乳中短鏈脂肪酸組成、生理功能及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

武旭芳 張養(yǎng)東 鄭 楠 王加啟

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

乳及乳制品是居民膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。乳是一種水包油的乳狀液，其中的脂類以乳脂肪球的形式存在，98%的乳脂肪球核是以1個(gè)碳骨架和3個(gè)脂肪酸分子組成的非極性脂質(zhì)甘油三酯的形式存在[1]。乳脂中脂肪酸的組成與其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和理化性質(zhì)密切相關(guān)[2]。據(jù)報(bào)道，乳脂約有大于400種脂肪酸組成[3]，其中短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)不足3%。SCFAs是一組碳原子數(shù)在2～6之間的有機(jī)酸，通常包括直鏈的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸，以及支鏈的異丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸、2-甲基戊酸、3-甲基戊酸等[4-6](表1)。乳脂中SCFAs研究較多的是丁酸和己酸。本文就乳中SCFAs的來(lái)源、分布、組成、生理功能及檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步檢測(cè)乳中短鏈脂肪存在及應(yīng)用提供科學(xué)參考。

表1 10種短鏈脂肪酸CAS號(hào)[7]及化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 SCFAs的來(lái)源、組成

H4F：四氫葉酸 tetrahydrofolic acid；CoFeSP：鈷鐵硫蛋白 cobalt iron sulfur protein：CO：一氧化碳 carbon monoxide；CO2：二氧化碳 carbon dioxide；H2：氫氣 hydrogen；H2O：水 water。

SCFAs在乳中主要以酯化形式存在于甘油三酯Sn-1和Sn-3位，部分以游離態(tài)形式存在。SCFAs在乳脂中含量較低，動(dòng)物乳中含量略高于人乳。目前文獻(xiàn)對(duì)乳中SCFAs的研究主要集中于人乳和動(dòng)物乳中丁酸和己酸2種含量較高的SCFAs。其中，丁酸和己酸在人乳中含量分別為0.06%～0.60%、0.07%～0.43%[16-17]，驢乳中含量分別為0.03%～0.05%、0.20%～0.27%[18]，水牛乳中含量分別為1.62%～3.80%、2.09%～2.31%[19]，牛乳中含量分別為1.23%～3.45%、1.75%～2.15%[19-20]，牦牛乳中含量分別為2.05%～3.19%、2.20%～3.42%[20-21]，駱駝乳中含量分別為0.04%～0.06%、0.11%～0.17%[22]，山羊乳中含量分別為0.93%～2.09%、2.51%～3.64%[20,23]。由于現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的局限，極少數(shù)研究對(duì)乳中乙酸、丙酸、戊酸和支鏈SCFAs含量進(jìn)行了檢測(cè)。Stinson等[9]對(duì)不同國(guó)家(美國(guó)、澳大利亞、日本、南非、挪威)母乳中SCFAs含量的研究發(fā)現(xiàn)，母乳中SCFAs含量與地域有關(guān)，不同國(guó)家母乳中乙酸、丁酸含量分別為20.4～651.7 μmol/L、32.4～232.1 μmol/L，丙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸均未在人乳中檢測(cè)到。Jiang等[24]測(cè)定4種不同類型乳(母乳、嬰幼兒配方奶粉、純牛奶乳、發(fā)酵乳)SCFAs的組成并建立指紋圖譜，研究發(fā)現(xiàn)不同類型乳中乙酸含量較高，為總SCFAs的17.54%～53.36%，丁酸和己酸含量較乙酸低，而丙酸含量極低甚至沒(méi)有。

2 SCFAs的功能

近年來(lái)，SCFAs越來(lái)越受到人們的關(guān)注，尤其在生理功能和生理疾病方面取得了廣泛的研究，盡管乳中SCFAs功能的研究仍相對(duì)較少。

2.1 生理功能

SCFAs是動(dòng)物機(jī)體重要的能量來(lái)源，乙酸、丙酸、丁酸是機(jī)體重要的供能物質(zhì)[25]，參與宿主能量代謝(脂質(zhì)、糖類、膽固醇)的調(diào)節(jié)。SCFAs在被結(jié)腸細(xì)胞吸收之后，會(huì)進(jìn)入線粒體的三羧酸循環(huán)中，為細(xì)胞產(chǎn)生ATP和能量，同時(shí)促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體水、鈉吸收，維持動(dòng)物機(jī)體的電解質(zhì)平衡[26]。此外，SCFAs充當(dāng)各種組織中的底物或信號(hào)分子，乙酸、丙酸和丁酸被認(rèn)為是腸道微生物和宿主細(xì)胞之間傳遞信息的紐帶，起到調(diào)節(jié)宿主代謝和免疫功能的作用，是微生物群-腸-腦軸中重要的功能性和生命性成分[27-29]，與老年人的認(rèn)知評(píng)分、長(zhǎng)期記憶等有關(guān)。SCFAs可以通過(guò)血腦屏障起到保護(hù)作用。丁酸能夠通過(guò)激活一磷酸腺苷(AMP)激活蛋白激酶的表達(dá)，來(lái)改變緊密連接蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到增強(qiáng)腸道屏障功能、降低腸道炎癥的效果，以此保持腸道的完整性[12]。乳中SCFAs提供了許多乳制品特有的風(fēng)味和氣味，特別是發(fā)酵乳制品和乳酪的風(fēng)味[30]。游離態(tài)SCFAs，特別是丁酸，也是牛乳和其他乳制品酸敗的原因[1]。

2.2 生理疾病

SCFAs在維持健康穩(wěn)態(tài)和各種病理?xiàng)l件的發(fā)展都具有重要意義。SCFAs在代謝性疾病、炎癥反應(yīng)、心腦血管疾病方面的作用被逐一揭示。SCFAs表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，包括抗炎、抑菌以及抑制結(jié)腸炎癥和癌類細(xì)胞系的生長(zhǎng)[31-32]；丁酸在維持腸道上皮健康方面具有積極作用，包括對(duì)腸道黏膜的保護(hù)作用，提高腸道健康和免疫力[31,33]。SCFAs還與許多代謝疾病相關(guān)，如嬰幼兒肥胖、高血脂、糖尿病、心腦血管疾病[10,34]等。SCFAs參與各種體內(nèi)代謝通路，包括微生物群-腸-腦軸、腸道菌群-SCFAs-免疫軸等，被證實(shí)與抑郁癥、自閉癥、帕金森癥、精神分裂癥、阿爾茲海默癥等一系列精神疾病相關(guān)聯(lián)。乳中SCFAs在生理疾病方面也表現(xiàn)出積極的作用，研究表明嬰幼兒早期從母乳攝入的SCFAs可以降低特應(yīng)性疾病(食物過(guò)敏、哮喘、特應(yīng)性鼻炎等)或肥胖的風(fēng)險(xiǎn)[9]，母乳與早產(chǎn)兒定殖的腸道細(xì)菌相互作用產(chǎn)生SCFAs，如乙酸、丙酸、丁酸等，在早產(chǎn)兒未成熟的腸道細(xì)胞中起到預(yù)防過(guò)度炎癥引起的壞死性小腸結(jié)腸炎等作用[35]。綜上所述，SCFAs的生理功能和疾病預(yù)防方面意義的發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)了對(duì)有效和精確定量方法的需求。

3 乳中SCFAs檢測(cè)技術(shù)

SCFAs具有極性大、易揮發(fā)、水溶性強(qiáng)、相對(duì)分子質(zhì)量小等特性，對(duì)其準(zhǔn)確定量提出了挑戰(zhàn)。此外，乳中SCFAs存在形式包括結(jié)合態(tài)和游離態(tài)2種[16]，進(jìn)一步增加了其準(zhǔn)確定量的困難性。目前，乳中SCFAs的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜(gas chromatography，GC)法、液相色譜法、核磁共振等。

3.1 GC法

GC法是一種利用氣體作流動(dòng)相的色譜分離分析方法，具有分離能力強(qiáng)、檢測(cè)器選擇簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、靈敏度高以及儀器成本相對(duì)低廉等優(yōu)點(diǎn)。由于SCFAs的揮發(fā)性，GC法廣泛地應(yīng)用于SCFAs分析。根據(jù)GC法連接的檢測(cè)器的不同，GC法主要分為氣相色譜-氫火焰離子檢測(cè)器(gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)2種。與GC-FID相比，GC-MS提供了更好的靈敏性和選擇性。

Zebari等[36]對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行水提后使用GC-FID測(cè)定了乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸6種SCFAs含量，研究了乳中脂肪酸組成與泌乳荷斯坦奶牛發(fā)情期的關(guān)系。然而通過(guò)水提法進(jìn)行GC法分析時(shí)可能因SCFAs部分水解而導(dǎo)致回收率降低[37]，因此通常在脂質(zhì)提取后加入鹽酸、硫酸、偏磷酸等抑制其水解以達(dá)到提高提取效率和SCFAs峰形的效果。Jiang等[24]通過(guò)生乳中添加5%鹽酸乙醇溶液渦旋振蕩離心后上機(jī)，建立了檢測(cè)乳中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、己酸5種SCFAs含量的方法，并通過(guò)檢出限、定量限、日間差異、日內(nèi)差異等指標(biāo)對(duì)該方法的靈敏度、精密度進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)快速，前處理簡(jiǎn)單，結(jié)果顯示出良好的精密度和靈敏度，表明在不使用有機(jī)溶劑的情況下使用酸化水法仍能取得較好的結(jié)果。然而由于SCFAs羧基基團(tuán)極性較強(qiáng)，只進(jìn)行酸化步驟在進(jìn)行GC法分析時(shí)會(huì)出現(xiàn)吸附作用而導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性較差，特別含量較低(<1 mmol/L)時(shí)很容易產(chǎn)生這種誤差[38]。乳中SCFAs含量較低，因此在進(jìn)行GC法分析前必須對(duì)酸進(jìn)行衍生化。衍生化目的在提高目標(biāo)分析物的熱穩(wěn)定性，降低揮發(fā)性脂肪酸的蒸發(fā)損失，提高分析分離度和靈敏度，改善色譜保留時(shí)間、峰形等，減少樣品與色譜柱涂層間的反應(yīng)。Dai等[16]以甲醇為衍生化試劑，三氟化硼為催化劑，70 ℃水浴5 min來(lái)檢測(cè)不同胎齡嬰兒攝入的人乳中SCFAs含量及其在哺乳期的變化。然而，Mannion等[39]以庚烷/乙醚提取脂質(zhì)，以丁醇作為衍生化試劑，通過(guò)三氟化硼80 ℃水浴加熱1 h來(lái)催化丁酯化反應(yīng)，測(cè)定乳中游離態(tài)的丁酸、己酸含量，通過(guò)丁酯化與甲酯化的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)SCFAs丁酯具有高分子質(zhì)量、低揮發(fā)性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)易揮發(fā)的SCFAs含量測(cè)定更準(zhǔn)確。丁巖等[40]通過(guò)GC法測(cè)定發(fā)酵乳中7種SCFAs含量，發(fā)酵乳振蕩離心后調(diào)節(jié)pH至弱堿性，上清液中依次加入磷酸鹽緩沖液、衍生化試劑和丙酮后水浴加熱，加入正己烷后通過(guò)GC法測(cè)定。然而，由于乳中SCFAs存在形式的特殊性以及基質(zhì)的復(fù)雜性，關(guān)于乳中SCFAs含量的GC法分析的研究是相對(duì)有限的。

3.2 液相色譜法

液相色譜法是以液體為流動(dòng)相通過(guò)高壓輸液系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)兩相分離的監(jiān)測(cè)技術(shù)，具有高效、靈敏、分離效率高、選擇性好、同時(shí)定量多組分、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。液相色譜法也被應(yīng)用于各種生物樣品中SCFAs含量的檢測(cè)。

Contarini等[41]通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/質(zhì)譜聯(lián)用定量驢乳中性脂質(zhì)和磷脂部分存在的丁酸、己酸，其中丁酸、己酸在中性脂質(zhì)部分被準(zhǔn)確定量，磷脂部分未檢出。Liu等[42]通過(guò)乳樣中加入丁醇、甲醇、氯仿脂肪混提物(3∶5∶4)，渦旋振蕩離心后直接進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析熱應(yīng)激對(duì)乳中以甘油三酯形式存在的脂肪酸組成的影響，結(jié)果表明，熱應(yīng)激改變牛乳的甘油三酯譜，其中SCFAs-甘油三酯含量下降。通過(guò)液相色譜分析乳中SCFAs含量主要集中于甘油三酯含量的分析，是相對(duì)有限的，液相色譜也被廣泛應(yīng)用于其他生物基質(zhì)中SCFAs含量的分析[43-44]。

3.3 核磁共振

核磁共振是根據(jù)核磁共振效應(yīng)來(lái)確定分子結(jié)構(gòu)的高新技術(shù)，具有無(wú)損、快速、重現(xiàn)性高、覆蓋范圍廣、制備工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)分析。核磁共振已用于糞便和腸道內(nèi)容物SCFAs含量的分析，乳中SCFAs含量的分析也有涉及。

Wiking等[45]通過(guò)1H核磁共振測(cè)定了乳中與風(fēng)味和氣味相關(guān)的SCFAs含量，結(jié)果表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。Jensen等[3]和Picariello等[46]通過(guò)13C核磁共振分別鑒別不同品種動(dòng)物乳中和建立高分辨的乳脂摻假合成的中短鏈甘油三酯含量。Prentice等[10]通過(guò)乳樣與氘代氯仿混合后振蕩離心，利用1H核磁共振測(cè)定母乳中結(jié)合和游離態(tài)SCFAs含量，通過(guò)母乳中SCFAs含量來(lái)研究其與嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系。Stinson等[9]通過(guò)1H核磁共振對(duì)109位母親產(chǎn)后1個(gè)月母乳樣品中SCFAs含量進(jìn)行分析來(lái)研究SCFAs含量與地域、特應(yīng)性狀態(tài)的聯(lián)系。

3.4 其他方法

除此以外，SCFAs的定量方法也包括毛細(xì)管電泳[34,47]、微生物檢測(cè)器[48]、紅外或近紅外檢測(cè)[49]等。曹玉梅[48]通過(guò)微生物檢測(cè)器測(cè)定牛乳樣品中的SCFAs含量。Ferrand-Calmels等[49]通過(guò)中紅外光譜中測(cè)算得出牛乳和羊乳中SCFAs組成。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，SCFAs在機(jī)體生理功能和生理疾病方面具有重要意義。然而，由于乳中SCFAs存在形式的復(fù)雜性和不確定性，以及現(xiàn)有檢測(cè)方法的局限性，乳中SCFAs的準(zhǔn)確定量仍然是最復(fù)雜和極具挑戰(zhàn)性的工作之一。建立簡(jiǎn)便、快捷、定性和定量準(zhǔn)確的SCFAs含量檢測(cè)方法亟待完成，以此提高我們對(duì)乳中SCFAs組成、存在形式、生理功能等方面的認(rèn)知。