低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料對育肥豬脂肪沉積和腸道微生物組成的影響

段格艷 宋 博* 陳曉安 鄭昌炳 鄭 界 張仕宇 郭秋平 李鳳娜 段葉輝** 印遇龍**

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125；2.中國科學院大學，北京 100039；3.湖南粒豐生物科技有限公司，長沙 410125)

在肉類工業(yè)中，畜禽脂肪含量與生產(chǎn)效率和肉品質(zhì)密切相關(guān)[1]。人類攝取脂肪含量高的肉制品將增加患糖尿病和脂肪肝等慢性疾病的風險[2]，因此，減少畜禽脂肪沉積已成為動物營養(yǎng)學研究重點和熱點。研究表明，高蛋白質(zhì)膳食可有效降低機體脂肪沉積[3-4]，而其代價是損害骨骼健康和腎功能以及降低氮利用效率[5-6]。在畜牧生產(chǎn)中，降低飼糧蛋白質(zhì)水平可減少飼料成本和氨排放，并提高氮利用效率[7-8]，因而低蛋白質(zhì)飼糧被廣泛關(guān)注[9-10]。然而，與高蛋白質(zhì)飼糧相反，低蛋白質(zhì)飼糧有促進脂肪沉積的趨勢[6]。為了減輕由低蛋白質(zhì)飼糧引起的脂肪沉積，人們在蛋白質(zhì)限制膳食中添加功能性氨基酸(如精氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸)方面進行了廣泛的探索[11]。近年來，除功能性氨基酸外，植物飼料資源(如雜交構(gòu)樹)也因其粗蛋白質(zhì)含量高(18%～22%)和營養(yǎng)均衡而引起了人們極大的興趣[12-13]。雜交構(gòu)樹含有40多種具有抗菌、抗氧化和抗炎功能的多酚和黃酮類物質(zhì)[14]，且可抑制脂肪酶活性、增加能量消耗和減少體重增加，表明其具有抗脂肪沉積潛力[15]。然而，低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料對機體脂肪沉積的影響及調(diào)控機制尚不清楚。據(jù)報道，腸道微生物可調(diào)控機體脂肪代謝[16]。具體來說，腸道微生物可分解膳食纖維以產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)[17]，SCFAs可作為宿主和信號分子的能量來源，從而將腸道微生物的代謝活動與宿主體內(nèi)的能量穩(wěn)態(tài)聯(lián)系起來[18]。此外，膳食蛋白質(zhì)水平會影響腸道微生物組成[19]，且低蛋白質(zhì)膳食(蛋白質(zhì)水平降低不超過3%)比高蛋白質(zhì)膳食更有效[20-21]?；诖?，本試驗擬對低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料對育肥豬脂肪重量、脂肪代謝和腸道微生物組成的影響進行研究，以期為構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料在育肥豬生產(chǎn)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選擇初始體重[(63.53±0.40)kg]相近的健康三元雜交(杜洛克×長白×大白)閹公豬18頭，隨機分為3組(每組6頭豬)：正常蛋白質(zhì)飼糧組(A組，作為對照組，飼糧粗蛋白質(zhì)含量為16%)、低蛋白質(zhì)飼糧組(B組，飼糧粗蛋白質(zhì)含量為13%)和構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料組(C組，飼糧含10%構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料，飼糧粗蛋白質(zhì)含量為13%)。試驗期45 d。構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料由湘潭某構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司提供，其發(fā)酵工藝以及主要營養(yǎng)成分含量見張興等[22]的報道。各組飼糧組成及營養(yǎng)水平見本課題組前期研究[23]。

1.2 飼養(yǎng)管理與樣品采集

試驗期間，所有豬只在漏糞地板式豬床上單欄飼養(yǎng)，自由飲水，自由采食，每天飼喂3次。試驗結(jié)束時，禁食12 h，頸靜脈采血后將所有豬只屠宰，稱取體脂重量并記錄，采集背脂和結(jié)腸食糜。

1.3 指標測定

1.3.1 血清生化指標

血液樣品于4 ℃、3 500 r/min條件下離心10 min以獲得血清，接著使用CX-4全自動生化分析儀(Beckman，美國)和相應試劑盒(北京利德曼生物科技有限公司)檢測血清中高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)和膽固醇(cholesterol，CHOL)濃度。

1.3.2 背脂中脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達量

參照鄭昌炳等[24]的方法，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，檢測背脂中脂質(zhì)攝取相關(guān)基因[脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1(fatty acid transport protein 1，F(xiàn)ATP1)、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36)、脂肪生成相關(guān)基因[乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)]、脂肪分解相關(guān)基因[激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1B(carnitine palmitoyl transferase 1B，CPT1B)]、脂質(zhì)代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)]的mRNA表達量[25]，實時熒光定量PCR引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3.3 結(jié)腸中SCFAs濃度

參照前人研究方法[24]，稱取0.5～0.6 g冷凍干燥后的結(jié)腸食糜，使用Agilent 6890氣相色譜儀(Agilent Technologies公司,美國)進行結(jié)腸SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸)濃度測定。

1.3.4 腸道微生物組成

取適量結(jié)腸食糜，參照前人研究方法[16,26]，采用16S DNA測序分析微生物組成。DNA樣品到最終數(shù)據(jù)獲得包括樣品檢測、PCR、純化、建庫、測序、數(shù)據(jù)分析等，均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。Alpha多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson、Chao1和ACE指數(shù))用于分析腸道微生物群落的多樣性和豐富度。

1.3.5 結(jié)腸中生物胺濃度

將約1 g冷凍干燥后的結(jié)腸食糜與8 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液混合，然后在-20 ℃下儲存過夜。將混合物以8 000 r/min離心10 min(2次)，得到上清液。將1 mL上清液與1 mL NaOH/NaHCO3緩沖液(pH=10.6)和1 mL溶于丙酮的丹磺酰氯(10 mg/mL)混合。將混合物在40 ℃避光水浴30 min，每5 min適度搖晃1次。在混合物冷卻之前，將1 mL 5%氫氧化銨加入混合物中并渦旋混合。待混合物完全冷卻后，加入1 mL無水醚提取生物胺，包括腐胺、尸胺、亞精胺和精胺。10 min后，移取無水乙醚層以3 000 r/min離心濃縮。然后，將沉淀物溶解在1 mL甲醇中并通過0.22 μm聚砜膜過濾。最后用Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent Technologies公司,美國)檢測生物胺濃度。

1.3.6 結(jié)腸中吲哚和糞臭素濃度

稱取約0.4 g冷凍干燥后的結(jié)腸食糜，加入10 mL甲醇，混合均勻。將混合物在30 ℃水浴10 min，在-20 ℃下靜置10 min后將混合物以8 000 r/min離心10 min，得到上清液。上清液用0.22 μm濾膜進行過濾后，使用Agilent 1290高效液相色譜儀(Agilent Technologies公司，美國)進行結(jié)腸食糜吲哚和糞臭素濃度測定。

色譜參數(shù)如下：柱子為zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm，內(nèi)徑5 μm)；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；流動相為60%甲醇水溶液。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019進行初步處理，然后用SAS 8.2軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較檢驗。使用SPSS 18.0軟件進行體脂重量和結(jié)腸SCFAs濃度之間的相關(guān)性分析。所有試驗數(shù)據(jù)均以平均值和均值標準誤(SEM)表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 體脂重量和血清生化指標

如表2所示，與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧使育肥豬的體脂重量顯著增加(+20.69%，P<0.05)，而在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料則使育肥豬的體脂重量恢復到與對照組相似的水平(P>0.05)。與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧顯著增加了育肥豬血清CHOL濃度(+16.80%，P<0.05)。與低蛋白質(zhì)飼糧相比，在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料顯著降低了育肥豬血清CHOL濃度(-7.60%，P<0.05)。與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧以及在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料均顯著增加了育肥豬血清HDL濃度(分別增加27.40%和28.77%，P<0.05)，但低蛋白質(zhì)飼糧組和構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料組之間沒有顯著差異(P>0.05)。不同飼糧處理對育肥豬血清TG和LDL濃度無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼喂不同飼糧育肥豬的體脂重量和血清生化指標

2.2 背脂中脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達量

如圖1所示，與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧趨向于上調(diào)背脂中ACC的mRNA表達量，顯著上調(diào)了背脂中SREBP-1c的mRNA表達量(P<0.05)，并顯著下調(diào)了背脂中CPT-1B的mRNA表達量(P<0.05)；與低蛋白質(zhì)飼糧相比，在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料顯著下調(diào)了背脂中ACC的mRNA表達量(P<0.05)，趨向于下調(diào)背脂中SREBP-1c的mRNA表達量(P>0.05)。背脂中HSL、FAT/CD36、FATP1、C/EBPα和PPARγ的mRNA表達量不受飼糧處理的顯著影響(P>0.05)。

A：A組 group A；B:B組 group B；C：C組 group C。下圖同 the same as below。

2.3 結(jié)腸中SCFAs濃度

育肥豬結(jié)腸中SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸)濃度如圖2所示。與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧顯著降低了育肥豬結(jié)腸中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度(P<0.05)，而在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料則有增加結(jié)腸中乙酸和丙酸濃度的趨勢(P>0.05)。不同飼糧處理對結(jié)腸中異丁酸和異戊酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。此外，體脂重量與結(jié)腸中乙酸、丙酸和丁酸濃度呈顯著負相關(guān)(P<0.05，表3)。

圖2 飼喂不同飼糧育肥豬結(jié)腸中SCFAs濃度的影響

表3 體脂重量與結(jié)腸中SCFAs濃度相關(guān)性分析

2.4 腸道微生物組成

飼糧處理對育肥豬腸道微生物多樣性的影響見圖3。與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧具有降低Shannon和ACE指數(shù)的趨勢，但是差異不顯著(P>0.05，圖3-A)；與低蛋白質(zhì)飼糧相比，在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料顯著提高了Shannon和ACE指數(shù)(P<0.05，圖3-A)。不同飼糧處理對Simpson和Chao1指數(shù)沒有顯著影響(P>0.05，圖3-A)。此外，對照組和構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料組之間具有截然不同的菌群結(jié)構(gòu)，而低蛋白質(zhì)飼糧組的菌群結(jié)構(gòu)與對照組相似(圖3-B)。如圖3-C所示，各組育肥豬結(jié)腸中優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。在門水平上(圖-3D)，與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧具有增加厚壁菌門相對豐度的趨勢(P>0.05)，顯著增加了放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度(P<0.05)，并顯著降低了擬桿菌門和柔膜菌門(Tenericutes)的相對豐度(P<0.05)；與低蛋白質(zhì)飼糧相比，在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料顯著降低了厚壁菌門和放線菌門的相對豐度(P<0.05)，并顯著增加了擬桿菌門和變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度(P<0.05)。

圖3 飼喂不同飼糧育肥豬的腸道微生物組成

2.5 結(jié)腸中生物胺、吲哚和糞臭素濃度

如圖4所示，不同飼糧處理對結(jié)腸中腐胺、亞精胺、精胺和吲哚濃度無顯著影響(P>0.05)。與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料顯著降低了結(jié)腸中尸胺和糞臭素濃度(P<0.05)。

圖4 飼喂不同飼糧育肥豬結(jié)腸中生物胺、吲哚和糞臭素濃度

3 討 論

構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分豐富，然而目前有關(guān)其對育肥豬脂肪代謝調(diào)控的研究較少。本試驗發(fā)現(xiàn)，低蛋白質(zhì)飼糧可顯著提高育肥豬體脂重量和血清CHOL濃度，而在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料可逆轉(zhuǎn)低蛋白質(zhì)飼糧引起的體脂重量和血清CHOL濃度，提示構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料可抑制低蛋白質(zhì)飼糧引起的脂肪沉積。為進一步探究構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料的作用機制，我們首先檢測了背脂中與脂肪合成及分解相關(guān)基因的mRNA表達量，結(jié)果顯示，構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料對脂肪分解(HSL和CPT-1B)和脂質(zhì)攝取相關(guān)基因(FAT/CD36和FATP1)mRNA表達量的影響不顯著，但顯著降低了脂肪合成相關(guān)基因(ACC)的mRNA表達量。Lee等[27]研究表明，雜交構(gòu)樹的根皮提取物可通過激活磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信號通路來抑制肝臟和脂肪組織中脂肪合成，與本試驗研究結(jié)果類似。因此，我們推測低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料后育肥豬體脂重量降低的原因可能與構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料抑制機體脂肪合成有關(guān)。

機體表型與腸道微生物組成息息相關(guān)[16,28]。厚壁菌門和擬桿菌門是育肥豬結(jié)腸食糜中主要的2個細菌門類[29]。在豬上的研究表明，機體脂肪沉積狀況顯著影響豬的腸道微生物組成，體現(xiàn)為脂肪型豬種腸道微生物多樣性較低，厚壁菌門的相對豐度較高，擬桿菌門的相對豐度較低[30-31]。在人和小鼠上的研究同樣發(fā)現(xiàn)脂肪沉積的增加顯著影響了腸道菌群結(jié)構(gòu)[16,32]。另外，營養(yǎng)素，如蛋白質(zhì)，作為飼糧中最主要的營養(yǎng)成分之一，可改善機體代謝與健康可能源于其對腸道微生物的調(diào)節(jié)。Lubbs等[33]研究表明，低蛋白質(zhì)飼糧可降低仔豬糞便中梭菌屬和大腸桿菌的數(shù)量，從而改善腸道功能，促進腸道健康。本試驗發(fā)現(xiàn)，育肥豬結(jié)腸中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和擬桿菌門，與上述結(jié)果一致。低蛋白質(zhì)飼糧增加了育肥豬腸道中厚壁菌門的相對豐度并降低了擬桿菌門的相對豐度，這與前面得出的低蛋白質(zhì)飼糧增加育肥豬體脂重量和血清CHOL含量的結(jié)果相呼應。在大鼠上的研究表明，擬桿菌門的相對豐度與體脂重量呈負相關(guān)[34]。擬桿菌門的主要代謝產(chǎn)物是乙酸和丙酸[35-37]，這2種SCFAs濃度與脂肪沉積亦呈負相關(guān)[16,28]。據(jù)此推測，采食低蛋白質(zhì)飼糧的育肥豬脂肪沉積增加，促使機體腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，擬桿菌門相對豐度降低，乙酸和丙酸濃度減少。

有趣的是，在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料顯著增加了結(jié)腸中擬桿菌門的相對豐度，并有提高乙酸和丙酸濃度的趨勢，這與前面提到的構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料抑制脂肪沉積的結(jié)果相呼應，提示在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料有利于降低體脂沉積，從而改善育肥豬結(jié)腸微生物組成與功能，提高有益菌的相對豐度，并可提高結(jié)腸中乙酸和丙酸濃度。與本研究結(jié)果相似，前人研究亦發(fā)現(xiàn)飼喂復合菌發(fā)酵飼料可顯著改善生長育肥豬結(jié)腸微生物結(jié)構(gòu)和SCFAs組成[29]。研究表明，生物飼料對動物后腸微生物結(jié)構(gòu)的改善可直接影響后腸微生物的發(fā)酵方式，進而影響糞便中的惡臭化合物(如吲哚、糞臭素)組成[38-39]。糞臭素是色氨酸發(fā)酵的產(chǎn)物，會受到腸道微生物群變化的影響[40]。糞臭素是公豬肉中異味的來源，會影響肉的風味[41]。本試驗發(fā)現(xiàn)，與正常蛋白質(zhì)飼糧相比，低蛋白質(zhì)飼糧有降低結(jié)腸中糞臭素的趨勢，而在低蛋白質(zhì)飼糧中添加構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料則可顯著降低育肥豬結(jié)腸中糞臭素的濃度。前人研究亦表明，低蛋白質(zhì)飼糧可降低腸道內(nèi)容物或糞便中糞臭素的濃度[42-44]。因此，我們推測雜交構(gòu)樹經(jīng)生物發(fā)酵后可顯著增強低蛋白質(zhì)飼糧降低糞臭素的能力。

4 結(jié) 論

在低蛋白質(zhì)飼糧中添加10%構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料可抑制育肥豬背脂合成，降低體脂重量和血清CHOL含量，改善腸道微生物組成。