Angiopep-2 修飾紅景天苷/淫羊藿苷脂質體的處方優(yōu)化及對N2a 細胞主動靶向性的考察

張新悅，嚴德康，耿宏俠，王宇佳，李學濤

（遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）作為危害老年人健康的第四大“殺手”，對老年人健康和生活質量造成巨大威脅[1]。中醫(yī)藥所提出的“補腎填髓”[2]理論，認為“腎主骨生髓，腦為髓之?！保ㄟ^滋養(yǎng)補腎可以起到改善腦部機能的作用。補腎藥淫羊藿具有補腎強筋、保護中樞神經(jīng)元的作用[3]；紅景天作為抗氧化藏藥[4]，可以有效抑制腦內過氧化物的生成。兩藥聯(lián)用可協(xié)同增加藥效。

但淫羊藿苷在水中的溶解性差，生物利用度低[5]，絕大部分藥物不能進入腦組織中；紅景天苷主要通過肝腎代謝，代謝速度快，腦中的含量更是微乎甚微[6]。脂質體作為一種新型納米給藥載體[7]，可同時包載親水性和疏水性藥物，解決藥物溶解性差等問題，但同時脂質體的被動靶向效率較低，本實驗通過將腦靶向短肽Angiopep-2（TFFYGGSRGKRNNFKTEEY）[8]修飾在脂質體表面，來增強腦部細胞對藥物的攝取。

本研究通過制備Angiopep-2 修飾的紅景天苷和淫羊藿苷脂質體，采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)選出最佳處方，并選用小鼠神經(jīng)瘤母細胞[9]來考察Angiopep-2 的主動靶向能力，為該制劑后續(xù)在體內外進一步研究提供了基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

2010AHT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；DZKW-S-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；RE52C 型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JY92-2D 型超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；葡聚糖凝膠（Sepha-dex）G50柱（上海華藍化學科技有限公司）；YA1072 型透析袋MD34（8000 ～14000D）（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿苷（Ica，批號：J0703A，純度≥98%）、紅景天苷（Sal，批號：A0902AS，純度≥98%）、柔紅霉素（DNR，批號：28008-55-1，純度≥98%）、膽固醇（Chol，批號：F0119A）、pH7.4 磷酸緩沖鹽溶液（批號：1022Q021）均購于大連美侖生物技術有限公司；Angiopep-2（上海楚肽生物科技有限公司）；蛋黃卵磷脂（EPC，批號：120015）、DSPEPEG2000、DSPE-PEG2000-NH2均購于日本NOF 公司；DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司；甲醇、乙腈均為色譜純。

1.3 細胞

小鼠神經(jīng)瘤母細胞（N2a）購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備

采用薄膜分散法-硫酸銨水化法制備。精密稱取 適 量 的DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-NH2、蛋黃卵磷脂、膽固醇、淫羊藿苷、甲醇于圓底燒瓶中，減壓旋蒸，直至生成薄膜。加入濃度為250 mm硫酸銨水溶液5 mL 將薄膜溶解，于超聲波細胞搗碎機中處理10 min 后，過0.22 μm 微孔濾膜。再將脂質體裝入透析袋中，放入盛有PBS 溶液的燒杯中避光透析24 h，每8 h 更換1 次PBS。24 h 后，稱取適量紅景天苷置于圓底燒瓶中，加入甲醇旋蒸成膜，將透析好的脂質體倒入裝有紅景天苷的圓底燒瓶中，于40℃水浴條件下振搖20 min，即得紅景天苷/淫羊藿苷脂質體。精密稱取2 mg Angiopep-2，溶解于紅景天苷/淫羊藿苷脂質體中，室溫攪拌4 h,即得Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體。按上述制備方法，除不加入紅景天苷、淫羊藿苷外，同法制得空白脂質體。

2.2 包封率測定方法的建立

2.2.1 溶液的制備 （1）空白溶液：取1 mL 空白脂質體與4 mL 甲醇混勻，超聲破乳，即得。（2）供試品溶液：取1 mL Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體與4 mL 甲醇混勻，破乳即得。（3）紅景天苷對照品溶液：精密稱定紅景天苷10 mg，加甲醇制成1 mg/mL 母液，加適量甲醇稀釋成0.5 mg/mL紅景天苷對照品溶液。（4）淫羊藿苷對照品溶液：精密稱定淫羊藿苷 10 mg，加甲醇制成1 mg/mL 母液，加適量甲醇稀釋成0.4 mg/mL 淫羊藿苷對照品溶液。

2.2.2 紅景天苷的色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（20 ∶80，V/V）；柱溫：30℃；檢測波長：275 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2.3 淫羊藿苷的色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（25 ∶75，V/V）；柱溫：30℃；檢測波長：275 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2.4 標準曲線的建立 取“2.2.1”項下紅景天苷母液，加甲醇稀釋成720、600、480、360、180、90 μg/mL，淫羊藿苷母液稀釋成480、400、320、200、120、60 μg/mL，按相應的色譜條件進行測定，以藥物濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得紅景天苷回歸方程為Y= 2 122.2X+110 321（R2= 0.999 5），淫 羊 藿 苷 為Y=19 344X+288 198 （R2= 0.999 7），表明紅景天苷在90 ～ 720 μg/mL、淫羊藿苷在60 ～ 480 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.2.5 專屬性試驗 取“2.2.1”項下空白溶液、供試品溶液、紅景天苷對照品溶液、淫羊藿苷對照品溶液各適量進行測定，結果待測成分峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，輔料對其無干擾，表明該方法專屬性好。

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，測定6 次。結果，紅景天苷與淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.32%、0.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體，按“2.2.1”項制備供試品溶液。結果紅景天苷與淫羊藿苷峰面積的RSD 分別為0.96%、0.94%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.1”項下供試品溶液，在 0、2、4、8、12、24 h 分別測定。結果紅景天苷與淫羊藿苷峰面積的RSD 分別為0.62%、1.17%（n＝6），表明溶液在24 h 之內穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 按“2.1”項下方法制備Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體，平行制備6 份，加入等體積甲醇，即得破乳液。將已知成分含量的破乳液與相應對照品溶液按 1 ∶1（m/m）混勻，進行測定，計算藥物含量。結果紅景天苷與淫羊藿苷的平均加樣回收率為102.5%、101.56%，RSD為1.7%、0.78%（n＝6），表明該方法準確度良好。

2.3 包封率的測定

取適量的Sephadex G50 凝膠柱用PBS 浸泡至溶脹后備用，將Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體1 mL 以1 mL/min 的流速進行洗脫，目的是使未包裹進去的水溶性藥物與脂質體溶液分離，觀察直至流出溶液為乳光，開始收集，加PBS 定容至5 mL，取等體積甲醇破乳后，另取Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體1 mL，PBS 定容即得，均過0.45 μm 微孔濾膜。

按照“2.2.2”和“2.2.3”項下條件進行測定，依據(jù)標準曲線計算紅景天苷和淫羊藿苷的含量，通過含量分別計算紅景天苷和淫羊藿苷的包封率：包封率（%）=Wa/Wb，Wa代表紅景天苷（或淫羊藿苷）過柱后的含量，Wb代表過柱前的含量。

2.4 處方優(yōu)化

采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)選出Angiopep-2修飾紅景天苷/淫羊藿苷脂質體的最佳處方。根據(jù)實驗室以往經(jīng)驗[10]及文獻調研[11]，篩選出膽固醇用量（A）、紅景天苷用量（B）、超聲溫度（C）三個因素，考察其對包封率的影響。以包封率加權值（Y）為考察指標，Y＝50% ×（Y1+Y2），其中，Y1表示紅景天苷的包封率，Y2表示淫羊藿苷的包封率。固定EPC 的用量為33 mg，處方量為5 mL，紅景天苷與淫羊藿苷的質量比為1 ∶1 的條件下確定各因素的范圍區(qū)間（A：2 ～10 mg；B：0.5 ～1.5 mg；C：40 ～60℃），每因素平均篩選出三水平。因素與水平見表1，Box-Behnken 試驗設計與結果見表2。

表1 因素與水平Tab. 1 Factors and levels

根據(jù)表2 結果，通過Design Expert 8.0.6 軟件得到了Y的擬合方程：Y＝89.92 + 9.79A- 1.97B+ 0.49C+4.71AB+ 6.02AC- 6.66BC- 11.96A2- 7.27B2- 0.99C2（R2＝0.928 9，P＜0.05）。由此表明，該擬合模型可較好地反映響應值Y的變化，可用于篩選Angiopep-2修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體的最佳處方。對模型進行方差分析，結果見表3?？芍狝、AC、BC、A2、B2項對Y有顯著影響（P＜0.05），而B、C、AB、C2項影響不顯著（P＞0.05）。保持其中任一因素水平不變，即可看出其余因素對包封率的影響，見圖1。曲線越陡，對包封率影響越大，由圖1 可見，A、B兩因素對響應值Y的影響較大，C對其影響較小。

圖1 各因素對包封率影響的等高線和響應面圖Fig. 1 Contour and response surface graph of the effects of each factor on encapsulation efficiency

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Tab. 2 Design and results of Box-Behnken

表3 方差分析結果Tab. 3 Analysis results of variance

根據(jù)本課題組前期研究經(jīng)驗及處方優(yōu)選結果，確定Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體的最佳處方為蛋黃卵磷脂33 mg，膽固醇6 mg，紅景天苷1.0 mg，淫羊藿苷1.0 mg，超聲溫度為60 ℃，超聲功率為500 W，處方量為5 mL，預測平均包封率為95.76%。按照該處方量制備3 批脂質體，測定其包封率，進行處方驗證，得到紅景天苷的包封率為（90.85 ± 1.83）%，淫羊藿苷的包封率為（92.59 ±1.20）%，表明該處方合理、方法可行。

2.5 對N2a 細胞主動靶向性考察

2.5.1 熒光脂質體的制備 采用薄膜分散法-硫酸銨水化法制備。精密稱取適量的DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-NH2、蛋黃卵磷脂、膽固醇、甲醇于圓底燒瓶中，減壓旋蒸，直至生成薄膜。加入濃度為250 mM 的硫酸銨水溶液5 mL 將薄膜溶解，超聲處理10 min 后，裝入透析袋中避光透析24 h，每8 h更換1 次PBS。24 h 后，稱取適量的熒光探針柔紅霉素置于圓底燒瓶中，加入甲醇旋蒸成膜，將透析好的脂質體倒入裝有柔紅霉素的圓底燒瓶中，于40 ℃水浴條件下振搖20 min，即得柔紅霉素脂質體（DNRLip）。精密稱取2 mg Angiopep-2，溶解于柔紅霉素脂質體中，室溫攪拌4 h,即得Angiopep-2 修飾的柔紅霉素脂質體（Ang-DNR-Lip)。按上述制備方法，除不加入柔紅霉素外，即得空白脂質體（Blank-Lip）。稱取適量柔紅霉素溶解于水中，即得游離柔紅霉素溶液（Free DNR）。

2.5.2 細胞培養(yǎng) 使N2a 細胞貼壁生長在培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM 培養(yǎng)液（10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗），置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）。待細胞融合度長到95%以上時，胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)液終止消化，離心，吸取上清液，加適量培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

2.5.3 熒光顯微鏡考察脂質體的主動靶向性 由于紅景天苷和淫羊藿苷都不具有熒光性，所以選用具有熒光性的柔紅霉素作為熒光探針,給藥濃度為20 μm。將N2a 細胞以5×103個/孔的數(shù)量接種到48孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)孵育使其貼壁。給藥時間為1、2、4 h，分別加入Blank-Lip、DNR-Lip、Ang-DNR-Lip及Free DNR，繼續(xù)孵育3 h 后，用PBS 緩沖液沖洗，每孔用500 μL 4%的多聚甲醛固定10 min，沖洗掉多余溶液，加入500 μL DAPI 染色液避光15 min，將細胞于熒光顯微鏡下觀察各孔細胞的熒光強度，并拍照記錄。

空白脂質體組未見紅色熒光。由于柔紅霉素會進入到細胞核中，所以游離柔紅霉素的紅色熒光強度最強。使用Image J 軟件對圖片進行熒光強度統(tǒng)計，數(shù)據(jù)采用柱狀圖表示，見圖2。多組間比較采用方差分析，以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。與DNR-Lip組相比，Ang-DNR-Lip 組熒光強度增強（P＜ 0.05），表明該脂質體經(jīng)過 Angiopep-2 修飾后，對N2a 細胞的主動靶向性增強。通過對1、2、4 h 熒光強度進行比較，可知隨著攝取時間的增加，Ang-DNR-Lip 組的熒光強度依次增強。

圖2 熒光顯微鏡下觀察不同時間段不同脂質體組對N2a 細胞的熒光強度 （n = 3）Fig. 2 Fluorescence intensity of different liposome groups on N2a cells at different time periods observed under fluorescence microscope（n = 3）

3 討論

本實驗主要考察了膽固醇用量、紅景天苷用量、超聲溫度對脂質體包封率的影響。主要膜材成分膽固醇的加入可以使磷脂雙分子層的膜固化，但超過一定限度，會導致脂質體成膜不牢固，藥物滲漏率增加。由于脂質體獨特的雙分子層結構，脂溶性藥物比水溶性藥物更容易包封，所以主要考察水溶性藥物紅景天苷的用量對包封率的影響，實驗表明，當紅景天苷用量為1.0 mg 時，包封率較高；紅景天苷用量為1.5 mg時，反而下降，因為當水溶性藥物超過脂質膜飽和限度時[13]，阻礙了藥物進入脂質雙分子層中，所以并非藥物用量越高，包封率越好。超聲溫度在60 ℃時包封率較高，溫度過低會造成成膜時間過長且不均勻。

優(yōu)化后得到的Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體的最佳處方包封率較高，都在90%以上，結果符合2020 年版《中國藥典》規(guī)定[13]，說明該實驗設計科學合理。

在細胞攝取實驗中，經(jīng)Angiopep-2 修飾后脂質體組對N2a 細胞的攝取能力明顯高于脂質體組，表明藥物成功與受體特異性識別和結合。Angiopep-2作為一種新型的腦靶向短肽，是以受體介導的轉運機制與血腦屏障上的低密度脂蛋白受體相關蛋白-1（LRP-1）特異性結合，將藥物以內吞的方式，輸送至腦組織，提高了脂質體的主動靶向性。Angiopep-2通過與DSPE-PEG2000 交聯(lián)，不但可以使藥物精準作用于病變部位，還延長了藥物作用的時間，維持病變部位藥物濃度穩(wěn)定。肽鍵的不穩(wěn)定性也是影響Angiopep-2 靶向遞藥的關鍵，目前，對Angiopep-2的修飾通常以PEG 修飾，減小藥物在體內的首過效應，延長藥物的作用時間，從而達到治療的效果。

4 結論

本研究制備了Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質體，并通過星點設計-響應面法確定了最優(yōu)處方，經(jīng)驗證脂質體包封率較高，改善了兩種藥物共載包封率較低的問題。將靶向材料Angiopep-2修飾在脂質體上明顯提高了腦部細胞對兩種藥物的攝取能力，改善了藥物不能有效達到病變區(qū)域的問題，為后續(xù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其它腦部疾病的治療與研究奠定了基礎。