TLR4/NF-κB信號通路激活LncRNA RP11-20G6調(diào)控慢性阻塞性肺疾病氣道炎癥和重塑

陳訓(xùn)春，李名蘭，潘碧云，王燕英，丁毅鵬

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種進(jìn)行性退行性肺疾病。吸煙是COPD最重要的病因，香煙煙霧中含有許多顆粒物和氧化劑，它們通過激活在小鼠肺上皮細(xì)胞和肺組織中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化[1]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是先天性免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵分子，它識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，并激活促炎性核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)[2]。研究[3]表明，在COPD大鼠中，香煙煙霧通過激活肺上皮細(xì)胞和肺組織中TLR4誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和纖維化。研究[4]顯示TLR4可以通過長的非編碼RNA(lncRNA)調(diào)節(jié)炎癥?；谝陨涎芯浚琓LR4是否通過lncRNAs調(diào)節(jié)COPD炎癥反應(yīng)并抑制氣道重塑值得關(guān)注。

LncRNAs是參與各種病理過程的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本[5-6]。lncRNAs通過競爭性結(jié)合microRNAs(miRNAs)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[7]。本研究利用RNA測序法篩選了對照組、WT-COPD組和 TLR4-/- COPD組之間差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs。其中，lncRNA RP11-20G6.3(RP11-20G6.3)是常見的差異表達(dá)lncRNAs之一。ceRNA網(wǎng)絡(luò)預(yù)測發(fā)現(xiàn)RP11-20G6.3/miR-34c-5p軸與TLR4/NF-κB通路相關(guān)。根據(jù)以往的研究[8]，miR-34c-5p直接參與TLR4通路的調(diào)節(jié)，并與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。因此，筆者假設(shè)COPD中TLR4促進(jìn)RP11-20G6.3的表達(dá)上調(diào)，并通過激活下游信號最終促進(jìn)氣道炎癥和氣道重塑。因此，該研究的目的是確定內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)網(wǎng)絡(luò)在COPD分子機(jī)制中的潛在作用，為COPD的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源肺組織取自?？谑腥嗣襻t(yī)院20例確診為孤立性肺腫瘤患者。將患者分為3個亞組：5名不吸煙者(非吸煙組)，5名吸煙者(吸煙組)，10名當(dāng)前吸煙者合并COPD(COPD組)。手術(shù)切除后，取離腫瘤邊緣至少5 cm的肺組織立即在液氮中冷凍，并在-80 ℃下儲存，直到用于RNA分離。

1.2 質(zhì)粒、試劑及儀器miR-34c-5p模擬物及其陰性對照模擬物(miR-NC)，以及RP11-20G6.3序列由廣州市銳博生物科技有限公司合成并克隆到pcDNA3.1(+)載體(pcDNA3.1-20G6.3)。

嬌子香煙購自中國成都卷煙廠(每支卷煙含焦油11 mg、尼古丁0.9 mg)；脂多糖，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；RIPA裂解緩沖液購自北京Solarbio公司；一抗(TLR4、P-IκBα、IκBα、P-NF-κB、NF-κB和GAPDH)均購自美國Abcam公司；TRIzol、LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司；高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Qiagen公司；PCR引物購自美國Thermo fisher公司；NEBNext? UltraTMII RNA文庫制備試劑盒購自美國NEB公司。

7300實(shí)時PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystem公司；Agilent 2200 TapeStation購自美國Agilent公司；2200 TapeStation和Qubit?2.0購自美國Life Technologies公司；Veritas 9100-002工具購自美國Turner BioSystems公司。

1.3 動物及COPD模型建立野生型(WT)和TLR4基因敲除(KO)C57BL/6雄性小鼠(6～8周齡)購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)在無病原體的動物房中，提供食物和水。參照文獻(xiàn)[3]方法建立COPD模型，具體操作：小鼠被放置在一個有機(jī)玻璃室(50 cm×60 cm×70 cm)，由一次性過濾器覆蓋。在第1周，這些動物每天接受4支香煙，每次間隔30 min，每周5 d。從第2周開始，小鼠每天暴露于6支香煙的煙霧中，劑量維持到第6周。在第3周和第5周末，小鼠鼻腔內(nèi)滴入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(30 μg/6 μl)。第2組和第4組小鼠于第3周至第6周每天腹腔注射pcDNA3.1-NC或pcDNA3.1-20G6.3(5×107IU)。最后一次暴露香煙后1周處死動物，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺組織。

1.4 免疫印跡分析采用RIPA裂解緩沖液從肺組織中提取蛋白質(zhì)。將含有20 μg蛋白質(zhì)的樣品與SDS樣品緩沖液混合并煮沸，然后在10%的SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜2 h，然后用相應(yīng)的主要一抗：[TLR4(1 ∶4 000稀釋)、P-IκBα(1 ∶1 000稀釋)、IκBα(1 ∶1 000稀釋)、P-NF-κB(1 ∶2 000稀釋)、NF-κB(1 ∶2 000稀釋)和GAPDH(1 ∶5 000稀釋)]在4 ℃下培養(yǎng)過夜。最后用HRP結(jié)合的二抗(1 ∶5 000稀釋)孵育2 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)條帶。通過GAPDH免疫印跡法驗(yàn)證樣品的等載量。用圖像測量軟件對譜帶強(qiáng)度進(jìn)行量化。

1.5 肺組織學(xué)評價小鼠左肺用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片厚3～4 μm。肺切片用HE染色和Masson三色染色進(jìn)行檢測。炎癥評分如前所述[9]。支氣管周圍和血管周圍炎癥的程度由主觀評分0到3來評估。當(dāng)檢測不到炎癥時，判定值為0；偶爾有炎性細(xì)胞纏繞時，值為1；炎性細(xì)胞包圍大多數(shù)支氣管或血管時，值為2；當(dāng)大多數(shù)支氣管或血管被一層厚的(超過5個細(xì)胞)炎性細(xì)胞包圍時，值為3。全肺炎癥定義為支氣管周圍和血管周圍炎癥評分的平均值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)BALF中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平使用ELISA試劑盒進(jìn)行分析。

1.7 定量實(shí)時PCR(RT-PCR)使用TRIzol從肺組織中提取RNA。使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)換為cDNA。所有實(shí)時PCR反應(yīng)均使用7300實(shí)時PCR系統(tǒng)進(jìn)行。以GAPDH為管家基因，用比較ΔΔCT法計算mRNAs的相對表達(dá)水平。使用引物序列見表1所示。

表1 引物序列

1.8 RNA測序與功能富集分析使用TRIzol從肺組織中分離總RNA。使用Agilent 2200 TapeStation評估RNA完整性。RIN評分>7的純化RNAs進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，然后使用NEBNext?UltraTMII RNA 文庫制備試劑盒進(jìn)行接頭連接和低周期富集。使用安捷倫2200 TapeStation和Qubit?2.0對純化后的文庫進(jìn)行評估，然后稀釋至10 pmol/L，在對端流動細(xì)胞上原位生成簇，并在HiSeq3000上進(jìn)行測序(2×150 bp)。清除低質(zhì)量以及包含適配器和poly-N序列的讀取后，獲得干凈的讀取數(shù)據(jù)。然后使用HISAT2默認(rèn)參數(shù)將讀取數(shù)據(jù)與小鼠參考基因組mm10對齊，通過HTseq轉(zhuǎn)換為每個基因模型的讀取計數(shù)。差異表達(dá)通過DEseq評估，以讀取計數(shù)為輸入，進(jìn)行Benjamini-Hochberg多重測試校正。差異表達(dá)基因(DEGs)以折疊變化>2和校正P<0.05為閾值進(jìn)行篩選。利用RNAhybrid (https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)對ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了預(yù)測。

1.9 雙熒光素酶報告分析將Lnc RNA RP11-20G6.3和TLR4克隆到pisCHECK載體中，產(chǎn)生熒光素酶報告系統(tǒng)。通過LipofectamineTM3000介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將每孔100 ng報告系統(tǒng)和100 nmol/L mmu-miR-34c-5p試劑轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞。 8 h后用完整培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞，使用Veritas 9100-002工具測量熒光素酶活性，并標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析采用Studentt檢驗(yàn)、雙因素方差分析(ANOVA)和Dunnett檢驗(yàn)。RP11-20G6.3表達(dá)與FEV1/用力肺活量的比值(forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，F(xiàn)EV1%)、Col1a1的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR4缺乏減輕COPD小鼠的氣道炎癥和重塑為了確定TLR4在COPD中的潛在作用，首先分析了野生型(WT)COPD小鼠肺組織中的表達(dá)，并檢測到TLR4蛋白(t=11.264，P<0.001)和mRNA(t=4.312，P=0.003)水平高于對照小鼠(圖1A、1B)。在COPD模型中，與WT小鼠相比， TLR4-/- 小鼠肺組織炎癥減弱，肺組織NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)降低(圖1C、1D)。與這些一致， TLR4-/- 小鼠BALF中炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平低于WT小鼠(圖1E)。觀察COPD氣道結(jié)構(gòu)慢性重塑的特征性變化。如圖2A、2B所示，WT組小鼠支氣管周圍三色染色(Masson's trichrome)面積大于 TLR4-/- 小鼠(t=3.910，P=0.007)。這些結(jié)果提示TLR4是引發(fā)COPD小鼠的氣道炎癥和重塑的重要因素。

圖1 TLR4缺乏減輕COPD小鼠氣道炎癥A：WT對照和COPD小鼠的肺組織中TLR4蛋白水平；B：WT對照和COPD小鼠的肺組織中TLR4 mRNA水平；C：WT和 TLR4-/- COPD小鼠肺組織代表性HE染色及炎癥評分 ×100；D：WT和 TLR4-/- COPD小鼠肺組織NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)；E：WT和 TLR4-/- COPD小鼠BALF中炎癥因子水平；與Con組比較：**P<0.01，***P<0.001；與WT組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

圖2 TLR4缺乏減輕COPD小鼠氣道重塑A：肺組織中Masson三色染色(黃色箭頭表示膠原沉積) ×100；B：以Masson三色染色的支氣管周圍區(qū)域來量化皮下纖維化的程度；與WT組比較：**P<0.01

2.2 RP11-20G6.3在COPD中的異常表達(dá)WT-Con和WT-COPD小鼠的轉(zhuǎn)錄組分析顯示621個差異表達(dá)的lncRNAs(DELs)和2 601個差異表達(dá)的基因/mRNAs(DEGs)。在這些DEGs中，328個lncRNAs上調(diào)，293個下調(diào)，而1 897個和704個mRNAs分別上調(diào)和下調(diào)。類似地，在WT-COPD和 TLR4-/- -COPD小鼠之間，124個lncRNAs和511個mRNAs上調(diào)，158個lncRNAs和899個mRNAs下調(diào)。然后預(yù)測DELs和DEGs之間的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，KEGG途徑分析表明NF-κB途徑和TLR途徑富集(圖3A)。RP11-20G6.3是常見的差異表達(dá)lncRNAs之一；進(jìn)一步RT-qPCR驗(yàn)證表明，RP11-20G6.3是TLR4調(diào)節(jié)動物中差異表達(dá)最大的LncRNA(圖3B)。為了確定RP11-20G6.3表達(dá)是否與COPD相關(guān)，并確定其與氣道重塑的可能相關(guān)性，進(jìn)行了RT-qPCR。RP11-20G6.3在COPD患者的肺組織中上調(diào)，并與FEV1%相關(guān)(ρ=0.549，P=0.047)(圖4A、4B)。這些結(jié)果表明，隨著COPD的進(jìn)展，RP11-20G6.3水平升高，其在病變組織中的上調(diào)依賴于TLR4。

圖3 COPD后RP11-20G6.3上調(diào)，與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)A：KEGG通路分析WT-Con、WT-COPD和 TLR4-/- COPD小鼠的DELs和DEGs；B：WT-Con、WT-COPD和 TLR4-/- COPD小鼠肺組織的LncRNA水平；與WT-Con組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與WT-COPD組比較：##P<0.01

圖4 RP11-20G6.3在COPD患者中表達(dá)較高A：qRT-PCR檢測非吸煙者(n=5)、吸煙者(n=5)和COPD患者(n=10)肺組織中RP11-20G6.3的表達(dá)；B：RP11-20G6.3表達(dá)與FEV1%的Spearman相關(guān)分析；與非吸煙者組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 RP11-20G6.3逆轉(zhuǎn)TLR4缺乏減輕COPD小鼠氣道炎癥和重塑為了確定RP11-20G6.3在氣道重塑發(fā)病機(jī)制中的潛在作用，將RP11-20G6.3質(zhì)粒滴鼻給于 TLR4-/- -COPD小鼠。與其他組相比，加入RP11-20G6.3質(zhì)粒增加了肺組織RP11-20G6.3水平(圖5A)。HE染色顯示，RP11-20G6.3質(zhì)粒干預(yù)后 TLR4-/- 小鼠肺組織炎癥增強(qiáng)(t=3.952，P=0.007)，支氣管周圍Masson三色面積增加(t=4.062，P=0.004)，并且BALF中炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平提高(圖5B-5D)。因此，RP11-20G6.3介導(dǎo)TLR4誘導(dǎo)的COPD小鼠氣道炎癥和重塑。

圖5 RP11-20G6.3逆轉(zhuǎn)TLR4缺乏減輕COPD小鼠氣道炎癥和重塑A：qRT-PCR檢測小鼠肺組織中RP11-20G6.3的表達(dá)；與WT組比較：△△P<0.01；與 TLR4-/- 組比較：###P<0.001；B：經(jīng)RP11-20G6.3處理的 TLR4-/- COPD小鼠肺組織代表性HE染色及炎癥評分 ×100；C：經(jīng)RP11-20G6.3處理的 TLR4-/- COPD小鼠肺組織代表性Masson三色染色及纖維化的程度(黃色箭頭表示膠原沉積) ×100；D：經(jīng)RP11-20G6.3處理的 TLR4-/- COPD小鼠BALF中炎癥因子水平；a：WT組；b：TLR4-/-組；c：TLR4-/-+pcDNA3.1-NC組；d：TLR4-/-+pcDNA3.1-20G6.3組；與 TLR4-/- +pcDNA3.1-NC組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.4 RP11-20G6.3海綿miR-34c-5p上調(diào)Col1a1使用RNAhybrid預(yù)測了靶向RP11-20G6.3的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)RP11-20G6.3海綿miR-34c-5p上調(diào)Col1a1。使用在線生物信息數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA靶點(diǎn)，并確定miR-34c-5p在RP11-20G6.3 mRNA中具有相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)(圖6A)。miR-34c-5p與RP11-20G6.3之間的關(guān)系通過熒光素酶報告基因檢測進(jìn)行驗(yàn)證。如圖6B所示，miR-34c-5p抑制WT控制的熒光素酶報告活性(t=7.837，P<0.001)，但不抑制突變型RP11-20G6.3啟動子的活性。miR-34c-5p與Col1a1 mRNA的3UTR相互作用(圖6C)。miR-34c-5p還抑制Col1a1啟動子報告基因的熒光素酶活性(t=4.124，P=0.002)(圖6D)。因此，RP11-20G6.3和Col1a1的3'-UTR序列是miR-34c-5p的直接靶點(diǎn)。此外，COPD患者的Col1a1水平升高，并與RP11-20G6.3呈正相關(guān)(ρ=0.936，P<0.001)(圖6E、6F)。總之，RP11-20G6.3在COPD中充當(dāng)miR-34c-5p的ceRNA，并通過海綿作用使后者上調(diào)Col1a1。

圖6 RP11-20G6.3海綿miR-34c-5p上調(diào)COPD后Col1a1A、B：RP11-20G6.3 mRNA的miR-34c-5p結(jié)合序列(A)及測定熒光素酶活性(B)；C、D：Col1a1 mRNA的miR-34c-5p結(jié)合序列(C)及測定熒光素酶活性(D)；E：qRT-PCR檢測非吸煙者(n=5)、吸煙者(n=5)和COPD患者(n=10)肺組織中Col1a1的表達(dá)；F：RP11-20G6.3表達(dá)與Col1a1的Spearman相關(guān)分析；與NC或非吸煙者組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

COPD因其復(fù)雜的病理機(jī)制，目前尚無有效的治療方法。氣道炎癥和重塑是COPD呼吸系統(tǒng)損傷的重要因素[10]。目前認(rèn)為氣道壁損傷和修復(fù)的重復(fù)循環(huán)引起的慢性炎癥最終導(dǎo)致氣道重塑[11]。本研究顯示，TLR4在COPD中上調(diào)，其缺乏可通過下調(diào)肺組織NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)來減輕COPD小鼠BALF中炎癥因子釋放，并減輕氣道纖維化的程度。這些結(jié)果與先前的研究[2]結(jié)果一致，即TLR4的下調(diào)可以減輕炎癥并阻止COPD后的氣道重塑。NF-κB家族是研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，因?yàn)樗谘装Y相關(guān)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[12]。它們可以通過N端DNA結(jié)合域形成同源二聚體和異二聚體，并與κB位點(diǎn)的各種相關(guān)靶DNA序列結(jié)合以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。TLR4是先天性免疫反應(yīng)中的一個關(guān)鍵分子，它識別PAMPs(主要是LPS)，激活NF-κB途徑，這可能是其參與COPD炎癥和氣道重塑的最重要信號[2]。

LncRNAs調(diào)節(jié)各種病理狀態(tài)下的炎癥反應(yīng)，其異常表達(dá)是多種肺部疾病的分子標(biāo)志，提示lncRNAs在這些肺部疾病的發(fā)病機(jī)制中具有潛在的作用[13]。研究[14]表明，lncRNA-NEAT1在肺炎中通過海綿miR-193a-3p介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥損傷。先前的研究[15]表明，差異表達(dá)的lncRNAs和miRNAs之間的相互作用可能為確定COPD全新的治療靶點(diǎn)提供了新的思路。此外，最近研究[16]顯示，NNT-AS1基因敲除可阻斷香煙煙霧提取物對細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥和氣道重塑的抑制作用。與這些發(fā)現(xiàn)一致，RP11-20G6.3在COPD患者和WT-COPD小鼠肺組織中異常上調(diào)，并與COPD患者的FEV1%相關(guān)，而強(qiáng)制表達(dá)RP11-20G6.3則加重了TLR4缺失的藥理抑制作用。因此，RP11-20G6.3是TLR4誘發(fā)COPD氣道炎癥、重塑的重要介質(zhì)。

大量證據(jù)支持LncRNAs通過多種機(jī)制靶向miRNAs間接調(diào)控基因表達(dá)，從而改變了多種生物過程[6]。它們可以充當(dāng)miRNA海綿(也稱為ceRNAs)，與miRNAs競爭靶mRNAs，被加工成miRNA，并將miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到靶mRNAs。在COPD中發(fā)現(xiàn)了多種ceRNAs。例如，Mei et al[16]報道了lncRNA-NNT-AS1通過靶向miR-582-5p來促進(jìn)香煙煙霧提取物對細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥和氣道重塑的作用。同樣，本研究表明RP11-20G6.3/miR-34c-5p/Col1a1 ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)COPD氣道重塑。膠原蛋白是一種主要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，而I型膠原尤其在炎癥中起著信號分子的作用。Zhang et al[17]研究發(fā)現(xiàn)，I型膠原通過增加ROS水平刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的募集和聚集，以及促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Molokanova et al[18]發(fā)現(xiàn)，I型膠原缺乏減弱受損肝臟的炎性細(xì)胞活化/募集。本研究在COPD患者的肺組織標(biāo)本中檢測到較高的Col1a1水平，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了其作為RP11-20G6.3下游信號與COPD氣道炎癥和重塑的關(guān)系。

總之，TLR4/NF-κB將COPD損傷信號傳遞并激活下游RP11-20G6.3/miR-34c-5p/ Col1a1的ceRNA網(wǎng)絡(luò)觸發(fā)氣道炎癥、重塑。