超聲聯(lián)合BRAF V600E基因檢測模型在主動(dòng)監(jiān)測甲狀腺微小癌侵襲性中的應(yīng)用

王雨竹，彭 梅，姜 凡，王圣應(yīng)，劉建軍，陶 堃，楊 楊，何 杰

甲狀腺癌的發(fā)病率在全球不斷攀升，其中直徑≤1 cm的甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)發(fā)病率占50%以上[1]。2015年美國甲狀腺協(xié)會(American thyroid association，ATA)在《成人甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌患者管理指南》中提出，對低侵襲性的PTMC患者可以考慮采用主動(dòng)監(jiān)測代替立即手術(shù)治療[2]。PTMC的侵襲性特征有甲狀腺腺外侵犯、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-4]。BRAF基因突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的基因突變，而BRAF突變以BRAF V600E基因突變?yōu)橹鳌２糠盅芯縖5]表明，BRAF V600E基因突變與PTMC的侵襲性有一定相關(guān)性。該研究旨在通過結(jié)合患者臨床特征、術(shù)前超聲檢查、BRAF V600E基因檢測，建立甲狀腺結(jié)節(jié)侵襲性的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，為臨床醫(yī)師術(shù)前制定更好的治療方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西區(qū)頭頸乳腺外科初次行手術(shù)治療，并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為PTMC且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者共264例，男66例，女198例。將2017年10月至2019年4月收集的154例PTMC患者納入模型組，2019年5月至2021年1月收集的110例PTMC患者納入驗(yàn)證組。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 術(shù)后病理為單發(fā)癌灶；② 具有完整的超聲檢查資料、臨床資料、BRAF V600E基因檢測；③ 手術(shù)切除范圍至少為患側(cè)腺葉切除+患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并其他腫瘤；② 術(shù)前超聲檢查資料不完整、未做BRAF V600E基因檢測；③ 未行淋巴結(jié)清掃。

1.2 儀器與方法超聲檢查采用GE Logiq E9 超聲診斷儀，L15 探頭，探頭頻率6～15 MHz。檢查者取仰臥位，頭部充分后仰暴露頸前區(qū)，做甲狀腺兩側(cè)葉、峽部的橫斷面及縱斷面滑動(dòng)掃查。常規(guī)超聲掃查可發(fā)現(xiàn)甲狀腺可疑惡性結(jié)節(jié)，觀察結(jié)節(jié)位置、測量結(jié)節(jié)大小、觀察結(jié)節(jié)邊緣、微鈣化(直徑≤1 mm)、縱橫比、回聲及血流分布情況。對頸部淋巴結(jié)進(jìn)行廣泛掃查，觀察檢出的淋巴結(jié)形態(tài)、大小、包膜、皮髓質(zhì)回聲以及與周圍組織關(guān)系，觀察其內(nèi)部及周邊血流分布情況。超聲疑為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是指淋巴結(jié)中出現(xiàn)團(tuán)塊狀高回聲或無回聲區(qū)、點(diǎn)狀強(qiáng)回聲，高回聲內(nèi)血流信號豐富。超聲疑為腺外侵犯是指結(jié)節(jié)接觸甲狀腺包膜>25%或甲狀腺包膜的回聲線連續(xù)性中斷。

BRAF V600E基因檢測：收集符合標(biāo)準(zhǔn)的石蠟標(biāo)本，選擇蠟塊中間部分，行10 μm切片，使用武漢友芝公司生產(chǎn)的人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進(jìn)行BRAF V600E 突變檢測，利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，針對BRAF基因第1799位核苷酸上V600E突變進(jìn)行定性檢測。嚴(yán)格按照使用說明書操作，待反應(yīng)結(jié)束分析收集到的熒光信號，在陰性、陽性對照、內(nèi)部質(zhì)量控制均在合適范圍的前提下，600Glu PCR反應(yīng)液管突變檢測Ct值≥38或無Ct值，樣本為陰性；600Glu PCR反應(yīng)液管突變檢測Ct值<38，則計(jì)算該反應(yīng)管的△Ct值。若該反應(yīng)管的△Ct值小于9，則樣本為600 Glu的突變陽性；反之則為突變陰性。

2 結(jié)果

2.1 模型組單因素分析結(jié)果模型組154例PTMC患者中男36例，女118例。對臨床及超聲特征進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，患者性別(P=0.003)、年齡(P=0.005)、腫瘤最大徑(P=0.001)、微鈣化(P=0.001)、超聲疑為腺外侵犯(P<0.001)、超聲疑為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.012)、BRAF V600E基因突變(P=0.019)均與PTMC的侵襲性有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 模型組多因素Logistic回歸分析將表1中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)因素納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示患者性別、年齡、腫瘤最大徑、微鈣化、超聲疑為腺外侵犯、超聲疑為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BRAF V600E基因突變均是PTMC的侵襲性的危險(xiǎn)因素。見表2。

表1 單因素分析PTMC患者侵襲性的相關(guān)因素

表2 多因素Logistic分析結(jié)果

2.3 模型組ROC曲線以侵襲性為縱坐標(biāo)，分別以超聲指標(biāo)(腫瘤最大徑、微鈣化、超聲疑為腺外侵犯、超聲疑為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、BRAF V600E基因、患者臨床特征(性別、年齡)、超聲指標(biāo)聯(lián)合臨床特征、BRAF V600E基因聯(lián)合臨床特征、超聲指標(biāo)聯(lián)合BRAF V600E基因以及三者聯(lián)合為橫坐標(biāo)，繪制ROC曲線評估其對PTMC侵襲性的預(yù)測效能(圖1)，其曲線下面積AUC分別為0.754(95%CI：0.678～0.831)、0.581(95%CI：0.491～0.671)、0.677(95%CI：0.592～0.762)、0.795(95%CI：0.725～0.864)、0.694(95%CI：0.612～0.776)、0.780(95%CI：0.709～0.852)、0.813(95%CI：0.747～0.879)。其中三者聯(lián)合為橫坐標(biāo)所繪制的AUC為0.813(95%CI：0.747～0.879)，高于其他指標(biāo)。超聲指標(biāo)聯(lián)合BRAF V600E檢測及患者臨床特征對PTMC患者侵襲性預(yù)測效能最好。

圖1 模型組各指標(biāo)預(yù)測效能

2.4 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型以患者臨床特征、超聲指標(biāo)、BRAF V600E基因檢測為危險(xiǎn)因素構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型。將各危險(xiǎn)因素進(jìn)行分類，指定每組的參考值Wij，選擇合適的分組作為基礎(chǔ)風(fēng)險(xiǎn)參考值WiREF，記為0分。結(jié)合回歸系數(shù)βi，以及各組參考值Wij，計(jì)算各組與WiREF之間的距離D。設(shè)定常數(shù)B為1，計(jì)算危險(xiǎn)因素每個(gè)分類所對應(yīng)的分值，數(shù)值四舍五入取整數(shù)，結(jié)果見表3。根據(jù)結(jié)果，將每個(gè)危險(xiǎn)因素的分值加起來計(jì)算總分，范圍為：0～8分。

表3 危險(xiǎn)因素賦分

表4 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測概率表

同時(shí)Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)結(jié)果提示P=0.663，確定系數(shù)χ2=5.861。說明模型擬合優(yōu)度好，預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.5 驗(yàn)證組ROC曲線驗(yàn)證組共納入經(jīng)病理證實(shí)為PTMC的患者110例，其中男性30例，女性80例，26～68(42.4±10.3)歲。將患者數(shù)據(jù)代入預(yù)測模型，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測概率，以術(shù)后病理結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制ROC曲線(圖2)。所得AUC為0.774(95%CI：0.685～0.848)，cut-off值為0.450 2，靈敏度為83.3%，特異度為62.9%，模型具有較好的診斷效能。cut-off值為0.450 2，以總分≥5分為預(yù)測患者甲狀腺結(jié)節(jié)有侵襲性可能。圖3所示為一位甲狀腺微小乳頭狀癌伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的超聲圖像?；颊吣行?，36歲，腫瘤最大徑8 mm，無微鈣化，結(jié)節(jié)外周區(qū)域甲狀腺包膜線連續(xù)性中斷，頸部VI區(qū)淋巴結(jié)內(nèi)見液性暗區(qū)，BRAF V600E基因檢測為突變型。預(yù)測模型計(jì)算侵襲性的風(fēng)險(xiǎn)為94.3%，預(yù)測為有侵襲性，與病理結(jié)果相符。

圖2 預(yù)測模型在驗(yàn)證組中的預(yù)測效能

圖3 甲狀腺微小乳頭狀癌伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的超聲圖像A：甲狀腺橫切面圖；B頸部VI區(qū)淋巴結(jié)(箭頭所示淋巴結(jié)內(nèi)見液性暗區(qū))

3 討論

PTMC一般生物學(xué)行為溫和，一部分患者可能終生不表現(xiàn)出臨床癥狀。越來越多的觀點(diǎn)認(rèn)為對于低侵襲性的PTMC，可采取主動(dòng)監(jiān)測的方法來代替手術(shù)切除[2,6-7]。多項(xiàng)研究[8]表明，對于主動(dòng)監(jiān)測期間有腫瘤生長或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，補(bǔ)救手術(shù)有良好的效果和預(yù)后，同時(shí)主動(dòng)監(jiān)測組患者的術(shù)后并發(fā)癥及醫(yī)療費(fèi)用明顯減少。但部分病例具有侵襲性，原發(fā)灶常侵出甲狀腺包膜，侵犯周圍組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較早且范圍廣，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的生存率和預(yù)后不佳。因此，對于PTMC侵襲性的預(yù)測能為臨床選擇合適的治療方案提供幫助。

研究[9]表明男性、年齡<45歲是PTMC患者侵襲性的危險(xiǎn)因素，本研究中女性 ∶男性為3 ∶1，OR值為2.611，年齡<45歲OR值為2.356，同樣驗(yàn)證了這一點(diǎn)。微鈣化反應(yīng)出的是病理中砂礫體，是鈣化的一鐘特殊類型，主要是腫瘤生長迅速、血供不足、細(xì)胞凋亡，使癌組織內(nèi)局部形成鈣磷沉積微環(huán)境，形成微鈣化。多項(xiàng)研究[10-11]表明微鈣化對甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的定性診斷有重要意義，超聲發(fā)現(xiàn)微鈣化時(shí)往往提示為惡性結(jié)節(jié)。王猛 等[12]通過對575例PTMC患者的超聲特征與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析，認(rèn)為微鈣化是PTMC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，本研究結(jié)果與之一致。一般認(rèn)為腫瘤最大徑越大，其發(fā)生侵襲性行為的風(fēng)險(xiǎn)就越高。腫瘤最大徑被認(rèn)為是影響PTMC進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究表明腫瘤最大徑>5 mm是PTMC患者侵襲性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，該結(jié)論與Cheng et al[13]的研究是相吻合的。近年來，應(yīng)用分子生物學(xué)有望解決一些甲狀腺組織診斷難的問題。BRAF V600E基因突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的基因突變類型。研究[14]顯示BRAF基因突變與PTMC的侵襲性密切相關(guān)，本研究表明BRAF V600E基因突變型的患者出現(xiàn)侵襲性行為的風(fēng)險(xiǎn)更大。

以上各因素需綜合分析，因此本研究對于每個(gè)危險(xiǎn)因素，選擇一個(gè)合適的分組作為基礎(chǔ)風(fēng)險(xiǎn)參考值，計(jì)算出預(yù)測模型，并將模型帶入110例驗(yàn)證組中評估，以總分≥5分為預(yù)測患者甲狀腺結(jié)節(jié)有侵襲性分?jǐn)?shù)，所得AUC為0.774(95%CI：0.685～0.848)，cut-off值為0.450 2，模型具有較好的診斷效能。本研究也存在一些局限性。PTMC中存在多種分子標(biāo)志物，但本研究并未分析其他分子標(biāo)志物與PTMC患者不良預(yù)后之間的關(guān)系，也缺乏未手術(shù)的長期觀察結(jié)果。對PTMC侵襲性的預(yù)測還需要大樣本、多中心、前瞻性研究的證實(shí)。