基于RNA-Seq的子宮內(nèi)膜癌灶與癌旁組織差異表達基因分析

楊冰琪，王競州，龐槐，袁成鋼，張君，王翠喆

(石河子大學醫(yī)學院/新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Cancer，EC)是發(fā)生于子宮內(nèi)膜上皮，最常見的女性生殖道惡性腫瘤。我國癌癥中心2019年最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，EC在我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，死亡率居第一位[1]。歐美等國最新數(shù)據(jù)亦顯示，EC在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位[2]。因EC在早期無明顯癥狀，且檢查手段多為有創(chuàng)性，不易普及，發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，且預后較差[3]。

EC可分為I型和II型，肥胖是 Ⅰ 型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的高危因素。在2012年，全球有大約 31% 的子宮內(nèi)膜癌病例與超重相關(guān)。一組結(jié)合了七項前瞻性研究的數(shù)據(jù)顯示：在18至25歲期間，BMI每增加5個單位，Ⅰ 型子宮內(nèi)膜癌的相對危險就增加42%[4]。大量的臨床資料表明，圍絕經(jīng)期女性體重增加與EC發(fā)生的風險呈正相關(guān)，且與預后不良密切相關(guān)[5]。然而，肥胖導致EC發(fā)生發(fā)展的具體分子機制，目前尚不十分明確。因此，尋找肥胖相關(guān)I型EC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機制，將為I型EC的早期診斷、治療及改善預后提供新的思路和理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing, RNA-Seq)技術(shù)可用于分析差異表達基因，因其技術(shù)成熟和成本較低，近年來在腫瘤領(lǐng)域廣泛應用。本研究旨在運用RNA-seq技術(shù)篩選受試個體EC癌灶及癌旁組織中的差異表達基因，并運用生物信息學技術(shù)進一步對篩選出的差異基因進行功能和通路富集分析。將為進一步探索Ⅰ 型EC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)作用機制提供理論依據(jù)，同時為尋找EC的新型治療靶標奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本來源及收納標準

4例受試個體的一般資料、生化指標、EC癌灶及癌旁組織于2019年收集自石河子市石河子大學第一附屬醫(yī)院婦科。收納標注：住院部未接收治療且經(jīng)EC根治手術(shù)的子宮內(nèi)膜組織及血液樣本，新鮮組織樣本經(jīng)-80 ℃處理保存，所選樣本均有對應切緣，且所選樣本臨床資料收集整理完整并獲得患者及家屬知情同意。本研究方案通過了石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的審查，并批準實施(批準編號：2019-011-01)。

1.2 構(gòu)建文庫與測序

基于真核生物的mRNA和部分長鏈非編碼RNA(lncRNA)的3’端具有poly A尾結(jié)構(gòu)，通過poly A尾抓取RNA。使用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit制備文庫。步驟如下：約1ug的起始量總RNA進行去rRNA處理，通過RNA片段化和逆轉(zhuǎn)錄反應將RNA反轉(zhuǎn)為合適大小的cDNA。經(jīng)第二條鏈合成和末端修復(包括5’末端磷酸化和3’末端加A)，兩端加測序接頭完成文庫制備。接著對total RNA文庫進行擴增及磁珠純化，使用Agilent 4200生物分析儀檢測文庫質(zhì)量，并且通過Qubit 2.0熒光光度計和qPCR絕對定量反應檢測文庫濃度，然后在Illumina HiSeq XTen 平臺上進行2x150bp雙端測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

雙端測序得到原始吸測序數(shù)據(jù)(Raw Data)后，使用trimmomatic軟件對數(shù)據(jù)進行過濾，接下來進行去接頭序列以及低質(zhì)量reads處理，再使用STAR、bowtie2等軟件比對序列并評估測序質(zhì)量，從而獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)(Clean Data)，并將Clean Data與參考基因組進行比對，得到BAM文件。對于檢測到的 mRNA，進一步使用htseq-count軟件剔除比對質(zhì)量低于10的reads，并計算mRNA表達count矩陣。過濾掉在多數(shù)樣本中不表達的基因，并進行標準化。隨后對EC癌灶及癌旁組織進行基因表達量計算。

1.4 篩選差異表達基因

基于預處理的表達矩陣分析樣品間差異表達基因，通過edge R、DESeq2等軟件分析，并以P<0.05且| log2(FC)|>1作為條件篩選。

1.5 分析差異表達基因通路富集分析

通過cluster Profiler軟件對差異表達基因進行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 受試個體一般資料及生化指標

4例受試個體一般資料及生化指標分析結(jié)果顯示：所有受試個體均為超重及肥胖個體(BMI>24)，結(jié)果見表1。

表1 受試個體一般資料及生化指標

2.2 組織樣本數(shù)據(jù)處理和質(zhì)控結(jié)果

原始count數(shù)據(jù)存在不同文庫測序深度造成的差異，此外不同基因在樣本中的表達也存在異常值，為了使數(shù)據(jù)之間具有可比性，我們對數(shù)據(jù)進行標準化。對獲取的count數(shù)據(jù)以counts per million(CPM)值過濾，去除在大多數(shù)樣本中不表達的基因(CPM<1的樣本數(shù)>0.5*樣本數(shù))。采用基于負二項分布的DESeq2軟件包對過濾后的計數(shù)數(shù)據(jù)進行標準化處理，校正后各樣本基因表達值中位數(shù)基本在同一水平。本實驗共8個樣本，樣本信息如表2所示。圖1展示了樣本原始read count值和經(jīng)過標準化后read count值的箱線圖及密度圖，箱線圖中經(jīng)過濾及標準化的基因表達值中位數(shù)在同一水平，相比過濾與標準化之前有明顯的差異。密度圖展示了樣本的表達情況，圖中各樣本的表達峰值在同一水平，不同組之間具有可比性，符合后續(xù)分析條件。

表2 樣本信息

圖1 基因表達箱線密度圖

經(jīng)counts值層面的標準化，我們采用主成分分析方法評估樣本間關(guān)系。主成分分析是從一組地位相同的眾多變量抽象出互不相關(guān)的主成分，每一個主成分代表一個側(cè)面，少數(shù)幾個主成分就包含了原始變量的大部分信息。我們以主成分分析方法評估樣本間關(guān)系，以及評估原始數(shù)據(jù)的中的極端值。如圖2所示，圖中組間具有一定的差異性，組內(nèi)有較好的一致性，且未見異常樣本，說明從樣本采集到獲取測序數(shù)據(jù)全流程是可靠的，可重復的，可用于后續(xù)分析。

圖2 主成分分析圖

2.3 基因表達差異分析

我們使用R軟件DESeq2包比較癌灶和癌旁組織間的基因表達水平差異。以P<0.05且|log2(FC)|>1作為條件，共篩選出2 451個差異表達基因，包含1 697個在EC癌灶組織中上調(diào)的基因和754個下調(diào)的基因(圖3)。

圖3 EC癌灶與癌旁組織RNA-seq結(jié)果分析

2.4 差異基因GO功能富集分析

通過對差異表達基因做GO功能注釋，進一步挖掘了各個基因所代表的生物學意義。此次分析中，我們將GO系統(tǒng)分為生物學過程(biological process, BP)、分子功能(molecular functions, MF)、細胞組分(cellular components, CC)。GO功能分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要富集于26個條目：細胞-細胞粘附調(diào)節(jié)、有絲分裂核分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離、白血球細胞-細胞粘附、有絲分裂中期/后期過渡細胞循環(huán)、T細胞活化的正向調(diào)節(jié)、染色體分離的調(diào)節(jié)、T細胞活化的調(diào)控、調(diào)節(jié)淋巴細胞激活、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶復合物、脫氧核糖核酸包裝復合體、細胞-細胞連接、核小體、細胞頂端部分、中間體、細胞皮質(zhì)、細胞皮層部分、微管結(jié)合、錯誤折疊蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)折疊中的蛋白質(zhì)結(jié)合等(圖4A、B)；下調(diào)基因主要富集于29個條目：肌肉系統(tǒng)進程、細胞-底物粘附、細胞外基質(zhì)組織、多細胞生物信號轉(zhuǎn)導、整合素介導的信號通路、細胞基板結(jié)、灶性粘連、肌絲、含膠原的細胞外基質(zhì)、肌纖維膜、鈣通道復合體、運輸復合體、肝素結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、離子通道活性等(圖4C、D)。以上結(jié)果提示：EC的發(fā)生發(fā)展與細胞間粘附調(diào)節(jié)、有絲分裂進程、錯誤蛋白折疊結(jié)合等一系列生物學進程密切相關(guān)。

A, B:上調(diào)的差異基因；C, D:下調(diào)的差異基因。圖4 GO功能富集分析

2.5 差異基因KEGG功能富集分析

為進一步明確上述差異表達基因所存在的關(guān)鍵信號通路，我們對差異表達基因集進行KEGG數(shù)據(jù)庫的生物通路富集分析，結(jié)果顯示，上調(diào)基因KEGG功能富集主要在以下15條通路：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、中性粒細胞細胞外陷阱形成、病毒致癌作用、細胞周期、Hippo信號通路、B細胞受體信號通路、細胞凋亡、軸突導向、p53信號通路、細胞粘附分子等(圖5A、B)；下調(diào)基因KEGG功能富集主要在以下15條通路：致心律失常性右心室心肌病、肥厚型心肌病、擴張型心肌病、細胞外基質(zhì)受體相互作用、灶性粘連、促性腺激素釋放激素分泌、鈣信號通路、晝夜夾帶、心肌收縮、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、蛋白質(zhì)消化和吸收等(圖5C、D)。以上結(jié)果提示：EC的發(fā)生發(fā)展與病毒致癌、細胞周期、Hippo信號通路、細胞凋亡、p53信號通路等密切相關(guān)。

A-B：上調(diào)的差異基因；C-D：下調(diào)的差異基因。圖5 KEGG功能富集分析

3 討論

EC作為女性三大惡性腫瘤之一，常見于圍絕經(jīng)期婦女，常伴有肥胖、糖尿病及高血壓等代謝性病癥[6]。與多數(shù)腫瘤相同，EC的治療手段以手術(shù)治療為主，以激素治療與放化療等治療手段為輔，但效果欠佳[7]。近年來，隨著新型靶向藥物的出現(xiàn)，精準治療與個體化治療方案已成為治療EC的新方向。已有研究表明，多種因素共同作用可導致EC的多階段致病過程，其中可能與多種基因的異常表達密切相關(guān)[8]。

本研究通過使用RNA-Seq技術(shù)篩選EC癌灶與癌旁組織中的差異表達基因后發(fā)現(xiàn)，EC癌灶與癌旁組織之間存在2 451個差異表達基因，包含1 697個上調(diào)基因和754個下調(diào)基因(P<0.05且|log2(FC)|>1)。隨后對以上基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，結(jié)果提示：差異基因主要與細胞間粘附調(diào)節(jié)、有絲分裂進程、錯誤蛋白折疊結(jié)合等一系列生物學進程密切相關(guān)，并富集在病毒致癌、細胞周期、Hippo信號通路、細胞凋亡、p53等信號通路。

已有研究指出，Hippo信號通路可影響多種癌癥的發(fā)展進程，Hippo通路下游的核心因子，在雌激素相關(guān)的EC中高表達，其核內(nèi)表達水平與腫瘤浸潤、分期分型、復發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9-10]。p53作為一種常見的抑癌基因，可修復細胞內(nèi)DNA損傷，調(diào)節(jié)細胞周期，調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因，導致細胞凋亡或衰老，從而抑制多種細胞癌變[11]。已有研究報道，p53突變后，CN-H型EC模型更易復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[12-13]。本研究進一步證實：Hippo信號通路、p53信號通路在EC中的關(guān)鍵性，提示上述信號通路可能是EC預防與治療的重要靶標之一。

本研究亦發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps, NETs)和病毒致癌相關(guān)通路高富集于EC癌灶組織中，且這兩條通路富集到的差異表達基因多為組蛋白簇。已有研究表明：多種腫瘤的病理切片中均有大量NETs，而腫瘤相關(guān)中性粒細胞和細胞外染色質(zhì)積累可形成NETs，以促進癌癥發(fā)生[14-15]。此外，HMGB1和組蛋白通過 TLR4/9信號通路促進 NETs 生成[16-18]，發(fā)揮促進腫瘤生長并誘導結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移病灶形成[19]，但目前尚未有文獻提出NETs信號通路在EC發(fā)生發(fā)展中的具體作用。因此，NETs信號通路有望成為預防與治療EC的新靶點。

綜上，本研究基于RNA-seq技術(shù)分析比較了EC癌灶及癌旁組織中的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)EC的發(fā)生發(fā)展與多條通路密切相關(guān)，其中Hippo信號通路、p53信號通路和NETs信號通路可能在Ⅰ 型EC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。本研究將為進一步探索EC發(fā)生發(fā)展的提供理論依據(jù)，同時為尋找治療 Ⅰ 型EC的新型藥物作用靶點提供新的思路和方向。