益生菌對胃腸道黏膜屏障的調(diào)控機制研究進展

張海龍 李 曉 王彩蓮 郎 俠*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅省牛羊種質(zhì)與秸稈飼料化重點實驗室，蘭州 730070)

人類胃腸道棲居著1013～1014個的微生物，其在宿主免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)代謝、維持腸道屏障結構完整性和抵御病原體方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。胃腸道微生物群失調(diào)不僅與腸內(nèi)疾病有關，如腸屏障功能障礙、炎癥性腸病和結直腸癌；還與多種腸外疾病有關，包括糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、關節(jié)炎、肝癌和嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)感染[3-8]。因此，維持胃腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)對人類及動物的健康是非常重要的，并有可能改變預防和治療疾病的策略。早在20世紀初，人們就認識到了保持微生物區(qū)系健康的重要性，人們發(fā)現(xiàn)食用酸奶和特定的細菌混合物與延長壽命和預防疾病密切相關。益生菌最初被定義為“一種活的微生物，當給予足夠的量時，會給宿主帶來健康益處”[9-11]。近年來，隨著“健康養(yǎng)殖”理念的提出，胃腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)越發(fā)受到人們的關注?？股卦挥脕碇委熂膊『痛龠M動物生長，但其導致的耐抗生素細菌的出現(xiàn)和肉類中抗生素殘留問題是一大弊端[12-16]，且抗生素具有殺死致病菌和益生菌的雙重作用，會擾亂胃腸道微生物群穩(wěn)態(tài)，促進致病菌定植，從而導致疾病[17-19]。腸道菌群失衡和抗生素的濫用會激活宿主腸道的免疫反應、炎癥反應和促進胃腸道蠕動，對宿主健康不利[20-21]。更嚴重的是，幼齡動物斷奶前濫用抗生素，會導致幼齡動物胃腸道微生物菌群發(fā)育不成熟，對飼糧營養(yǎng)成分的吸收和胃腸道屏障系統(tǒng)的發(fā)育造成永久性的負面影響[22-23]。益生菌與宿主的互作是個復雜的過程，其中之一的關鍵點是胃腸道黏膜屏障，但益生菌對胃腸道黏膜屏障的作用機制尚不明晰。因此，本文總結了近年來益生菌對胃腸道黏膜屏障調(diào)控的相關研究進展，通過益生菌對胃腸道上皮屏障的調(diào)控、對胃腸道黏液層的調(diào)控和對炎癥反應的調(diào)控等方面進行論述，以期為益生菌對胃腸道黏膜屏障的調(diào)控以及維持胃腸道微生物群穩(wěn)態(tài)提供一定的理論依據(jù)。

1 腸道黏膜屏障與免疫系統(tǒng)

胃腸道是機體與外界環(huán)境接觸的最大界面，與免疫系統(tǒng)之間聯(lián)系密切[24-25]。微生物在這種聯(lián)系中起關鍵作用，菌群組成調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)，反過來宿主免疫系統(tǒng)影響菌群組成。宿主免疫系統(tǒng)調(diào)控有益微生物的組成，控制特定細菌的過度生長，同時通過腸道黏膜屏障系統(tǒng)對致病菌的入侵和定植做出相應的反應[26]。免疫系統(tǒng)與病原體之間的相互作用也受微生物的調(diào)控，微生物可以直接與致病菌互作或間接刺激免疫系統(tǒng)對致病菌做出相關的反應。因此，當免疫系統(tǒng)在共生、互惠和致病菌這三者之間建立一個適當?shù)钠胶鈺r，腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)得以維持[27]。腸道黏膜屏障是由一系列不均勻的實體組成的復雜生態(tài)系統(tǒng)，其由細胞外部分和細胞部分構成[28]。細胞外部分主要是杯狀細胞分泌的黏液組成的黏液層，其中還包含一系列微生物。黏液的存在對促進食物通過、防止消化酶對上皮細胞的作用和防止致病菌定植至關重要[29]。細胞部分主要由腸道上皮細胞和下面的固有層組成。腸道上皮細胞包含5種不同類型的細胞：干細胞、潘氏細胞、可吸收上皮細胞、杯狀細胞和腸內(nèi)分泌細胞[30]。固有層由樹突狀細胞、上皮內(nèi)樹突狀細胞、巨噬細胞、上皮內(nèi)淋巴細胞、T調(diào)節(jié)細胞、T CD4+淋巴細胞、B淋巴細胞和漿細胞組成[31]。其中，巨噬細胞定位上皮細胞下區(qū)域，專門吞噬潛在有害微生物，并清除凋亡細胞和細胞碎片。樹突狀細胞在黏液層攝取致病菌并遷移到淋巴結，在淋巴結激活T細胞和炎癥反應。漿細胞和T細胞通過免疫球蛋白、細胞因子和炎癥介質(zhì)調(diào)控腸道體液免疫[31-32](圖1)。在人類中，腸上皮細胞每3～5 d更新1次，這一機制本身具有免疫保護作用，其可以清除感染和受損傷的細胞[33]。此外，腸上皮細胞的通透性也具有免疫活性，受緊密連接的調(diào)控[34]。

T CD4+：T CD4+淋巴細胞 T CD4+ lymphocytes；B：B淋巴細胞 B lymphocytes；IEC：上皮內(nèi)樹突狀細胞 intraepithelial dendritic cell；T Reg：T調(diào)節(jié)細胞 T regulatory cells。

2 益生菌對胃腸道緊密連接蛋白的調(diào)控

2.1 胃腸道上皮緊密連接簡述

腸道上皮細胞的功能之一是在外部環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間建立一個物理屏障，這個屏障的完整性和功能性是支持營養(yǎng)物質(zhì)和有益分子與機體交換的關鍵，且可以阻止有害物質(zhì)入侵。上皮細胞的選擇性通透性是由緊密連接蛋白介導的，該蛋白主要負責上皮屏障功能[35]。在健康腸道中，緊密連接蛋白密封上皮細胞之間的間隙，形成一個物理屏障，防止促炎分子通過。當緊密連接受損時，有毒分子可以通過[34]。簡單來說，緊密連接位于腸上皮細胞的頂端，它們由跨膜蛋白組成，胞外與鄰近緊密連接的相似結構域相互作用，胞內(nèi)與細胞骨架連接(圖2)。當緊密連接蛋白的表達或定位發(fā)生改變時，這種物理屏障的功能就會受到損害，可能會出現(xiàn)“腸漏”[36]。“腸漏”的特點是上皮細胞對分子或化合物的滲透性增加，這些分子或化合物從腸腔擴散到固有層。這種情況可以在體外通過跨上皮細胞電阻參數(shù)測量，或在體內(nèi)通過腸通透性測試測量[37]?！澳c漏”是多種病理狀況的表現(xiàn)，如炎癥性腸病、腸易激綜合征和乳糜瀉，所有特征都是持續(xù)的炎癥和組織損傷[38]。

圖2 腸道上皮緊密連接示意圖

2.2 益生菌調(diào)控緊密連接

飼糧中的多種化合物已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達[24]。類似地，益生菌也可以調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達或定位(表1)，改變腸黏膜屏障功能，進而對致病菌的入侵做出反應。例如，無菌小鼠用尼氏大腸桿菌(EscherichiacoliNissle，EcN)或K12型大腸桿菌(MG1655)感染，分離小腸上皮細胞，分析閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)和閉鎖小帶蛋白-2(zonula occludens-2，ZO-2)的基因和蛋白表達。結果表明，EcN定植無菌小鼠后，小鼠小腸上皮細胞中ZO-1的mRNA水平顯著上調(diào)，但不會上調(diào)ZO-2的mRNA水平。因此，EcN可以通過上調(diào)ZO-1的mRNA水平保護黏膜的通透性[39]；用極化的T84上皮細胞單層作為模型監(jiān)測腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli，EPEC)E2348/69菌株感染后屏障的破壞。EPEC與EcN共孵育或在EPEC感染后加入EcN消除了屏障破壞，使用DNA微陣列(芯片)技術分析與EcN孵育的T84細胞，發(fā)現(xiàn)了300多個基因的表達改變。EcN改變了ZO-2蛋白的表達，ZO-2的表達隨時間的推移向細胞邊界重新分布而增強腸道黏膜屏障。這項研究表明，EcN是一種重要的誘導信號，導致破壞的上皮屏障的恢復[40]。腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)O157∶H7感染可導致細胞間緊密連接中斷，導致急性腹瀉、出血性結腸炎等癥狀，用鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)預處理極化的MDCK-Ⅰ和T84細胞可以減少EHEC O157∶H7感染誘導的形態(tài)學變化，且保護了上皮單分子層免受EHEC誘導的封閉蛋白-1(claudin-1)和ZO-1緊密連接蛋白的分配(用益生菌處理的上皮細胞單層比單獨感染病原菌的單層細胞擁有更高水平的ZO-1表達，且可以防止大腸桿菌O157∶H7引起的claudin-1再分配的變化)，進而預防EHEC誘導的破壞[41]。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)DN-114001對致病菌株的黏附?jīng)]有抑制作用。但干酪乳桿菌DN-114001抑制EPEC誘導的細胞旁通透性的增加(108CFU/mL的干酪乳桿菌顯著抑制EPEC誘導的改變，跨膜電阻抗降低和ZO-1再分配)[42]。細胞單層暴露于嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)ATCC19258或嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)ATCC4356活體，顯著抑制了EIEC誘導的黏附、侵襲和生理功能障礙，且維持ZO-1、增強α-輔肌動蛋白(α-actinin)和閉合蛋白(occludin)的磷酸化水平[43]。在T84細胞系中，嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)降低了封閉蛋白-2(claudin-2)的表達，提高了ZO-1和occludin的表達；用嬰兒雙歧桿菌的條件培養(yǎng)基處理T84細胞，封閉蛋白-4(claudin-4)、ZO-1和occludin蛋白表達增強，而claudin-2蛋白表達隨著時間的推移而降低[44]。結腸腺癌細胞(Caco-2)經(jīng)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)MB452處理后，4種緊密連接蛋白(occludin、ZO-1、ZO-2和cingulin)的熒光強度均高于未處理的對照組[45]。健康受試者在十二指腸內(nèi)注射植物乳桿菌WCFS1或安慰劑(llacebo)6 h后，在緊密連接結構附近，ZO-1和occludin表達明顯增加[38]。

表1 調(diào)節(jié)緊密連接的益生菌列表

3 益生菌對胃腸道黏液層的調(diào)控

3.1 胃腸道黏液層簡述

胃腸道上皮被一層黏液所覆蓋，黏液是一種覆蓋腸道上皮的流變性物質(zhì)，是抵御各種有害分子、微生物感染和不同腔內(nèi)環(huán)境的保護屏障[46]。健康的黏液層在預防炎癥和感染性疾病中起著重要作用。胃腸道中的黏液是由腸道上皮中的杯狀細胞產(chǎn)生的，主要是黏蛋白(MUC)，MUC是一種高分子量的糖蛋白，主要有2種形式：分泌型黏蛋白(MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6)，負責黏液層的形成；跨膜黏蛋白(MUC1、MUC4、MUC13、MUC16)，其功能目前尚不清楚，但可能參與信號通路[47-49]。特異性黏液蛋白表達的改變與消化道疾病如克羅恩病[50]和潰瘍性結腸炎相關[51]，這凸顯了這些蛋白在胃腸道中的重要性。

3.2 益生菌調(diào)控胃腸道黏液層

某些益生菌已被證明可以調(diào)節(jié)MUC的表達，從而影響?zhàn)ひ簩拥男再|(zhì)，并間接調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)(表2)。植物乳桿菌299v與HT-29細胞孵育后MUC2和MUC3的mRNA表達量提高[52]。用尼氏大腸桿菌與HT-29細胞共同培養(yǎng)，可導致MUC2、MUC3、MUC5AC和MUC5A的mRNA表達量提高[53]。在腸上皮細胞單層表面添加干酪乳桿菌GG可顯著提高MUC2的表達，且隨著干酪乳桿菌GG添加量的升高，MUC2蛋白密度顯著增加[54]。在動物模型的體內(nèi)研究中，大白鼠每天口服益生菌混合物VSL#3，連續(xù)7 d；治療后，基底腔黏液含量增加60%。此外，將分離的大鼠結腸環(huán)暴露于VSL#3益生菌配方中，顯著刺激了結腸黏蛋白的分泌和MUC2基因的表達；而MUC1和MUC3基因表達僅略有升高。體外研究表明，培養(yǎng)細胞與VSL#3細菌共同培養(yǎng)沒有顯示黏液分泌增加。然而，條件培養(yǎng)基中所含的細菌分泌產(chǎn)物顯著刺激了MUC的分泌效果。在VSL#3所含的3種細菌群(乳酸桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌)中，乳酸桿菌是體外黏液分泌最強的促進劑[55]。魚飼料中添加腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)，結果表明，MUC和免疫球蛋白T重鏈(IGHT)表達上調(diào)[56]。羅伊氏乳桿菌E(LactobacillusreuteriE)與豬胃黏蛋白預培養(yǎng)后，再與HT-29細胞系共培養(yǎng)，HT-29細胞系中MUC2、MUC5AC和白細胞介素-10(IL-10)表達顯著上調(diào)[57]。

表2 益生菌對黏蛋白的調(diào)控

4 益生菌對腸道炎癥小體的調(diào)控

4.1 炎癥小體——核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)

先天免疫系統(tǒng)是抵御感染或組織損傷的第1道防線，先天免疫的細胞和分子在遇到微生物或其他“危險信號”時迅速激活[58]。這些細胞通過使用模式識別受體如Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding and oligomerization domain，NLRs)來響應病原體相關的分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)和損傷相關的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)[59-61]。作為NLRs家族的一員，炎癥小體是一組大型的細胞質(zhì)多聚蛋白復合物，可加工和切割促炎細胞因子，如白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)前體，使之成熟[62-67]。成熟后的IL-1β和IL-18向免疫系統(tǒng)發(fā)出危險警報，并增強促炎免疫反應[68]。一般來說，炎癥小體復合物由傳感器、適配器和效應器組成。以NLRP3炎性小體為例，由傳感器NLRP3、適配器凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和效應器半胱天冬酶-1(Caspase-1)組成。作為最典型的炎癥小體，NLRP3參與了許多不同的疾病病理過程[69]。NLRP3的功能對健康狀態(tài)很重要，例如它有助于葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導的結腸炎小鼠腸道組織損傷的恢復[70]。然而，NLRP3的過度激活會導致一些炎癥性疾病，包括膿毒癥休克[71]、Ⅱ型糖尿病[72]、類風濕性關節(jié)炎[73]和阿爾茨海默氏病[74]。

4.2 益生菌對NLRP3的調(diào)控

NLRP3的活化被抑制，可降低促炎細胞因子的產(chǎn)生，促炎細胞因子減少在一定程度上可緩解炎癥進程。某些微生物可以通過抑制炎癥小體組裝(活化)減少促炎細胞因子的產(chǎn)生，從而達到緩解炎癥進程的效果。例如糞腸桿菌(Enterococcusfaecalis)，熱殺死的糞腸桿菌處理THP-1細胞系可抑制Caspase-1活化和減少IL-1β的產(chǎn)生，進而緩解炎癥進程。小鼠體內(nèi)試驗中糞腸桿菌可改善腸道損傷嚴重程度[75]。Caspase-1作為NLRP3的效應器，是NLRP3完整組裝不可缺少的部分，Caspase-1的活化被抑制使得NLRP3的組裝(激活)不能完成，導致IL-1β前體的成熟被抑制，進一步使得IL-1β表達量減少。IL-1β是一種促炎細胞因子，其表達量減少可改善炎癥的嚴重程度。在高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂肪變性和炎癥反應中，乳酸雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)V9可抑制NLRP3和ASC的mRNA表達，且可以抑制促炎細胞因子[如白細胞介素-6(IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]的產(chǎn)生[76]。ASC作為NLRP3小體的適配器，是NLRP3小體完整組裝的重要部分，ASC表達量的減少使得NLRP3小體的組裝被抑制，導致促炎細胞因子前體的成熟被抑制，進一步使得促炎細因子表達量降低，從而緩解炎癥進程。約氏桿菌L531預處理能抑制嬰兒沙門氏菌誘導的小腸NLRC4和NLRP3炎癥小體的活化，從而抑制炎癥反應[77]。炎癥小體的組裝(活化)被抑制，導致促炎細胞因子前體的活化被抑制，進而降低促炎細胞因子的釋放，從而緩解炎癥進程。用嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)30治療DSS誘導的結腸炎，結果表明，嬰兒雙歧桿菌顯著降低結腸組織中NLRP3的mRNA水平，顯著下調(diào)結腸組織中促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的mRNA水平，顯著提高結腸組織中occludin-1、occludin和claudin-1緊密連接的mRNA水平[78]。NLRP3 mRNA表達水平降低，說明NLRP3小體的組裝(激活)被抑制，導致促炎細胞因子前體的活化被抑制，進而降低促炎細胞因子的表達量，從而緩解炎癥進程。此外還有干酪乳桿菌，在多發(fā)性硬化癥中，用干酪乳桿菌(1×109CFU/mL)進行治療，可顯著降低炎癥小體基因的表達[79]。炎癥小體基因表達量降低，說明炎癥小體的組裝(激活)被抑制，導致促炎細胞因子前體的活化被抑制，從而降低促炎細胞因子的表達量，進而緩解炎癥進程。

5 小 結

宿主免疫系統(tǒng)與腸道微生物之間存在一定的聯(lián)系，微生物可以影響宿主免疫系統(tǒng)的狀態(tài)，反過來宿主免疫系統(tǒng)對微生物的存在形式也有影響。了解二者間的互作機制對宿主的健康生長和抵抗疾病方面具有深遠的影響，也是未來畜牧業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的理論前提。益生菌可調(diào)控宿主胃腸道上皮緊密連和黏液層，并且對炎癥小體也有調(diào)控作用。宿主胃腸道上皮緊密連接的改變會影響胃腸道上皮的通透性，進而導致宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和對致病菌的抵抗發(fā)生改變。黏液層的改變影響致病菌的定植。炎癥小體的組裝(激活)與宿主體內(nèi)的炎癥進程密切相關，益生菌具有調(diào)控炎癥小體的能力，進而使得炎癥進程發(fā)生改變，炎癥進程對宿主的免疫系統(tǒng)至關重要。盡管國內(nèi)外科研工作者對微生物與宿主互作的研究已經(jīng)取得了豐碩的成果，但關于微生物具體是怎樣調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的機制尚不精確，例如微生物本身還是其代謝產(chǎn)物對宿主免疫系統(tǒng)起主要調(diào)節(jié)作用，這種調(diào)節(jié)作用的信號是如何被宿主免疫系統(tǒng)識別并做出相應的反饋，這些問題還需要進一步研究。相信隨著科技的發(fā)展，人們將逐步完善微生物與機體免疫系統(tǒng)之間的互作這一復雜過程的相關理論研究，為微生物促進機體的健康提供新的思路。