基于高通量測序篩選分枝(瓜)列當甜瓜寄生體系中的轉移miRNA

孫暢，姚兆群，曹小蕾，卞鵬軒，劉倩倩，趙思峰

(新疆綠洲農業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學農學院，新疆 石河子 832003)

甜瓜(CucumismeloL.)是重要的園藝類水果作物，其果實深受各國消費者喜愛，是新疆特色優(yōu)勢產業(yè)之一，2019年種植面積57.76 khm2，總產量達215.6萬t[1]。分枝(瓜)列當(PhelipancheaegyptiacaPers)是新疆部分甜瓜產區(qū)的主要威脅，輕者導致甜瓜大幅減產，嚴重時絕收[2-3]。瓜列當具有種子庫龐大、種子微小、休眠時間長及植株通過吸器與寄主植物維管束連接等特點，導致難以防治[4]。吸器是寄生植物連接寄主的橋梁和通道，具有連接、侵入并從寄主獲取各種物質的功能，同時也是寄生植物與寄主進行sRNAs、mRNAs、病毒、糖類、蛋白質等物質交流的場所[5-8]。目前對分枝(瓜)列當甜瓜寄生體系中miRNAs在吸器中的轉移情況及轉移miRNAs的功能了解較少。

microRNA(miRNA)是植物體內普遍存在的一類內源性單鏈20～40 nt非編碼RNA，其在植物生長發(fā)育、激素信號轉導及脅迫響應等方面的都發(fā)揮重要調控作用，甚至可跨界調控其他物種體內基因的表達[9-12]。Shahid等[6]報道菟絲子miRNA能通過吸器轉移到與其聯(lián)接的寄主的莖，并干擾寄主miRNA和phasiRNA表達。Betti等[9]發(fā)現(xiàn)施加外源miRNA可以引發(fā)靶基因的沉默和受體植物表型的改變。此外，在植物受病毒、真菌及昆蟲危害時，植物miRNA表達量會顯著改變，這些miRNA可能參與了植物免疫反應[13-15]。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)棉花miR159和miR166在感染黃萎病菌后轉移至大麗輪枝菌(V.dahliaeKleb)中，通過結合和沉默與毒力相關的蛋白HIC-15(異毛菌素C-15羥化酶)和CLP-1(Ca2+半胱氨酸蛋白酶)增強棉花對大麗輪枝菌的抗性。Wang等[17]研究表明小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici)的Pst-milR1在侵染小麥時轉移至小麥體內，通過結合Pr2參與跨域RNA干擾，從而降低小麥抗性。列當在寄生寄主植物的過程中不僅從寄主中吸取營養(yǎng)物質同樣也存在大分子物質和寄主基因的轉移[5,18]。本試驗以分枝(瓜)列當甜瓜寄生體系為研究對象，分別對寄生有瓜列當?shù)奶鸸细?、瓜列當寄生于甜瓜的寄生部位和列當莖稈取樣，以未接種列當?shù)奶鸸细繛閷φ?，進行sRNA測序，以期篩選出瓜列當在寄生甜瓜過程中的miRNA，為進一步揭示瓜列當?shù)募纳肿訖C制、甜瓜抗性分子機制及甜瓜抗性遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株甜瓜品種“黃旦子”種子購買于新疆昌吉市益豐種苗有限責任公司，瓜列當植株及種子采集于塔城地區(qū)額敏縣，已鑒定為分枝(瓜)列當。

1.2 植物處理和取樣

在混有蛭石和沙子(1∶1)基質的花盆(口徑：16 cm，高度：12.5 cm)中拌入瓜列當種子0.02 g，用水浸透，每盆播種1～2粒提前浸泡露白的甜瓜種子，以未拌入瓜列當種子處理作為對照，各10次重復。將播種好的各處理盆栽隨機擺放，置于溫室中培養(yǎng)(溫度28 ℃，光照度為10 000 lx，光照時長16 h·d-1，黑暗8 h·d-1)，正常澆水管理。于瓜列當剛出土時用蒸餾水迅速洗根進行取樣，分別選取被寄生的甜瓜根系(MR)、瓜列當寄生部位(MC)、寄生點上方2～3 cm的列當莖稈(MP)和未接種的對照甜瓜根部(MK)4部分，取樣時期與部位見圖1，各樣品3個重復，取樣后將樣品組織置于液氮中速凍后存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Small RNA文庫構建和測序

用EasyPure?Plant RNA 提取試劑盒(全式金公司)提取樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和完整性，并用超微量核酸蛋白分析儀定量檢測RNA的濃度。采用Small RNA Sample Pre Kit試劑盒(武漢錦奧生物科技有限公司)構建文庫，庫檢合格后交由北京諾禾致源科技股份有限公司使用Illumina SE50 進行sRNA測序。

A:生長45 d的對照甜瓜植株；B：生長45 d接種列當?shù)奶鸸现仓?；C：A圖洗根后的取樣圖示，MR：列當寄生甜瓜根；MC：列當寄生點；MP：列當莖稈。圖1 樣品取樣時期與部位

1.4 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Illumina Casava 1.8檢查數(shù)據(jù)錯誤率，堿基位置測序錯誤率低于0.5%視為合格。用Cutadapt 1.9.1(https:∥cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html)去除原始數(shù)據(jù)中含polyA/T/G/C、質量值sQ ≤20、未知堿基N的比例大于10%的低質量reads及接頭(5’端接頭5’-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3’;3’端接頭5’-AGATACGGAAGAGCACACGTCT-3’)序列，并對過濾后的clean reads進行18～22 nt長度篩選。采用bowtie 1.3.0(http:∥bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml)將長度篩選后的miRNA定位到甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(Melon v3.6.1 Genome)中進行比對，獲取已知miRNA的二級結構，各樣本中miRNA的序列、長度及表達量等信息。利用mirDeep2 2.0.0.2(https:∥github.com/rajewsky-lab/mirdeep2.gitmirdeep2.0.0.2)根據(jù)前體序列預測新miRNA并獲取其二級結構等信息。

1.5 miRNA篩選

篩選寄生甜瓜根(MR)、寄生部位(MC)、瓜列當莖稈(MP)及未寄生甜瓜根(MK)測序結果中同時存在的miRNA，至甜瓜基因組(Melon v3.6.1 Genome)中比對，選取mapping成功且測序結果表達量>10的miRNA，用bowtie2 2.3.4.1(http:∥bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)將其映射至瓜列當基因組(本課題組前期測序)中，從中篩選unmapping的miRNA，即甜瓜轉移至瓜列當?shù)膍iRNA。此外篩選寄生甜瓜根(MR)、寄生部位(MC)、瓜列當莖稈(MP)及未寄生甜瓜根(MK)測序結果中同時存在，而寄生甜瓜根(MR)中沒有的miRNA，將其在瓜列當基因組中進行比對，選取mapping成功且測序結果表達量>10的miRNA，利用bowtie2將其映射至甜瓜基因組(Melon v3.6.1 Genome)中，從中篩選unmapping的miRNA，即瓜列當轉移至甜瓜的miRNA。

1.6 qRT-PCR驗證

樣品總RNA經(jīng)DNase I處理后，利用RransScriptGreen miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒(全式金公司)合成cDNA，20 μL反應體系：Total RNA(100 ng·μL-1)2 μL；TransScript miRNA RT Enzyme Mix 1 μL；2×TS miRNA Reaction Mix 10 μL；RNase-free Water 7 μL。反應條件：37 ℃孵育1 h，85 ℃處理5 s。隨機選取差異miRNA，通過Primer 5.5.0(http:∥www.premierbiosoft.com/primerdesign/)軟件設計引物，引物詳情見表1。通過ABI Prism 7500定量PCR儀進行qRT-PCR，20 μL反應體系：cDNA 2 μL、2×PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 10 μL、特異性上游引物(10 μM)0.4 μL、Universal miRNA qPCR Primer(10 μM)0.4 μL、Passive Reference Dye(50×) 0.4 μL、Nuclease-free Water 6.8 μL。反應條件：94 ℃預變性30 s；94 ℃擴增5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)；95 ℃變性15 s，55 ℃復性15 s。以U6-3(LOC103502534)基因為內參[19]，每個樣品3個重復，采用 2-△△CT法[20]計算各樣品中目標miRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物

2 結果與分析

2.1 sRNA測序結果與分析

經(jīng)Illumina SE50平臺測序共構建12個甜瓜sRNA文庫，獲得15 991 946條raw reads，經(jīng)質控后共獲得了156 832 594條clean reads，各樣本的Q20>99%，Q30>96%，GC含量范圍為48.93%～54.66%，測序錯誤率占比0.01%，低質量讀數(shù)平均占比0.17%。長度篩選后各文庫sRNA占比為63.89%，平均序列長度為22 nt(圖2)。對sRNA進行注釋后共獲得495 255條已知miRNA和13 370條新的miRNA，總miRNA的占比8.2%，仍有22.01%的sRNA在甜瓜基因組中未注釋，表明有大量sRNA有待挖掘(表2)。

MR：列當寄生甜瓜根；MC：列當寄生點；MP：列當莖稈。圖2 樣品sRNA長度分布頻率

表2 sRNA注釋數(shù)量統(tǒng)計及占比結果

2.2 miRNA的注釋分析

以miRBase數(shù)據(jù)庫對miRNA進行注釋分析，顯示12個文庫中除MP外的9個文庫新miRNA種類比已知miRNA更豐富(圖3A)，說明有待研究注釋的miRNA較多。本研究共注釋到216個miRNA，這些miRNA分別隸屬于13個miRNA家族，內部成員包含1～6個不等，其中以MIR399家族成員最多，該家族主要與磷酸鹽信號通路相關[21]，包含cme-miR399a、cme-miR399b、cme-miR399c、cme-miR399d、cme-miR399e、cme-miR399f和cme-miR399g共6個成員(圖3C)。對miRNA二級結構和miRNA的堿基偏好性進行預測和分析表明，miRNA前體具有莖環(huán)二級結構、3’端有2 nt的懸垂(圖3B)，且堿基1位對U有強偏好，10位對A有較強偏好(圖3D)，符合miRNA的堿基偏好性規(guī)律，說明測序得到的miRNA質量和可信度均較高，可用于后續(xù)實驗分析。

A：不同樣品已知及新miRNA種類；B：miRNA二級結構示意圖，整個序列是miRNA前體，紅色突出部分為成熟體序列；C：樣品中miRNA家族成員及其成員數(shù)；D：miRNA堿基偏好性示意圖。圖3 miRNA注釋結果分析

2.3 差異miRNA及靶基因富集分析

植物遭受生物脅迫時會啟動自身的免疫防御系統(tǒng)，通過對病程相關蛋白(pathogenesis-related protein，PR蛋白)、和抗病基因(resistance gene，R基因)的調控阻止有害生物脅迫[22]。高通量測序篩選生物脅迫中產生的差異基因，并對其靶基因進行注釋和分析，可以快速預測差異基因的生物學功能，從而進一步了解植物的抗生物脅迫的分子過程。對MR和MK的miRNA差異表達分析結果表明，與MK相比，MR共產生了35個差異miRNA，包括19個已知miRNA和16個新miRNA，其中17個基因顯著下調表達，主要參與LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和谷胱氨態(tài)還原酶的產生；18個基因顯著上調表達(圖4)，主要參與介導脫落酸(ABA)與赤霉素(GA)信號、轉錄因子的產生和DCL酶的合成。表明甜瓜可能通過這些差異miRNA介導寄主的防御相關激素和相關基因的轉錄來抵御列當?shù)募纳?/p>

橫坐標表示甜瓜被瓜列當寄生后的miRNA表達倍數(shù)變化(log2FoldChange，P<0.05)；縱坐標表示表達差異的顯著性水平(log10 p-value，P<0.05)；表達上調miRNA用紅色點表示，下調miRNA用藍色點表示，灰色點為未發(fā)生顯著變化。圖4 甜瓜被瓜列當寄生后差異miRNA火山圖

對瓜列當-甜瓜寄生系統(tǒng)中的差異基因的靶基因進行GO富集，顯示這些靶基因參與了1 547個生物學功能條目，368個細胞組分條目和785個分子功能條目，離子結合(ion binding)、雜環(huán)化合物結合(heterocyclic compound binding)、結合(binding)、有機環(huán)化合物結合(organic cyclic compound binding)、銅離子結合(copper ion binding)5個分子功能條目顯著富集，其中binding條目富集靶基因最多，有1 045個靶基因(圖5)，表明甜瓜在被瓜列當寄生后通過分子功能中涉及寄生和發(fā)育相關化合物基因的表達啟動植物免疫反應調控通路。

橫坐標為GO功能條目，縱坐標為差異基因數(shù)量。圖5 差異miRNA靶基因GO功能注釋圖

對差異基因的靶基因進行KEGG富集，顯示相關靶基因在油菜素內酯的生物合成(Brassinosteroid biosynthesis)、丙酸代謝(Propanoate metabolism)、乙醚脂質代謝(Ether lipid metabolism)、mRNA監(jiān)測途徑(mRNA surveillance pathway)、丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism)、脂肪酸代謝(Fatty acid metabolism)、磷酸肌醇代謝(Inositol phosphate metabolism)、晝夜節(jié)律-植物(Circadianrhythm-plant)中極顯著富集，在胞吞作用(Endocytosis)、亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)、RNA轉運(RNA transport)、α-亞麻酸代謝(alpha-Linolenic acid metabolism)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)、脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)、剪切體(Spliceosome)和嘌呤代謝(Purine metabolism)中顯著富集(圖6)。其中油菜素內酯作為一種多羥基甾體植物激素，不僅在植物的生長、發(fā)育和對不同環(huán)境脅迫的反應中起著重要作用[23]，還能夠通過降低H2O2的積累和提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性來增強植物對病原菌的抗病性[24]。脂肪酸是植物表面蠟、角質及木栓質的重要組成部分，這些結構可以改變組織厚度和滲透性以保護植物免受環(huán)境脅迫和微生物的侵襲[25]，已有研究表明[26]細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)會裝載特定的miRNA，為miRNA的長距離跨物種轉移途徑提供了有利證據(jù)，這些EVs是否通過胞吞作用進入另一生物細胞內尚不得而知，但本試驗結果為這一猜想提供了一定可能。以上證據(jù)表明這些差異表達miRNA在甜瓜抵御列當入侵中發(fā)揮重要作用。

橫坐標代表差異基因中與該Term相關的基因數(shù)與整個差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為KEGG注釋通路，圓點大小代表該通路基因數(shù)量，p-value ≤ 0.1。圖6 差異miRNA靶基因KEGG功能注釋圖

2.4 轉移miRNA篩選結果

通過對轉移miRNA的篩選，共鑒定到3個從甜瓜轉移至列當?shù)囊阎猰iRNA和3個從列當轉移至甜瓜新的miRNA(表3)。其中3個已知miRNA分別為cme-miR162、cme-miR398a和cme-miR169r，這些miRNA主要涉及DCL酶剪切體、RNA轉運和胞吞作用；3個新的miRNA分別為novel_2、novel_56和novel_8，其功能主要涉及甾醇生物合成、pre-mRNA剪切蛋白和LRR絲氨酸/蘇氨酸受體樣激酶的合成，LRR絲氨酸/蘇氨酸受體樣激酶可以將胞外信號傳入胞內從而影響基因轉錄[27]。從這些轉移miRNA的功能推測，由甜瓜轉移至瓜列當?shù)膍iRNA可能通過影響列當?shù)膍iRNA的生物合成來抑制列當?shù)纳L，而瓜列當轉移至甜瓜的miRNA則可能通過本身毒力因子和阻止甜瓜mRNA的合成來抑制甜瓜防御相關基因的表達。

2.5 差異基因及轉移miRNA的qRT-PCR驗證

隨機選取了13個差異基因及轉移miRNA對其相對表達量進行qRT-PCR驗證，結果顯示所選取基因的qRT-PCR結果與sRNA測序含量盡管存在差異，但其在各樣品中的表達趨勢具有一致性(圖7)，說明sRNA測序結果可靠，轉移miRNA的篩選結果可信。

表3 轉移miRNA及靶基因注釋信息

圖7 差異轉移miRNA(A)及差異miRNA(B)相對表達量qRT-PCR驗證

3 討論

已有大量文獻證實寄主和寄生物之間存在復雜的物質轉移，這些物質在轉移后會對雙方產生重要影響。Jiang等[28]研究表明菟絲子通過從過表達磷脂酶乙酰轉移酶(PAT)基因的轉基因宿主獲得對草甘膦的瞬時抗性，而大豆蚜蟲(Aphisglycines)取食寄生大豆的菟絲子后誘導了寄主大豆的系統(tǒng)防御反應，從而增強了大豆植株對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)和大豆蚜蟲的抗性[29]。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn)N系統(tǒng)信號可以通過菟絲子在缺N植株和N充足植株間雙向轉運，從而導致N充足植株對N的吸收增加，這些N系統(tǒng)信號還誘導了菟絲子和寄主之間許多遠距離移動的mRNA轉移。列當作為寄生在寄主根部的全寄生性植物，同樣存在著大量轉移物質，Kado等[31]研究檢測了列當科的五種寄生植物，在Orobancheminor和Aeginetiaindica中共檢測到了106個水平基因轉移(HGT)，HGT基因分別約占編碼基因的0.1%和0.2%。Aly[5]發(fā)現(xiàn)當表達GFP的轉基因番茄植株被瓜列當寄生時，大量的GFP從寄主韌皮部轉移到列當韌皮部，并在列當根瘤和莖稈中積累。另外黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)和黃曲葉病毒(TYLCV)也被證明可從受侵染的寄主植物轉移到瓜列當上[32]。這些證據(jù)表明在寄生植物和寄主間雙向交流的大分子物質在其寄生體系中具有重要作用，但目前對列當與寄主間其他物質轉移仍有待研究。

miRNA可以通過宿主轉移至寄生性生物體內，通過RNA干擾(RNAi)提高寄主對寄生生物的抗性[16]。Shahid等[6]研究表明菟絲子在寄生擬南芥和本氏煙時積累了大量新的miRNA，這些miRNAs作為寄主基因表達的跨物種調節(jié)因子，在寄生過程中可能發(fā)揮毒力因子的作用。但瓜列當在寄生甜瓜的過程中是否以miRNA復合體進行長距離移動尚有待研究[33]。本研究結果顯示sRNA測序在列當與甜瓜根部寄生界面(MC)中顯著富集為22 nt長度的miRNA，這與Shahid的研究結果相似[6]。篩選到的轉移miRNA之一miR162在被寄生甜瓜根中顯著上調表達并由甜瓜轉移至列當體內，而miR162的過表達可以抑制DCL1的表達[34]，Dicer-like(DCL)酶是miRNA生物合成的必備物質[35]，能夠參與發(fā)育調節(jié)[36]、表觀遺傳修飾[37]、以及在生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[38，39]。而DCL1的沉默不僅導致水稻苗期生長發(fā)育停滯，而且還能夠誘導防御免疫反應，包括H2O2的積累和細胞的死亡從而抑制稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的擴展，增強水稻對稻瘟病的抗性[40]。因此推測甜瓜可能通過miR162的過表達以啟動自身防御免疫的應答，并轉移至列當，負調控列當miRNA的產生，從而影響列當?shù)纳L發(fā)育和寄生過程。而miR398a主要參與活性氧清除酶Cu/Zn超氧化物歧化酶基因的負調控，寄生體毒性與致病力越強，miR398a上調幅度越大，最終導致被寄生處宿主的細胞因ROS過多而死亡[41]。甜瓜在被列當寄生后導致根部miR398a的顯著表達，表明miR398a可能通過抑制寄生根部細胞ROS酶的活性，增加了寄生部位細胞ROS含量，最終導致被寄生細胞因死亡限制列當?shù)募纳?，miR398a的轉移也可能能夠通過使列當細胞的壞死來限制列當?shù)纳L。

從瓜列當轉移至甜瓜的novel_2主要靶向STABILIZED1蛋白，該蛋白是pre-mRNA的剪切和mRNA轉錄所必需的[42]，novel_56則與鈣離子合成蛋白PICBP有關，鈣離子合成蛋白在Ca2+信號傳導系統(tǒng)傳導中具有重要作用，可以調控生理代謝及基因表達，控制細胞正常的生長和發(fā)育[43]。因此，瓜列當可能通過轉移miRNA調控甜瓜mRNA的合成與轉錄及抑制防御相關信號的傳導促進自身生長。

4 結論

本研究結果表明瓜列當在寄生甜瓜的過程中確實存在miRNA轉移的現(xiàn)象，且這一現(xiàn)象并不單一存在于寄主或寄生物一方，而是相互均有轉移，共篩選到3個已知甜瓜miRNA轉移至瓜列當(cme-miR162、cme-miR398a、cme-miR169r)，3個新瓜列當miRNA轉移至甜瓜(novel_2、novel_56、novel_8)，甜瓜作為寄主可能通過miRNA的轉移來抑制或限制列當?shù)募纳?，列當作為全寄生植物也可能會利用miRNA的轉移來抑制寄主防御反應的信號應答。本試驗從miRNA轉移的角度，為進一步揭示瓜列當寄生甜瓜的分子機制提供了一定理論基礎。