桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應(yīng)成分指數(shù)構(gòu)建

李永生，楊媛媛，胡 靜，任 慧，崔小敏，曲 彤，李 寧，陳志永*

（1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會(huì)醫(yī)院 藥劑科，陜西 西安 710054；2. 陜西省中醫(yī)藥研究院 中藥所，陜西 西安 710003；3. 西安市食品藥品檢驗(yàn)所 中藥室，陜西 西安 710054）

桑白皮為?？浦参锷orus albaL.的干燥根皮，具有瀉肺平喘、利水消腫等功效[1]。桑白皮中主要含有生物堿類、黃酮類、芪類、多糖類等成分[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑白皮及其活性成分具有降壓[3]、降糖[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等功效。張冉等[7]應(yīng)用α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型篩選30 味常用清熱解表中藥的降血糖活性，發(fā)現(xiàn)鴨跖草、山慈菇和桑葉具有較好的降糖活性。而本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)桑葉同源中藥桑白皮由于含有更多的異戊烯基黃酮類成分（桑根酮C、桑辛素等），其降糖活性優(yōu)于桑葉[4]，同時(shí)兼具顯著抗炎、抗氧化活性，使桑白皮成為近年來治療糖尿病及其并發(fā)癥領(lǐng)域的熱門中藥[8-9]。2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）收載桑白皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括性狀鑒別、橫切面鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別，未收載桑白皮含量測(cè)定。段志濤等[10]建立了桑白皮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)包括薄層鑒別和含量測(cè)定，能較為全面反映桑白皮質(zhì)量狀況。KIM K等[11]建立了桑白皮中桑黃酮G 和桑辛素的HPLC 含量測(cè)定方法，該方法能夠區(qū)分不同產(chǎn)地的桑白皮樣品。但現(xiàn)有桑白皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在與臨床應(yīng)用結(jié)合不緊密，指標(biāo)性成分選取不合理，無法反映不同成分對(duì)藥材整體藥效的貢獻(xiàn)度差異等問題。

效應(yīng)成分指數(shù)由肖小河課題組首次提出，即根據(jù)不同藥效成分生物活性的強(qiáng)弱，賦予不同藥效成分不同權(quán)重，不同藥效成分的權(quán)重乘以相應(yīng)藥效成分的含量的加和即為效應(yīng)成分指數(shù)，該指數(shù)僅通過測(cè)定成分的量便能體現(xiàn)藥材的效[12-13]。構(gòu)建桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應(yīng)成分指數(shù)有望緩解現(xiàn)行桑白皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在的問題，實(shí)現(xiàn)不同批次桑白皮降糖活性的質(zhì)量評(píng)價(jià)。本研究采用譜效關(guān)系的方法選擇了桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應(yīng)成分，采用高效液相色譜法測(cè)定了指標(biāo)性成分含量，并構(gòu)建了效應(yīng)成分指數(shù)，對(duì)進(jìn)一步提升桑白皮質(zhì)量控制水平有一定的意義。

1 材料與儀器

10 批次桑白皮藥材樣品經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院陳志永副研究員鑒定，標(biāo)本存放于陜西省中醫(yī)藥研究院中藥所，樣品詳細(xì)信息見表1。桑皮酮H（批號(hào)：CHB170413）、氧化白藜蘆醇（批號(hào)：CHB1709-28）購(gòu)自成都Chroma 生物技術(shù)有限公司；1-脫氧野尻霉素（批號(hào)：17093302）、桑黃酮G（批號(hào)：16030604）、桑根酮C（批號(hào)：16092105）、桑辛素（批號(hào)：161109）購(gòu)自上海圻明生物技術(shù)有限公司，所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于等于98%。對(duì)硝基苯酚吡喃葡萄糖苷（PNPG，4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside）和α-葡萄糖苷酶（來自Saccharomyces cerevisiae）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。乙腈（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher 公司），水為超純水，其它試劑均為分析純。

表1 桑白皮樣品信息Tab. 1 Samples information of Cortex Mori

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置VWD 檢測(cè)器和Agilent ChemStation B.04.03 工作站（美國(guó)安捷倫科技公司）；KQ-100 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；BS210S 型電子分析天平（萬分之一）、BT25S 型電子分析天平（十萬分之一）（北京賽多利斯天平有限公司）。

2 方法

2.1 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性譜效關(guān)系研究

2.1.1 樣品制備 取桑白皮藥材樣品粉碎，過40 目篩。精密稱取10 批次桑白皮樣品粉末各2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇水溶液100 mL 超聲提取2 次，時(shí)間為30 min，合并兩次提取液，在55 °C減壓蒸干。取30.0 mg 提取物，用70%甲醇水溶液溶解，并定容于5 mL容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，用于桑白皮指紋圖譜研究。取提取物20.0 mg 用于α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定。

2.1.2 桑白皮指紋圖譜研究 采用Agilent 5 TC-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）進(jìn)行色譜分析[14]。流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序?yàn)椋? ～ 15 min，5%→15%A；15 ～ 70 min，15%→25%A；70 ～ 90 min，25%A；流速為1.0 mL/min；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量為10 μL。10 批次桑白皮樣品的指紋圖譜見圖1。

圖1 桑白皮樣品高效液相指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprint of Cortex Mori samples

2.1.3 桑白皮中1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定 精密稱取“2.1.1”項(xiàng)下制備的桑白皮提取物20.0 mg，精密加入0.05 mol/L 鹽酸溶液4 mL，超聲提取30 min，補(bǔ)足失重，13 000 r/min 離心10 min。取2 mL 上清液，與4 mL 硼酸鹽緩沖液（pH = 8.5）混合，之后加入2 mL 乙腈溶解的FMOC-CL（10 mmol/L）溶液，在20℃下反應(yīng)20 min。加入0.1 mL 甘氨酸 （1 mol/mL）溶液中和過量的FMOC-CL，加入1.9 mL 0.1% 乙酸水溶液用于使衍生物DNJ-FMOC 處于穩(wěn)定狀態(tài)。溶液過0.45 μm 微孔濾膜，用于含量測(cè)定。桑白皮提取物中1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定的色譜條件參考相關(guān)研究[15]。色譜分離在Inertsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）上進(jìn)行。乙腈-0.1%乙酸水溶液（60 ∶40）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為15 μL。

2.1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定方法參考本課題組之前研究[4]。50 μL 桑白皮提取物溶液與50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.25 U/mL）混合，37℃下孵育10 min，加入100 μL溶于磷酸鉀緩沖液的PNPG （5 mmol/L），繼續(xù)在37℃下反應(yīng)10 min，之后加入1 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。405 nm 下測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制率。采用阿卡波糖（10 μg/mL）作為陽性對(duì)照。

2.1.5 譜效關(guān)系研究 將桑白皮提取物指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊等處理。將不同批次樣品指紋圖譜峰面積、1-脫氧野尻霉素含量、α-葡萄糖苷酶抑制活性數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerLynxxs（Waters，Milford，MA，USA）軟件，采用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）得到造成α-葡萄糖苷酶抑制活性差異的化學(xué)成分。

2.2 桑白皮中5 種成分含量測(cè)定

樣品制備和含量測(cè)定方法參考本課題組之前研究[14]。取桑白皮藥材樣品粉碎，過40 目篩。精密稱取不同批次樣品粉末各1.0 g 置于100 mL 具塞錐形瓶中，70%甲醇水溶液50 mL 超聲（250 W, 40 kHz）提取30 min，補(bǔ)足失重，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，0.45 μm 微孔濾膜即得供試品。精密稱取氧化白藜蘆醇、桑根酮C、桑黃酮G、桑皮酮H、桑辛素適量，加入70%甲醇水溶液中制成濃度依次為0.812 mg/mL、0.100 mg/mL、0.105 mg/mL、0.095 0 mg/mL、0.045 8 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。色譜條件同“2.1.2”項(xiàng)下條件。

2.3 效應(yīng)成分指數(shù)構(gòu)建

根據(jù)譜效關(guān)系研究結(jié)果選取效應(yīng)成分。效應(yīng)成分指數(shù)（ECI）的構(gòu)建方法參考本課題組前期研究[16]，其計(jì)算公式如下：

式中Wi為各效應(yīng)成分的藥效權(quán)重，Wi值越大代表該成分與藥效的相關(guān)性越強(qiáng)。Xi代表各成分在桑白皮中的含量。Wi的計(jì)算公式如下：

3 結(jié)果與分析

3.1 桑白皮提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性譜效關(guān)系研究

將桑白皮提取物指紋圖譜峰面積數(shù)據(jù)（X）、1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定數(shù)據(jù)（X）與提取物α-葡萄糖苷酶活性抑制數(shù)據(jù)（IC50，Y）進(jìn)行PLS-DA 分析，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。樣本經(jīng)分析得到兩個(gè)主成分的模型，模型的解釋度R2（X）為85.0%，R2（Y）為91.1%，預(yù)測(cè)度Q2為75.4%，說明該模型解釋能力和預(yù)測(cè)能力良好，見圖2。利用VIP 分析可以驗(yàn)證差異性變量，具有VIP 值大于1 的變量可以用來區(qū) 分 樣 本。 變 量var_3、var_12、var_4、var_19、var_15、var_7、var_20 和var_11 VIP 值大于1。通過篩除峰面積較小，以及峰形不規(guī)則的成分，最終采用標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)的方法確定變量var_3、var_12、var_4、var_19、var_15、var_7、var_20 和var_11 分 別 為 桑皮苷A、桑黃酮G、綠原酸、桑辛素、桑皮酮H、氧化白藜蘆醇、1-脫氧野尻霉素和桑根酮C。對(duì)8 個(gè)化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明桑黃酮G（IC50：13.38 μmol/L）、氧化白藜蘆醇（IC50：200.9 μmol/L）、桑辛素（IC50：85.91 μmol/L）、1-脫氧野尻霉素（IC50：10.80 μmol/L）、桑根酮C （IC50：26.78 μmol/L）和桑皮酮H （IC50：23.59 μmol/L）具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。作為陽性對(duì)照的阿卡波糖的IC50值為23.59 μmol/L，可見桑白皮中的幾種化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性較好。

圖2 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的PLS-DA 得分圖（A）和VIP 圖（B）Fig. 2 The PLS-DA score plot （A） and VIP plot （B） obtained from the groups of Cortex Mori against α-glucosidase inhibitory activity

表2 桑白皮譜效關(guān)系研究數(shù)據(jù)Tab. 2 Data of the spectrum-effect relationship of Mori Cortex

3.2 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的效應(yīng)成分指數(shù)構(gòu)建

根據(jù)譜效關(guān)系研究結(jié)果與體外活性篩選驗(yàn)證，選擇桑黃酮G、氧化白藜蘆醇、桑辛素、1-脫氧野尻霉素、桑根酮C 和桑皮酮H 作為桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應(yīng)成分。10 批次桑白皮中6 種成分的含量測(cè)定結(jié)果見表3。

將6 個(gè)效應(yīng)成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50值導(dǎo)入公式得各成分Wi，將各成分Wi導(dǎo)入效應(yīng)成分指數(shù)（ECI）計(jì)算公式：

將桑白皮中6 個(gè)成分的含量值帶入上述公式即得不同批次桑白皮的效應(yīng)成分指數(shù)值。從表3 可見，不同批次桑白皮中6 個(gè)成分含量差異較大，很難通過成分含量的多少鑒定藥材的優(yōu)劣。10 批次桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的效應(yīng)成分指數(shù)，通過該圖可以很清晰的看出6號(hào)藥材α-葡萄糖苷酶抑制活性最優(yōu)，見圖3。

表3 不同批次桑白皮中6 個(gè)活性成分的含量測(cè)定（mg/g，n = 3）Tab. 3 Quantification of six active components in different batches of Mori Cortex （mg/g，n = 3）

圖3 10 批次桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應(yīng)成分指數(shù)Fig. 3 ECI of ten batches of Cortex Mori samples against α-glucosidase

3.3 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應(yīng)成分指數(shù)的驗(yàn)證

將“2.1.1”項(xiàng)下所制備的不同批次桑白皮提取物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試。將活性實(shí)測(cè)值與效應(yīng)成分指數(shù)值進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明效應(yīng)成分指數(shù)值與藥材α-葡萄糖苷酶抑制活性的1/IC50顯著相關(guān)（R= 0.983），表明所建立的效應(yīng)成分指數(shù)能夠代表桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性。

4 討論

在建立效應(yīng)成分指數(shù)的過程中，效應(yīng)成分的選取是重中之重。本研究采用譜效關(guān)系結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，選擇桑黃酮G、氧化白藜蘆醇、桑辛素、1-脫氧野尻霉素、桑根酮C 和桑皮酮H 作為桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效應(yīng)成分。采用該6 種成分構(gòu)建的效應(yīng)成分指數(shù)，與不同批次藥材活性實(shí)測(cè)值顯著相關(guān)，表明其能夠代表桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性。采用體外活性測(cè)試的方法構(gòu)建效應(yīng)成分指數(shù)，具有穩(wěn)定、可控、重復(fù)性好等特點(diǎn)。然而，體外研究未考慮體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等過程，尚有改進(jìn)空間。

生物堿類成分1-脫氧野尻霉素為桑白皮中主要降糖成分，其為含氮雜環(huán)糖類，此類物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)域無吸收，且在一般的反相色譜柱上基本不保留。因此，常選用氨基柱分離，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。陳正收等[15]采用柱前衍生化的方法建立了桑白皮中1-脫氧野尻霉素的紫外檢測(cè)方法，采用FMOC-CL 衍生化后，其在反相色譜柱上具有較好的保留行為。在效應(yīng)成分指數(shù)構(gòu)建過程中，桑白皮中的黃酮類成分均采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行定量分析，為提高所構(gòu)建效應(yīng)成分指數(shù)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，對(duì)1-脫氧野尻霉素進(jìn)行了柱前衍生化，采用紫外檢測(cè)的方法進(jìn)行含量測(cè)定。

5 結(jié)論

構(gòu)建的效應(yīng)成分指數(shù)能較好地評(píng)價(jià)桑白皮樣品在α-葡萄糖苷酶抑制活性方面的質(zhì)量，利于提升桑白皮質(zhì)量控制水平，對(duì)推動(dòng)桑白皮在糖尿病治療領(lǐng)域的應(yīng)用具有一定的意義。