和NRC(2012)母豬營養(yǎng)需要量，基礎(chǔ)飼糧組成及其營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期為母豬配種后第3天至分娩后第21天。試驗(yàn)期間，有4頭母豬返情(為6～7胎次母豬)，16頭母豬正常妊娠和分娩。其他飼養(yǎng)管理均按商業(yè)養(yǎng)豬場規(guī)范操作。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集與菌群16S rDNA測序

分別于母豬妊娠第30、60和90天以及泌乳第14天(由于分娩欄舍的限制僅收集到了其中7頭母豬糞便樣品)，每天09:00—11:00采集母豬新鮮糞便，置于10 mL無菌離心管中，-20 ℃保存。將糞便樣品解凍后均勻混合，取0.2 g左右樣品，利用快速DNA旋轉(zhuǎn)提取試劑盒(MP Biomedicals公司，美國)抽提總DNA，利用NanoDrop 1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，美國)檢測DNA的濃度和純度；利用338F(5’-GCACCTAAYT GGGYDTAAAGNG-3’)和806R(5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’)引物對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min，25個循環(huán)(98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增體系為25 μL：包括5 μL 5×緩沖液，5 μL 5×High-Fidelity GC緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，1 μL上、下游引物(10 μmol/L)，0.25 μL High-Fidelity DNA聚合酶(5 U/μL)；2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Agencourt AMPure Beads(Beckman Coulter公司，美國)純化和PicoGreen dsDNA試劑盒(Invitrogen公司，美國)定量，PCR擴(kuò)增結(jié)果利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，于Illumina MiSeq平臺進(jìn)行雙端測序(2×300 bp，上海派森諾生物科技有限公司)。

1.3 生物信息學(xué)與差異顯著性分析

對測序得到的PE reads進(jìn)行去引物、質(zhì)量過濾和拼接。利用QIIME軟件調(diào)用UCLUS序列比對工具對質(zhì)控后得到的有效序列在97%序列相似度下聚類，得到可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)代表序列，并將其與GreenGene數(shù)據(jù)庫(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)[8]的模板序列進(jìn)行比對，獲取每個OTU對應(yīng)的分類學(xué)信息?；讷@得的OTU信息，調(diào)用QIIME軟件alpha_diversity.py命令分析樣品的ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)等Alpha多樣性指數(shù)；在門和屬水平上聚類分析樣品的物種組成和相對豐度。利用PICRUSt軟件對糞便菌群進(jìn)行功能預(yù)測，通過KEGG Pathway分析菌群豐度，篩選代謝功能具有顯著差異的糞便菌群。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010初步整理后，腸道菌群相對豐度變化利用Metastats軟件(http://metastats.cbcb.umd.edu/)分析，利用R軟件ggplot2程序以及GraphPad Prism V.7.0軟件繪圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 母豬糞便菌群多樣性的變化

高通量測序下機(jī)序列經(jīng)質(zhì)量控制篩選后，55個糞便菌群樣品測序共產(chǎn)生2 247 367條高質(zhì)量序列，平均每個樣本40 861條?；?7%相似性水平對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，共獲得77 356個OTU，平均每個樣本獲得1 406個OTU。

由表2可見，與妊娠第30天相比，妊娠第60天母豬糞便菌群Simpson和Shannon指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與妊娠第90天相比，泌乳第14天母豬糞便菌群Chao1和ACE指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

表2 妊娠-泌乳期母豬糞便菌群的Alpha多樣性

由圖1可見，基于偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)的分析結(jié)果表明，妊娠第30、60、90天與泌乳第14天之間糞便菌群結(jié)構(gòu)均有明顯區(qū)分并趨向聚成2個類群，說明妊娠期與泌乳期母豬糞便菌群結(jié)構(gòu)組成明顯差異。

P30、P60、P90、L14分別表示妊娠第30、60和90天以及泌乳第14天。下圖同。

2.2 母豬糞便菌群門和屬水平組成的變化

由圖2可見，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體門(Spirochaetes)和變形菌門(Proteobacteria)為母豬糞便菌群的主要優(yōu)勢菌門(圖2-A)；鏈球菌屬(Streptococcus)、密螺旋體屬(Treponema)、普式菌屬(Prevotella)、乳酸菌屬(Lactobacillus)為母豬糞便菌群的主要優(yōu)勢菌屬(圖2-B)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)藻菌門；Tenericutes：柔膜菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Streptococcus：鏈球菌屬；Treponema：密螺旋體屬；Prevotella：普式菌屬；Lactobacillus：乳酸菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Clostridium：梭桿菌屬；Parabacteroides：副桿菌屬；Fibrobacter：纖維桿菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Dorea：多爾氏菌屬；Other：其他。

2.3 母豬糞便菌群門和屬水平差異菌群的變化

由圖3-A可見，與妊娠第30和60天相比，泌乳第14天糞便菌群螺旋體門相對豐度顯著降低(P<0.05)。與妊娠第90天相比，泌乳第14天糞便菌群厚壁菌門、螺旋體門和變形菌門相對豐度顯著增加(P<0.05)，擬桿菌門相對豐度顯著降低(P<0.05)。與妊娠第30、60和90天相比，泌乳第14天糞便菌群藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)相對豐度顯著降低(P<0.05)。

由圖3-B可見，與妊娠第30天相比，妊娠第60和90天糞便菌群梭桿菌屬(Clostridium)相對豐度顯著降低(P<0.05)，妊娠第60和90天以及泌乳第14天糞便菌群蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)相對豐度顯著降低(P<0.05)，泌乳第14天顫螺菌屬(Oscillospira)和多爾氏菌屬(Dorea)相對豐度顯著增(P<0.05)。與妊娠第60天相比，泌乳第14天糞便菌群乳酸菌屬相對豐度顯著增加(P<0.05)。與妊娠第90天相比，泌乳第14天糞便菌群考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)相對豐度顯著增加(P<0.05)，密螺旋體屬和羅斯氏菌屬(Roseburia)相對豐度顯著降低(P<0.05)。與妊娠第30和60天相比，泌乳第14天糞便菌群貪銅菌屬(Cupriavidus)相對豐度顯著增加(P<0.05)。與妊娠第60和90天相比，泌乳第14天糞便菌群阿克曼菌屬(Akkermansia)相對豐度顯著降低(P<0.05)。與妊娠第30、60和60天相比，泌乳第14天糞便菌群布雷德菌屬(Bulleidia)相對豐度顯著增加(P<0.05)。

2.4 母豬糞便菌群代謝功能的變化

如表3所示，與妊娠第30天相比，妊娠60第天糞便菌群碳水化合物代謝通路、聚糖生物合成與代謝通路相對豐度顯著增加(P<0.05)。與妊娠第60天相比，泌乳第14天糞便菌群碳水化合物代謝通路、聚糖生物合成和代謝通路、核苷酸代謝通路相對豐度顯著降低(P<0.05)。與妊娠第30和60天相比，泌乳第14天糞便菌群脂代謝通路相對豐度顯著增加(P<0.05)，其他氨基酸代謝通路相對豐度顯著降低(P<0.05)。與妊娠第90天相比，泌乳第14天糞便菌群氨基酸代謝通路相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表3 妊娠-泌乳期母豬糞便菌群的代謝功能

3 討 論

腸道菌群結(jié)構(gòu)組成受宿主遺傳背景、生理狀態(tài)、年齡、飲食、飼養(yǎng)環(huán)境[9]等因素的影響[4]。為了滿足母體自身及胎兒生長發(fā)育的營養(yǎng)需要，妊娠期間宿主的激素分泌、營養(yǎng)代謝、免疫功能和腸道菌群均會發(fā)生變化[10]。有研究表明，較低的腸道菌群豐富度與機(jī)體胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)之間存在相關(guān)性[11]；肥胖孕婦的腸道菌群豐富度降低，其腸道通透性增加[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與妊娠后期相比，泌乳期母豬糞便菌群豐富度降低，提示泌乳期母豬可能存在輕度的機(jī)體炎癥反應(yīng)。

厚壁菌門和擬桿菌門是妊娠-泌乳期母豬腸道中最豐富的菌門。在本研究中，妊娠期巴馬香豬糞便菌群優(yōu)勢菌屬為鏈球菌屬、密螺旋體屬、普氏菌屬和乳酸菌屬。另有研究表明，妊娠期環(huán)江香豬糞便菌群優(yōu)勢菌屬為乳酸菌屬、密螺旋體屬、瘤胃球菌屬和梭桿菌屬[13]，妊娠長白豬糞便菌群優(yōu)勢菌屬為密螺旋體屬、梭桿菌屬、瘤胃球菌屬和普氏菌屬[14]。這說明遺傳背景是影響母豬腸道菌群組成的重要因素。近期研究表明，富集的變形菌門是腸道菌群失調(diào)和腸上皮功能障礙的潛在指示菌群[15]。螺旋體門相對豐度的減少可以緩解妊娠小型豬的便秘[16]。在本研究中，與妊娠第90天相比，泌乳第14天糞便菌群厚壁菌門、螺旋體門和變形菌門相對豐度顯著增加，提示泌乳中期變形菌門富集會導(dǎo)致腸道黏膜的低度炎癥，這種炎癥可能促使菌群失調(diào)進(jìn)入一個正反饋反應(yīng)，有益于宿主機(jī)體健康[4]。早期研究表明，肥胖與厚壁菌門相對豐度的增加有關(guān)[17]，擬桿菌門因含有大量碳水化合物活性酶，可降解碳水化合物和蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)化合物[18]。厚壁菌門相對豐度增加被認(rèn)為是增強(qiáng)宿主從飲食中獲取能量的一種手段[19]，這有利于母體為其泌乳做好能量儲備。Jumpertz等[20]研究表明，厚壁菌門相對豐度的增加和擬桿菌門相對豐度的減少與能量增加有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與妊娠期相比，泌乳期巴馬香豬糞便菌群厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度降低，與妊娠長白豬上的研究結(jié)果[5]不同，該差異可能與試驗(yàn)豬的遺傳背景不同有關(guān)。與妊娠第60天相比，泌乳第14天母豬糞便菌群乳酸菌屬和阿克曼菌屬相對豐度顯著增加。乳酸菌屬可促進(jìn)宿主脂質(zhì)代謝[21]；阿克曼菌屬與改善機(jī)體代謝有關(guān)，阿克曼菌屬相對豐度低的宿主易患肥胖和發(fā)生炎癥[22]。上述研究表明，泌乳期母豬腸道菌群的變化有利于其泌乳過程。由此可知，不同妊娠-泌乳期母豬的腸道菌群組成不同，可能與其不同生理狀態(tài)下的代謝差異有關(guān)。

Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)藻菌門；Treponema：密螺旋體屬；Lactobacillus：乳酸菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Cupriavidus：貪銅菌屬；Adlercreutzia：阿德勒克魯特菌屬；Clostridium：梭桿屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Dorea：多爾氏菌屬；Roseburia：羅斯氏菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Bulleidia：布雷德菌屬。

腸道菌群的代謝產(chǎn)物可調(diào)控宿主的生長發(fā)育。其中，多胺可參與調(diào)節(jié)胎盤和胎兒生長發(fā)育、血管生成以及DNA和蛋白質(zhì)的合成[23]。本研究PICRUSt預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，與妊娠第30天相比，妊娠第60天母豬糞便菌群聚糖生物合成和代謝通路、碳水化合物代謝通路相對豐度顯著增加，表明不同生理狀態(tài)下宿主腸道菌群有利于滿足其營養(yǎng)需要。另外，與妊娠第30和60天相比，泌乳第14天糞便菌群脂代謝通路相對豐度顯著增加，可能是因?yàn)槊谌槠谀肛i飼糧粗蛋白質(zhì)水平(16.30%)高于妊娠母豬飼糧粗蛋白質(zhì)水平(12.82%)。有研究發(fā)現(xiàn)，膳食脂類可在腸腔中被水解，進(jìn)而通過蛋白質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制被宿主腸上皮細(xì)胞吸收利用[24]。阿克曼菌屬(為產(chǎn)丁酸菌)具有緩解機(jī)體炎癥和改善腸道功能的作用[25]。多數(shù)來源于細(xì)菌的氨基酸均可參與機(jī)體免疫功能的調(diào)控[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，與妊娠第30天相比，妊娠90第天母豬糞便菌群的氨基酸代謝通路相對豐度顯著增加，提示妊娠后期母豬腸道菌群的變化可能有利于其機(jī)體健康的維持，防止機(jī)體炎癥的發(fā)生。

4 結(jié) 論

不同妊娠-泌乳期巴馬香豬糞便菌群結(jié)構(gòu)組成發(fā)生不同變化，妊娠中期母豬糞便擬桿菌門和密螺旋體屬相對豐度較高，菌群碳水化合物和核苷酸代謝通路上調(diào)，以滿足妊娠母豬自身營養(yǎng)需要和胎兒生長發(fā)育需要。