柑橘提取物對仔豬盲腸微生物數(shù)量和代謝產(chǎn)物的影響

崔藝燕 魯慧杰 李貞明 田志梅 余 苗 鄧 盾 馬現(xiàn)永,2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640; 2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

抗生素可通過調(diào)節(jié)腸道健康、增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、平衡微生物菌群來緩解仔豬斷奶應(yīng)激[1]。然而抗生素的禁用/限用不利于仔豬斷奶應(yīng)激的緩解，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響。植物提取物能抑制有害細(xì)菌的生長，可提高動物的生長性能，是一種緩解仔豬斷奶應(yīng)激的抗生素替代品。柑橘提取物(citrus extract，CE)主要生物活性成分是黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗菌等功能[2-3]，是一種潛在的飼料添加劑。以往研究證明了CE在動物生產(chǎn)的益處。CE增強(qiáng)肉雞的腸黏膜健康和刺激免疫反應(yīng)[4]，改善肉雞品質(zhì)[5]，減少盲腸中大腸桿菌的數(shù)量[6]。CE可以調(diào)節(jié)和提高仔豬的免疫功能和抗氧化能力，提高蛋白質(zhì)的吸收和利用，改善仔豬腸道健康[7-9]。

斷奶影響仔豬能量代謝、蛋白質(zhì)代謝以及腸上皮細(xì)胞的增殖[10]，會造成采食減少、胃腸道功能紊亂、腹瀉等應(yīng)激反應(yīng)。斷奶仔豬腸道不成熟，較多未消化的蛋白質(zhì)會導(dǎo)致腸腔更多的蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，同時也更容易受到蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物的負(fù)面影響。微生物發(fā)酵蛋白質(zhì)會產(chǎn)生氨、生物胺、吲哚和糞臭素等物質(zhì)，這些代謝物對腸上皮細(xì)胞有毒性和促炎作用，會破壞腸道屏障功能，損害動物健康[11-12]。腸道微生物及其代謝物對于維持腸道健康很重要[13]。然而，CE對斷奶仔豬腸道微生物及其代謝物的影響研究有限。飼糧中添加CE是否會影響仔豬的盲腸蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物仍不清楚。因此，本試驗(yàn)擬探討飼糧添加CE對仔豬盲腸微生物數(shù)量及代謝產(chǎn)物的影響，為應(yīng)用CE緩解仔豬斷奶應(yīng)激提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

15%金霉素購自廣東某飼料科技有限公司。CE含有3.04%維生素C、2.38%維生素E、2.89%檸檬酸和20.77%總黃酮，由廣東某科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動物、試驗(yàn)處理和試驗(yàn)飼糧

選用144頭28日齡杜×長×大仔豬[體重(8.39±1.06)kg]，按體重隨機(jī)分為3組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)8頭豬(公母各占1/2)。試驗(yàn)周期為28 d。對照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組(ANTI組)在基礎(chǔ)飼糧中添加75 g/t金霉素，CE組在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mL/t CE?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見本課題組同期文獻(xiàn)[7-9]。本課題組同期試驗(yàn)表明，在數(shù)值上，CE組和ANTI組仔豬的生長性能優(yōu)于CON組[9]。

1.3 飼養(yǎng)管理與屠宰采樣

試驗(yàn)在廣東省新興縣豐利田農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司豬場進(jìn)行。按照豬場常規(guī)程序管理。每個重復(fù)選取接近平均體重的2頭仔豬，屠宰后分離出盲腸，將盲腸內(nèi)容物混勻，收集約10 g內(nèi)容物，-80 ℃保存。

1.4 微生物數(shù)量的計數(shù)

采用平板計數(shù)法10倍梯度稀釋進(jìn)行微生物數(shù)量的測定，大腸桿菌采用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，乳酸菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基。

1.5 游離氨基酸含量的測定

參考文獻(xiàn)[9]的方法，游離氨基酸的含量通過全自動氨基酸儀(HITACHI L-8900)測定。

1.6 酚和吲哚類化合物、生物胺含量的測定

參照文獻(xiàn)[14]的方法，酚和吲哚類化合物、生物胺的含量使用高效液相色譜儀(Waters Alliance e2695)測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，后用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 CE對仔豬盲腸微生物數(shù)量的影響

由表1可知，與CON組相比，CE組盲腸乳酸菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，ANTI組乳酸菌數(shù)量顯著減少(P<0.05)。CE組盲腸乳酸菌數(shù)量顯著高于ANTI組(P<0.05)。與CON組相比，CE組和ANTI組盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著減少(P<0.05)。CE組盲腸大腸桿菌數(shù)量顯著低于ANTI組(P<0.05)。

表1 CE對仔豬盲腸微生物數(shù)量的影響(濕重基礎(chǔ))

2.2 CE對仔豬盲腸內(nèi)容物游離氨基酸含量的影響

由表2可知，與CON組和ANTI組相比，CE組盲腸內(nèi)容物中?；撬?、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸的含量顯著減少(P<0.05)；CON組與ANTI組間上述游離氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)。與CON組相比，CE組和ANTI組盲腸內(nèi)容物中鳥氨酸和脯氨酸含量顯著減少(P<0.05)。與CON組相比，CE組盲腸內(nèi)容物中天冬氨酸、異亮氨酸、胱硫醚、羥賴氨酸、總氨基酸含量顯著減少(P<0.05)，而谷氨酸和丙氨酸含量有減少的趨勢(0.05≤P<0.10)；ANTI組上述氨基酸與CON組和CE組差異不顯著(P>0.05)。3組間盲腸內(nèi)容物中甘氨酸、瓜氨酸、α-氨基正丁酸、酪氨酸、苯丙氨酸、γ-氨基丁酸、色氨酸含量無顯著差異(P>0.05)。

表2 CE對仔豬盲腸內(nèi)容物中游離氨基酸含量的影響(濕重基礎(chǔ))

2.3 CE對仔豬盲腸內(nèi)容物酚和吲哚類化合物、生物胺含量的影響

由表3可知，與CON組相比，CE組盲腸內(nèi)容物中苯酚和糞臭素含量顯著減少(P<0.05)；ANTI組盲腸內(nèi)容物中苯酚和糞臭素含量與CON組和CE組差異不顯著(P>0.05)。與CON組和ANTI組相比，CE組盲腸內(nèi)容物中腐胺含量顯著減少(P<0.05)，酪胺和精胺含量有減少的趨勢(0.05≤P<0.10)。與CON組相比，CE組和ANTI組盲腸內(nèi)容物中甲胺含量顯著減少(P<0.05)。不同組間仔豬盲腸內(nèi)容物中對甲酚、吲哚、色胺、尸胺、亞精胺、組胺、總生物胺含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 CE對仔豬盲腸內(nèi)容物中酚和吲哚類化合物、生物胺含量的影響(濕重基礎(chǔ))

3 討 論

3.1 CE對仔豬盲腸微生物數(shù)量的影響

斷奶時仔豬微生物群落的變化表現(xiàn)為專性厭氧菌的減少和兼性厭氧菌數(shù)量的增加，這導(dǎo)致腸道內(nèi)微生物多樣性減少[15]。植物提取物可以通過減少腸道中的病原體來促進(jìn)動物健康。在本研究中，與CON組和ANTI組相比，CE組增加了盲腸內(nèi)容物中乳酸菌數(shù)量，同時減少了大腸桿菌數(shù)量，與以往研究結(jié)果[16-18]一致。柑橘果皮顯著減少肉雞盲腸的腸桿菌科和大腸桿菌的數(shù)量，顯著增加乳酸菌數(shù)量[16]。Duque等[17]使用腸道微生態(tài)系統(tǒng)模擬器評估橙汁對腸道微生物群的影響，發(fā)現(xiàn)橙汁增加結(jié)腸乳桿菌數(shù)量和減少腸桿菌數(shù)量。Estruel-Amades等[18]發(fā)現(xiàn)200 mg/kg橙皮苷增加大鼠糞便乳桿菌數(shù)量并減少大腸桿菌數(shù)量。每天飲用橙汁可以增加女性糞便雙歧桿菌和乳酸菌的數(shù)量[19]。乳酸菌數(shù)量較高表明CE對腸道平衡產(chǎn)生有益影響，乳酸菌抑制了大腸桿菌生長，減少大腸桿菌數(shù)量。乳酸菌影響潛在病原微生物的定植并優(yōu)化免疫反應(yīng)[20]。這與課題組以往研究結(jié)果一致，CE提高腸道細(xì)胞因子和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分泌，改善了仔豬腸道免疫[7]。與CON組相比，ANTI組減少大腸桿菌數(shù)量的同時顯著減少了乳酸菌的數(shù)量。這與以往研究結(jié)果一致，ANTI對腸道微生物有損害作用，可能減少有益微生物的數(shù)量[21]。CE對微生物的積極作用可能與CE的活性成分(黃酮、維生素、有機(jī)酸)有關(guān)，這些化合物顯示出抗菌和抗炎活性[22]?？梢?，CE對腸道微生態(tài)的效果優(yōu)于ANTI。CE具有抑制有害腸道菌群和改善斷奶仔豬腸道微生態(tài)系統(tǒng)的潛力，能夠促進(jìn)腸道健康，提高生產(chǎn)性能[9]。

3.2 CE對仔豬盲腸內(nèi)容物游離氨基酸含量的影響

腸道中的游離氨基酸來源于膳食蛋白質(zhì)和內(nèi)源性蛋白質(zhì)的水解以及微生物的合成代謝。微生物與宿主氨基酸代謝的相互作用影響機(jī)體全身代謝?？股啬軠p少動物糞便中的丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸的含量[23-24]。本試驗(yàn)中ANTI組減少盲腸內(nèi)容物中鳥氨酸和脯氨酸含量，即ANTI能夠減少內(nèi)容物中游離氨基酸的含量，與上述研究結(jié)果相似。飼糧添加CE減少了仔豬盲腸內(nèi)容物中游離氨基酸含量，與Zeng等[25]研究結(jié)果一致。Zeng等[25]報道，CE減少高脂小鼠糞便中亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸的含量。CE和ANTI不同程度地減少了盲腸內(nèi)容物游離氨基酸含量，與以前的研究結(jié)果[9]一致(腸胰蛋白酶活力提高)，即二者能提高蛋白質(zhì)(氨基酸)消化吸收，減少到達(dá)盲腸的蛋白質(zhì)(氨基酸)含量。

CE組仔豬血漿蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量的增加伴隨著盲腸內(nèi)容物中蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量的減少[9]，雖然本試驗(yàn)未檢測空腸和回腸內(nèi)容物中的游離氨基酸含量，但可以推測，小腸內(nèi)容物游離氨基酸含量被吸收(減少)，到達(dá)盲腸的游離氨基酸必然減少，這可側(cè)面表明CE可能增加氨基酸的可利用性。另外，短鏈脂肪酸主要由丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和絲氨酸、蛋氨酸發(fā)酵合成[26]。試驗(yàn)中CE組的盲腸內(nèi)容物中蘇氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸含量減少，可能是因?yàn)檫@部分氨基酸被微生物用于合成乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸。另外，CE可能增加了盲腸微生物的蛋白質(zhì)水解和脫羧酶活性[27]，促進(jìn)短鏈脂肪酸和生物胺合成，繼而減少游離氨基酸含量。但CE如何影響微生物的蛋白質(zhì)水解活性和脫羧酶活性尚不清楚，需要進(jìn)行體外試驗(yàn)確定。

3.3 CE對仔豬盲腸內(nèi)容物酚和吲哚類物質(zhì)含量的影響

吲哚和酚類化合物是芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)細(xì)菌發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物[26]，是評估腸道蛋白質(zhì)發(fā)酵程度的標(biāo)志。色氨酸發(fā)酵時會產(chǎn)生吲哚和糞臭素，酪氨酸發(fā)酵產(chǎn)生苯酚和對甲酚[28]。苯酚會降低結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力和跨上皮電阻，并增加Caco-2細(xì)胞對甘露醇的滲透性，破壞腸道屏障功能[28]。在豬的結(jié)腸注射苯酚會引起類似于人類克羅恩病的炎癥反應(yīng)[29]。本試驗(yàn)表明，飼糧添加CE能夠減少盲腸中的苯酚含量，反映了CE對斷奶仔豬的腸道功能的保護(hù)作用。對甲酚可通過抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和呼吸、增加DNA損傷對結(jié)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響[30]。研究認(rèn)為多酚提取物能夠防止對甲酚對Caco-2細(xì)胞的和腸黏膜屏障的損害[31]。但是本研究未發(fā)現(xiàn)CE減少盲腸中對甲酚的含量，這與柑橘黃酮代謝產(chǎn)物有關(guān)。黃酮類化合物通過小腸后作為未吸收和未代謝的黃酮苷或作為膽汁中結(jié)合的未代謝的黃酮類化合物到達(dá)后腸[32]。不清楚黃酮類化合物或其代謝產(chǎn)物與微生物合成代謝酚類物質(zhì)的途徑。

腸道糞臭素與機(jī)體健康狀態(tài)有關(guān)，腸道消化紊亂者的糞便糞臭素水平可高達(dá)80～100 μg/g[33]。本試驗(yàn)中CE組盲腸內(nèi)容物糞臭素含量(10.04 μg/g)遠(yuǎn)低于80 μg/g，且CE組糞臭素含量顯著低于CON組和ANTI組，表明CE緩解了斷奶對仔豬腸道消化功能的降低[34]。糞臭素是色氨酸厭氧代謝的終產(chǎn)物，易揮發(fā)，是最難聞的氣味化合物之一。飼糧添加CE減少了仔豬盲腸內(nèi)容物中糞臭素的含量，減少了臭味，是動物飼料添加劑的良好指標(biāo)。糞臭素能抑制嗜酸乳桿菌的生長和發(fā)酵[13]，這與本試驗(yàn)CE組盲腸內(nèi)容物中低糞臭素含量和高乳酸菌數(shù)量是一致的。腸道糖含量和脫羧酶是糞臭素生成的重要因素[13]。不清楚CE是否改變了腸道糖含量和脫羧酶活性。CE中的黃酮物質(zhì)可能通過直接抑制微生物活動或通過減少細(xì)菌代謝蛋白質(zhì)的可用性來減少糞臭素的形成。微生物可以代謝黃酮類化合物，消除糖苷、葡萄糖醛酸苷和硫酸鹽，產(chǎn)生黃酮苷元，進(jìn)一步代謝成各種環(huán)裂產(chǎn)物，繼而影響微生物的代謝[32]。

3.4 CE對仔豬盲腸內(nèi)容物生物胺含量的影響

生物胺是由腸道微生物對氨基酸脫羧產(chǎn)生的低分子質(zhì)量物質(zhì)，是細(xì)胞生長和增殖所必需的[35]。但是高含量的生物胺會對腸道產(chǎn)生不利影響。腐胺、尸胺、亞精胺和精胺對HT29腸道細(xì)胞顯示出劑量依賴性的細(xì)胞毒作用，會導(dǎo)致細(xì)胞壞死[36]。腐胺、亞精胺和精胺與結(jié)腸癌相關(guān)[37]。因此，CE組盲腸內(nèi)容物中腐胺和精胺含量的減少可以緩解斷奶造成的腸道功能降低，即飼糧添加CE可以維持豬的腸道健康[9]。腐胺是由精氨酸或鳥氨酸合成的[38]，腐胺含量的減少可以用血漿氨基酸含量的變化來解釋。飼喂CE飼糧的仔豬血漿精氨酸含量較高表明該組中精氨酸發(fā)酵減少，腐胺合成減少[9]。與CON組相比，CE組和ANTI組的盲腸內(nèi)容物中鳥氨酸和脯氨酸含量顯著下降，CE組盲腸內(nèi)容物中由鳥氨酸合成的腐胺含量顯著減少，但ANTI組盲腸內(nèi)容物中腐胺含量未減少。這可能是ANTI組血漿精氨酸含量低于CE組造成的[9]。另外，腐胺是精胺和亞精胺的前體。試驗(yàn)中CE組腐胺含量的減少與精胺含量的減少一致。精胺由亞精胺產(chǎn)生[38]，但是本研究中，CE組亞精胺含量與CON組和ANTI組無顯著差異，而精胺含量有減少趨勢。這可能與腸道優(yōu)勢微生物的生物合成途徑有關(guān)，即與精胺和亞精胺產(chǎn)生細(xì)菌以及精胺和亞精胺吸收細(xì)菌數(shù)量的高或低有關(guān)。

酪胺和組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺，酪胺會引起細(xì)胞壞死，組胺會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[39]。CE組和ANTI組盲腸內(nèi)容物中酪胺和組胺含量較低，提示CE和ANTI一定程度上能保護(hù)斷奶仔豬盲腸屏障功能。微生物和宿主的酶活性相互作用將膽堿轉(zhuǎn)化為有毒的甲胺，會降低膽堿的可利用水平[11]。因此，CE組和ANTI組盲腸內(nèi)容物甲胺含量的減少表明盲腸微生物改變了膽堿代謝，也可能是ANTI和CE減少了能夠產(chǎn)生甲胺的微生物數(shù)量。

尸胺、色胺、組胺可以分別由賴氨酸、色氨酸、組氨酸產(chǎn)生[26]。CE組盲腸中合成尸胺的賴氨酸含量顯著低于CON組和ANTI組，但是3組間盲腸內(nèi)容物的尸胺含量無顯著差異。尚不清楚CE中黃酮是否影響賴氨酸發(fā)酵，是否改變腸道細(xì)胞對尸胺的吸收。盲腸內(nèi)容物中色胺和組胺含量與盲腸內(nèi)容物以及血漿中的色氨酸和組氨酸含量一致，均不受飼糧處理的影響。這與微生物氨基酸發(fā)酵的能力和腸道吸收生物胺的能力有關(guān)。

3.5 CE與仔豬腸道蛋白質(zhì)代謝

腸道微生物的主要氮源是膳食蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、內(nèi)源性蛋白質(zhì)和循環(huán)尿素。常規(guī)豬飼糧中15%～25%的蛋白質(zhì)到達(dá)大腸，但這在很大程度上受到飼糧蛋白質(zhì)水平和蛋白質(zhì)消化率的影響[26]。這些微生物同時合成氨基酸和微生物蛋白質(zhì)，產(chǎn)生各種氨基酸代謝產(chǎn)物[40]。CE提高蛋白質(zhì)的吸收利用[9]，使得到達(dá)大腸的蛋白質(zhì)減少，蛋白質(zhì)發(fā)酵減少，游離氨基酸含量減少，導(dǎo)致氨基酸代謝產(chǎn)物減少。本試驗(yàn)中CE組盲腸內(nèi)容物中蛋白質(zhì)(氨基酸)發(fā)酵代謝產(chǎn)物含量的減少，可間接表明蛋白質(zhì)消化利用率的提高。這與前期研究結(jié)果相符，與CON組相比，CE組仔豬日增重提高了9.86%，料重比降低了9.52%[9]。斷奶仔豬消化系統(tǒng)發(fā)育不完善，不能充分消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)，飼糧中補(bǔ)充CE能提高機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收利用，繼而促進(jìn)動物生長發(fā)育。另外，氨基酸發(fā)酵分解的代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是糞便氣味的主要成分。CE減少了腐敗化合物的含量(苯酚、糞臭素、腐胺、精胺、酪胺、甲胺)，這可能減少糞便的臭味，減少臭氣排放，有利于改善豬舍環(huán)境，提高動物福利。

CE的部分黃酮類化合物(如橙皮苷和柚皮苷)在很大程度上能抵抗胃和小腸的酶促分解，能較完整地到達(dá)大腸，在微生物的作用下代謝為酚酸和簡單酚類。CE組盲腸中起作用的可能是橙皮素、柚皮素和酚類代謝產(chǎn)物的混合物[41]。不易被小腸吸收的柑橘黃酮及其代謝產(chǎn)物可作為腸道微生物生長的底物，改變這些化合物的生物利用度和營養(yǎng)特性[42]，也會影響腸道微生物的組成和活性。CE組盲腸內(nèi)容物中蛋白質(zhì)(氨基酸)代謝產(chǎn)物的改變是由柑橘黃酮化合物及其代謝產(chǎn)物以及與腸道微生物相互作用的綜合結(jié)果。CE或其代謝產(chǎn)物如何刺激腸道微生物的代謝，改變微生物組成，繼而改變蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物的合成，這需要進(jìn)行微生物組學(xué)以及代謝組學(xué)分析確定。

4 結(jié) 論

飼糧中添加CE增加了仔豬盲腸內(nèi)容物中乳酸菌數(shù)量，減少了游離氨基酸、苯酚、糞臭素、腐胺、精胺、甲胺的含量以及大腸桿菌數(shù)量。