酵母培養(yǎng)物對初產(chǎn)母豬哺乳期血漿生化指標(biāo)和代謝組的影響

吳 澤 陳 鵬 孟慶維 馬智卓 李建平*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.北京英惠爾生物技術(shù)有限公司，北京 101109)

在豬生產(chǎn)體系中，初產(chǎn)母豬的營養(yǎng)調(diào)控是十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，初產(chǎn)母豬在哺乳期的營養(yǎng)水平和健康狀態(tài)對母豬的繁殖性能、利用年限及其后代的生長性能有很深遠(yuǎn)的影響[1-2]。如果初產(chǎn)母豬哺乳期的營養(yǎng)攝入不能滿足其營養(yǎng)需求，初產(chǎn)母豬則會在哺乳期間分解身體儲存以補(bǔ)充其營養(yǎng)消耗，而身體儲存損失會導(dǎo)致母豬下次受孕時(shí)卵泡營養(yǎng)不良和黃體發(fā)育受阻，從而降低胚胎存活率[3]。因此，初產(chǎn)母豬在哺乳期間的代謝水平將影響其未來的健康和繁殖性能。

母豬機(jī)體代謝是一個(gè)復(fù)雜的過程，除了需要體內(nèi)多個(gè)器官協(xié)同發(fā)揮作用，體內(nèi)的糖、脂類和蛋白質(zhì)也相互影響，并在動物體內(nèi)分解成小分子物質(zhì)共同維持機(jī)體正常的生命活動[4]。母豬分娩后由于泌乳需要、機(jī)體生理變化和應(yīng)激反應(yīng)容易發(fā)生能量負(fù)平衡[5]。因此，調(diào)節(jié)哺乳母豬能量代謝平衡對母豬健康水平至關(guān)重要。酵母培養(yǎng)物(yeast culture,YC)是一種在特定的溫度條件下以酵母為原料的干發(fā)酵產(chǎn)品，它是在未經(jīng)修飾的釀酒酵母菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生的[6]。YC已廣泛應(yīng)用于調(diào)控豬的營養(yǎng)與健康，在促進(jìn)家畜的健康和生產(chǎn)性能方面是較理想的抗生素替代品[7]。研究顯示，YC可以降低母豬哺乳期血漿中尿素氮和膽固醇的含量，減少脂類分解，提高氮的利用率，表明YC有改善哺乳母豬代謝平衡的作用[8]。但目前關(guān)于YC對初產(chǎn)母豬哺乳期標(biāo)志代謝物及其參與代謝通路的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)利用代謝組學(xué)手段，通過有監(jiān)督的主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)等方法，篩選、鑒定初產(chǎn)母豬哺乳期血漿中受到Y(jié)C影響的代謝物及其代謝途徑，以期為更深入了解YC調(diào)節(jié)初產(chǎn)母豬哺乳期代謝的主要標(biāo)志代謝物變化和生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用YC粗蛋白質(zhì)含量≥15%、甘露聚糖含量≥1%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用健康的初產(chǎn)母豬(長白)60頭，隨機(jī)分為2組，每組30個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加YC(妊娠期添加0.5%，哺乳期添加0.8%)。飼養(yǎng)試驗(yàn)從母豬妊娠第30天開始至分娩后第28天(仔豬斷奶)結(jié)束，試驗(yàn)在黑龍江省巴彥縣大東北牧業(yè)集團(tuán)進(jìn)行。母豬妊娠第30～109天飼喂妊娠期飼糧，從妊娠第110天開始至試驗(yàn)結(jié)束飼喂哺乳期飼糧?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)母豬營養(yǎng)需要量進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)?zāi)肛i在妊娠第30～109天在妊娠舍飼養(yǎng)，每天08：00和14：00各飼喂1次妊娠期飼糧。妊娠第110天，母豬被轉(zhuǎn)移至哺乳舍待產(chǎn)并開始飼喂哺乳期飼糧。分娩后，母豬每天飼喂4次(05：00、10：00、16：00、20：00)哺乳期飼糧，飼喂初始量為每日1 kg，以后每天增加1 kg直至達(dá)到母豬最大采食量后自由采食。妊娠期和哺乳期母豬均在限位欄飼養(yǎng)且不限飲水。妊娠舍溫度保持在18～20 ℃，哺乳舍溫度保持在20～23 ℃。試驗(yàn)期間保持舍內(nèi)通風(fēng)、干燥，消毒和防疫嚴(yán)格按照豬場防疫措施和飼養(yǎng)管理制度進(jìn)行。

1.4 樣品采集

母豬分娩后第28天(仔豬斷奶)，采集耳緣靜脈血10 mL于抗凝的采血管中，3 000 r/min離心15 min后收集上層血漿，置于1.5 mL EP管中，液氮速凍，-80 ℃保存待測。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 血漿生化指標(biāo)

采用全自動生化分析儀(DS-161V，英諾華公司)檢測母豬血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性以及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量。

1.5.2 血漿代謝組學(xué)分析

血漿樣本在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，體積比)，渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，14 000×g4 ℃離心20 min，取上清真空干燥，質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1，體積比)復(fù)溶，渦旋，14 000×g4 ℃離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)入自動進(jìn)樣瓶。采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)HILIC色譜柱進(jìn)行分離；為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊(duì)列中插入QC樣品(取等量制備好的試驗(yàn)樣本混合而成)，用于監(jiān)測和評價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)的可靠性。采用AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀進(jìn)行樣本一級、二級譜圖的采集。采用XCMS軟件進(jìn)行峰對齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。對XCMS提取得到的數(shù)據(jù)首先進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評價(jià)，最后再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用有監(jiān)督的PLS-DA方法對樣品進(jìn)行模式識別分析。潛在標(biāo)志物根據(jù)變量投影重要度(VIP)、置信區(qū)間得分圖(scoring plot)和載荷圖(loading plot)進(jìn)行篩選，用SPSS 25.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)分析，再根據(jù)VIP和統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行判別分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

血漿生化指標(biāo)等數(shù)據(jù)用Excel 2 010進(jìn)行初步處理后再采用SPSS 25.0軟件通過獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)方法分析組間差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加YC對初產(chǎn)母豬哺乳期血漿生化指標(biāo)的影響

由表2可知，與對照組相比，飼糧中添加YC顯著降低了母豬血漿中葡萄糖、尿素氮、總膽固醇和低密度脂蛋白的含量(P<0.05)，對其他血漿生化指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧中添加YC對初產(chǎn)母豬哺乳期血漿生化指標(biāo)的影響

2.2 飼糧中添加YC對初產(chǎn)母豬哺乳期血漿代謝組的影響

血漿代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，正離子模式下在母豬血漿中檢測到142種可鑒定出的代謝物，負(fù)離子模式下共鑒定出141種代謝物。

2.2.1 總體樣本PCA

將所有樣本和QC樣本提取得到的峰進(jìn)行PCA，如圖1-a和圖1-b所示。結(jié)果顯示，正、負(fù)離子模式下QC樣本緊密聚集在一起，說明本次研究使用的儀器穩(wěn)定，重復(fù)性好。

圖中t[1]代表主成分1，t[2]代表主成分2，橢圓代表95%置信區(qū)間。同一顏色的點(diǎn)表示組內(nèi)的各個(gè)生物學(xué)重復(fù)，點(diǎn)的分布狀態(tài)反映出的是組間、組內(nèi)的差異度。圖2同。

2.2.2 PLS-DA

使用PLS-DA模式分析對照組與試驗(yàn)組之間代謝物的差異(圖2)，結(jié)果顯示，2組代謝物的分離度好，進(jìn)行7次循環(huán)交互驗(yàn)證得到模型評價(jià)參數(shù)在正離子模式下模型對Y變量解釋率R2Y為0.995，模型預(yù)測能力Q2為0.467；在負(fù)離子模式下R2Y為0.992，Q2為0.430，表明該模式下得到的差異代謝物準(zhǔn)確、可靠。

圖2 初產(chǎn)母豬血漿代謝物偏最小二乘法判別分析

2.2.3 顯著差異代謝物篩選

本試驗(yàn)以O(shè)PLS-DA VIP>1和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異代謝物(如表3所示)。YC顯著提高了初產(chǎn)母豬血漿中十六烷二酸、肌酸、苯乳酸、D-脯氨酸、L-亮氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-鳥氨酸的含量(P<0.05)，顯著降低了1-甲基煙酰胺和膽固醇的含量(P<0.05)。

表3 母豬血漿差異代謝物及其主要參與的代謝通路

3 討 論

3.1 飼糧中添加YC對初產(chǎn)母豬哺乳期血漿生化指標(biāo)的影響

動物血漿生化指標(biāo)可以在一定程度上反映動物的生理代謝和營養(yǎng)水平。尿素氮是蛋白質(zhì)和氨基酸的最終代謝產(chǎn)物，其含量與動物體內(nèi)蛋白質(zhì)或氨基酸利用率呈負(fù)相關(guān)，可以準(zhǔn)確地表明動物體內(nèi)氨基酸和蛋白質(zhì)之間的代謝平衡[9]。本試驗(yàn)中，YC顯著降低了初產(chǎn)母豬血漿中尿素氮的含量，這與曹迪[8]用YC在母豬上進(jìn)行的研究結(jié)果一致。因此，我們推測YC可能參與調(diào)控了初產(chǎn)母豬哺乳期蛋白質(zhì)的合成，提高了氨基酸的利用率。

動物機(jī)體血漿中葡萄糖含量一般處于一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)，其升高或降低可以反映機(jī)體代謝能力的增強(qiáng)或減弱[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組初產(chǎn)母豬血漿中葡萄糖的含量顯著降低，表明飼糧中添加YC可以減少初產(chǎn)母豬哺乳期機(jī)體新陳代謝，為調(diào)節(jié)哺乳母豬能量平衡發(fā)揮重要作用。

研究表明，初產(chǎn)母豬哺乳期脂肪動員會導(dǎo)致下次受孕時(shí)卵泡營養(yǎng)不良和黃體發(fā)育受阻，降低胚胎存活率，減少母豬利用年限[11]。母豬脂肪代謝過程十分復(fù)雜，受到體內(nèi)多個(gè)器官和酶的共同調(diào)節(jié)，而總膽固醇含量是反映動物體內(nèi)脂類代謝的重要指標(biāo)。據(jù)報(bào)道，總膽固醇含量與脂質(zhì)沉積呈正相關(guān)[12]。低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量可以反映動物體內(nèi)總膽固醇的代謝水平，通過低密度脂蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)肝臟合成的內(nèi)源膽固醇，高密度脂蛋白可以將外周組織中的膽固醇運(yùn)送到肝臟中進(jìn)行代謝，產(chǎn)生膽汁酸排出體外，從而減少肝外組織細(xì)胞中游離膽固醇的沉積[8,13]。本試驗(yàn)中，YC顯著降低了初產(chǎn)母豬血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白含量，表明YC可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)低密度脂蛋白含量，改善肝臟內(nèi)源膽固醇合成，進(jìn)而改善母豬哺乳期脂類代謝過程，減少體脂動員，提高利用年限。

3.2 飼糧中添加YC對初產(chǎn)母豬哺乳期血漿代謝組的影響

研究表明，初產(chǎn)母豬在哺乳期對營養(yǎng)物質(zhì)的需求會不斷增加，由于需要通過泌乳維持后代生長，因此容易出現(xiàn)能量負(fù)平衡，影響自身健康與繁殖性能[14-15]。而脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)都需要在體內(nèi)代謝成小分子物質(zhì)才能發(fā)揮其生理功能，提供動物生命活動所需要的能量[16-17]。因此，本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)對初產(chǎn)母豬血漿中的小分子代謝物進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果共檢測出12種標(biāo)志性差異代謝物，揭示了YC調(diào)控初產(chǎn)母豬哺乳期代謝變化過程。

動物活動靠機(jī)體內(nèi)的三磷酸腺苷(ATP)提供能量。煙酰胺是維生素B3的酰胺形式，也是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前體，NAD+是氧化還原反應(yīng)中ATP生產(chǎn)的重要輔酶，可通過無氧糖酵解和線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP提供能量[18-19]。肌酸在生物體內(nèi)由精氨酸、蛋氨酸和甘氨酸合成，作為細(xì)胞質(zhì)中的高能磷酸儲備，肌酸可以快速有效地為機(jī)體提供能量[20-22]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加YC顯著增加了初產(chǎn)母豬血漿中煙酰胺和肌酸的含量，通過合成ATP為機(jī)體提供能量，為維持能量穩(wěn)定提供保障[22]。

蛋白質(zhì)代謝的最終途徑是三羧酸循環(huán)，完全氧化并釋放能量用于生產(chǎn)。本試驗(yàn)中，飼糧中添加YC顯著提高了初產(chǎn)母豬血漿中L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸和D-脯氨酸、苯乳酸的含量。L-亮氨酸分解代謝的終產(chǎn)物是乙酰乙酸和乙酰輔酶A，可進(jìn)入三羧酸循環(huán)合成酮，是肌肉骨骼段能量代謝的重要底物[23]。L-苯丙氨酸、苯乳酸、L-色氨酸的最終產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)生成酮和糖原，脯氨酸可以直接轉(zhuǎn)化為丙酮酸作為外周組織的能量來源，保證能量穩(wěn)態(tài)[24-26]。此外，L-亮氨酸的含量又與低密度脂蛋白和總膽固醇的含量呈負(fù)相關(guān)，本試驗(yàn)中，飼糧中添加YC降低了母豬血漿中低密度脂蛋白和總膽固醇的含量，減少了母豬體內(nèi)脂肪分解[27-28]。鳥氨酸和脯氨酸是精氨酸的代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是胎盤和胎液合成多胺的主要前體物[29-30]，可促進(jìn)卵巢固醇類物質(zhì)生成，對提高動物繁殖性能具有重要作用[31]。此外，鳥氨酸的積累也可促進(jìn)鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)δ’-吡咯-5-羧酸(P5C)從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)并被P5C受體還原為脯氨酸[32]。P5C可激活紅細(xì)胞衍生核因子2(Nrf2)以及相關(guān)脂肪氧化基因，促進(jìn)脂肪動員[33]。因此P5C可以視作一個(gè)連接氨基酸代謝和脂肪代謝的重要橋梁。我們推測YC加速了母豬體內(nèi)精氨酸代謝，進(jìn)而提高鳥氨酸和脯氨酸的含量并加速了P5C向脯氨酸的還原，提高母豬繁殖性能并減少哺乳期脂肪動員。這可能是本試驗(yàn)中試驗(yàn)組初產(chǎn)母豬血漿中十六烷二酸含量升高的原因。而降低初產(chǎn)母豬哺乳期脂肪動員或脂類分解，可以促進(jìn)卵泡發(fā)育并提高母豬繁殖性能[34]。因此，試驗(yàn)組血漿中升高的L-亮氨酸、肌酸和D-脯氨酸可能參與了抑制初產(chǎn)母豬部分脂肪分解，并改善了繁殖性能。

4 結(jié) 論

飼糧中添加YC可以引起初產(chǎn)母豬哺乳期血漿小分子代謝物含量發(fā)生顯著變化，這些代謝物主要參與亮氨酸、脯氨酸等氨基酸代謝通路和脂肪酸代謝通路，其中，L-亮氨酸、D-脯氨酸、肌酸可能是YC參與調(diào)控初產(chǎn)母豬哺乳期代謝的重要生物標(biāo)志物。