2型糖尿病足潰瘍患者外周血miR-155表達水平的改變及其臨床意義

趙天琦，趙曉彤，許慕蓉，唐 穎，莢澤國，羅 莉，唐松濤，章 秋，陳明衛(wèi)

糖尿病足是糖尿病常見的嚴重慢性并發(fā)癥之一。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)為糖尿病足最常見的表現(xiàn)形式，是導致非創(chuàng)傷性截肢最常見的原因[1]。微小RNAs(miRNAs)是一類內源性非編碼小RNA，長度約為18～25個核苷酸，通過與下游靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)域特異性結合，調控靶基因表達[2]。近年來越來越多的研究[3]表明，miRNAs異常表達與DFU的發(fā)生與預后密切相關。miR-155是miRNAs家族中的重要成員，廣泛參與機體免疫細胞的發(fā)育分化、炎癥反應、免疫應答等許多生物過程，并可對參與皮膚創(chuàng)面愈合過程的角質形成細胞、成纖維細胞、真皮間充質干細胞等細胞功能產生顯著影響[4-5]。抑制局部創(chuàng)面組織中miR-155的表達可促進糖尿病大鼠皮膚傷口的愈合[6-7]。目前有關miR-155與DFU發(fā)病的相關關系的臨床研究尚未見報道。因此，該研究旨在了解DFU患者外周血中miR-155表達水平的改變及其與DFU發(fā)病之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取的研究對象來自課題組先前研究[8]報道的受試者，為2018年1月至2019年12月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科住院治療的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)合并DFU患者112例(DFU組)，足潰瘍病程≥4周，潰瘍面積在2～20 cm2，Wagner分級 2～4級，踝肱比(ankle-brachial index，ABI)0.7～1.3，糖尿病病程3～18年。選擇同期在本院內分泌科就診的60例新診斷T2DM患者為糖尿病組 (T2DM組)，無DFU。選擇同期在本院健康管理中心體檢的健康人群60例作為正常對照組(NC組)，均行75g口服葡萄糖耐量試驗，證實為糖耐量正常。所有受試者無嚴重心、肝、腎功能不全，非癌性潰瘍創(chuàng)面，無自身免疫疾病，無嚴重膿毒血癥。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，并獲得受試者知情同意。

1.2 主要儀器與試劑全自動生化分析儀(MODULE P800，瑞士羅氏公司)，數(shù)碼照相結合Image J醫(yī)學圖像分析軟件(Image J-ij133-jdk15，美國國立衛(wèi)生研究院)，多普勒血流探測儀(DPL-03，杭州遠想醫(yī)療)，經皮氧分壓檢測儀(TCM 400，丹麥雷度公司)，miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1DFU的治療過程 所有DFU均給予常規(guī)的全身治療，包括抗感染、降壓、降糖、糾正低蛋白血癥、營養(yǎng)神經、改善下肢創(chuàng)面血液供應等。并行創(chuàng)面清除術，去除變黑壞死軟組織以及骨組織?？筛鶕﨑FU具體情況，給予減壓、持續(xù)負壓吸引治療等。隨訪DFU病情變化，由糖尿病足多學科團隊會商決定是否行截肢治療，記錄患者治療8周后創(chuàng)面完全愈合情況。

1.3.2臨床指標的檢測 所有受試者禁食10 h后于次日早晨8 ∶00～8 ∶30空腹狀態(tài)從肘部抽取靜脈血至抗凝管(抗凝劑為氟化鈉/EDTA/肝素，可根據檢查項目不同選擇不同抗凝劑)或非抗凝采集試管中，供測定血清白蛋白(albumin，ALB)、血糖、血脂、糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c, HbA1c)、白細胞(white blood cell, WBC)計數(shù)、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)等指標。采用全自動生化分析儀測定血糖、血脂、ALB。其中空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)檢測采用葡萄糖氧化酶法，總膽固醇(total cholesterol, TCH)、三酰甘油(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)檢測采用氧化酶聯(lián)比色法。此外，采用高壓液相色譜法檢測HbA1c，采用乳膠增強散射免疫比濁法測定CRP，采用魏氏法測定ESR。采用數(shù)碼照相結合Image J醫(yī)學圖像分析軟件測量皮膚潰瘍面積，使用多普勒血流探測儀測定ABI，應用經皮氧分壓檢測儀測定潰瘍周圍的經皮氧分壓(percutaneous oxygen partial pressure, TcPO2)。

1.3.3外周血miR-155表達的檢測 應用實時定量PCR(qRT-PCR)測定外周靜脈血中miR-155的表達。將2 ml靜脈血置于EDTA抗凝管中，離心后將獲得的血漿移入無RNA酶的1.5 ml EP管中，置于-80 ℃凍存。按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作，進行RNA的提取。并使用超微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。隨后按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作，進行cDNA的合成。最后按miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作，進行qRT-PCR。

miR-155引物序列：上游5′-CGGCGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′；下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCCTGTCAT-3′。設置的反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共42個循環(huán)。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法分別計算miR-155相對表達量。每例樣本均重復3次，取平均值為最終結果。

2 結果

2.1 三組間臨床參數(shù)指標比較三組間性別構成、年齡、TCH、LDL-C水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T2DM組和DFU組的FPG、HbA1c、TG水平均高于NC組，HDL-C水平則低于NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。T2DM組外周血miR-155表達水平低于NC組，DFU組外周血miR-155表達水平高于NC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。另外，NC組與T2DM組間TcPO2、ABI、CRP、ESR、ALB、WBC計數(shù)、Hb差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。DFU組糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP、ESR、WBC計數(shù)以及外周血miR-155表達水平均高于T2DM組，而TcPO2、ABI、ALB、Hb均低于T2DM組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組間TG、HDL-C水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 外周血miR-155表達水平與DFU臨床特征之間的關系以112例DFU患者外周血miR-155表達水平的中位數(shù)作為切割點，將DFU組再分為兩個亞組，其中外周血miR-155表達水平低于中位數(shù)者列為低表達組，將高于或等于中位數(shù)者列為高表達組。對高表達組與低表達組間足潰瘍的臨床特征進行比較，結果顯示DFU患者外周血miR-155表達水平與8周后足潰瘍愈合率呈負相關(P=0.04)，與足潰瘍病程、足潰瘍Wagner分級呈正相關(P=0.02,P=0.01)，未見到miR-155表達水平與足潰瘍其他臨床特征之間存在相關性，見表2。

表2 DFU患者外周血miR-155表達水平與足潰瘍臨床特征之間的關系[n (%)]

2.3 三組中外周血miR-155表達與其他臨床參數(shù)指標之間的相關性在NC組中，未觀察到外周血miR-155表達與其他臨床參數(shù)指標之間存在明顯相關性(P>0.05)；在T2DM組中，外周血miR-155表達與FPG、HbA1c水平呈負相關(P<0.05)，與其他指標無顯著相關性(P>0.05)；在DFU組中，外周血miR-155表達與足潰瘍病程、足潰瘍Wagner分級、CRP、白細胞計數(shù)呈正相關(P<0.05)，與其他指標無顯著相關性(P>0.05)。見表3。

表3 三組中外周血miR-155表達與其他臨床參數(shù)指標之間的相關性(r)

2.4 DFU的危險因素分析在糖尿病患者中，以DFU作為因變量，分別以性別、年齡以及單因素Logistic回歸分析中獲得的所有P值<0.1的變量(包括糖尿病病程、FPG、HbA1c、TG、 LDL-C、HDL-C、ALB、TcPO2、ABI、CRP、WBC、 Hb、ESR、miR-155)為自變量進行多元逐步Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病病程、HbA1c、CRP、低TcPO2 、高表達miR-155均為DFU的獨立危險因素，見表4。

表4 DFU危險因素的多元逐步Logistic回歸分析

3 討論

本研究顯示，與無DFU的T2DM患者比較，DFU患者外周血中miR-155表達水平明顯升高，高表達的miR-155不僅為DFU發(fā)病的獨立危險因素，也與DFU的Wagner分級、愈合率密切相關，miR-155高表達者DFU病情程度較重，愈合率較低。提示miR-155的高表達，不僅是DFU發(fā)病的強危險因素，還可作為DFU病情評估、治療預后的潛在生物標志物。

本組資料顯示，與糖耐量正常的對照人群比較，T2DM患者外周血miR-155表達水平明顯降低。相關分析顯示，在T2DM患者中，miR-155與FPG、HbA1c成負相關。動物研究[9]顯示，miR-155的整體轉基因過度表達可改善小鼠的糖耐量和胰島素敏感性，導致低血糖。相反，小鼠miR-155缺乏會導致高血糖、糖耐量受損和肝臟、肌肉、脂肪細胞的胰島素抵抗。臨床研究[10-11]顯示在T2DM患者的外周血漿以及單核細胞中，miR-155表達水平均較性別年齡匹配的糖耐量正常人群顯著降低。本研究結果與之一致。然而，在DFU組中，外周血miR-155表達水平與FPG、HbA1c無明顯相關性，推測原因可能是DFU患者中其他因素對miR-155表達的影響超過FPG、HbA1c所致。本研究還表明，在DFU組中，miR-155表達水平與反應炎癥狀態(tài)指標的CRP、ESR、WBC計數(shù)顯著正相關，提示DFU患者外周血miR-155的高表達與感染性炎癥狀態(tài)可能有關。此外，本研究未觀察到miR155表達水平與糖尿病病程之間存在相關性。

本研究中，DFU組足潰瘍的病程至少4周，為慢性難愈合創(chuàng)面。臨床特征表現(xiàn)為糖尿病病程長，長期血糖控制不佳，合并不同程度的脂代謝異常、周圍血管病變與感染性炎癥狀態(tài)。多因素回歸分析顯示，糖尿病病程、HbA1c、TcPO2、CRP為足潰瘍發(fā)生的獨立影響因素，與既往的研究[12]結果一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與T2DM組患者相比，DFU組患者外周血miR-155水平明顯增高；miR-155表達水平與足潰瘍病程、Wagner分級呈正相關，與8周后足潰瘍愈合率呈負相關。多因素回歸分析顯示，高表達的miR-155為足潰瘍發(fā)生的獨立危險因素。提示miR-155可能參與DFU的發(fā)病過程，并可作為DFU病情嚴重程度以及預后判斷的標志物。目前普遍認為創(chuàng)面中存在持續(xù)和過度的炎癥狀態(tài)以及表皮中參與創(chuàng)面愈合的多種細胞功能受損是造成DFU難以愈合的重要影響因素[13]。研究[6]表明，在糖尿病鼠皮膚傷口中miR-155表達增加，miR-155既扮演著促炎癥效應角色，又可通過下調成纖維細胞生長因子7表達，影響角質形成細胞的遷移和增殖，損害創(chuàng)面的再上皮化。而在敲除miR-155后，小鼠傷口組織中M1樣巨噬細胞減少，M2樣巨噬細胞和I型膠原沉積明顯增加，創(chuàng)面炎癥反應減輕，修復能力增強[14]。另外，在糖尿病大鼠皮膚傷口模型中[6-7]，局部注射miR-155抑制劑干擾miR-155表達后，創(chuàng)面組織中T淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞數(shù)量減少，白介素-1β、腫瘤壞死因子-α水平降低，炎癥反應減輕，新生血管明顯增加，肉芽組織中膠原含量增加，排列更加規(guī)則，創(chuàng)面愈合加速。

總之，本研究顯示，2型糖尿病足潰瘍患者外周血miR-155表達水平增高，為DFU的獨立危險因素并與DFU預后密切相關。本研究的不足之處主要包括：為單中心研究，樣本量相對較少，可能存在選擇偏倚，因此需要更多的研究來證實。此外，本研究也無法明確miR-155與DFU發(fā)病的因果關系。未來需要進一步探討miR-155的作用機制以及評估m(xù)iR-155能否成為DFU的新治療靶點。