改良劑調(diào)控鹽堿脅迫對棉田土壤微生物多樣性的影響

王曉麗，安夢潔，張春媛，樊華，王開勇

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆 石河子 832003)

鹽漬化土壤極大地限制了半干旱和干旱地區(qū)的作物生產(chǎn)[1];中性鹽和堿性鹽是農(nóng)田鹽漬土的主要成分,它們是既相關(guān)又有本質(zhì)區(qū)別的非生物脅迫[2]。西北地區(qū)占全國總面積的71%，但西北地區(qū)的土壤70%為鹽漬土[3]。土壤鹽化主要是由于NaCl的積累，堿化主要是由于Na2CO3和NaHCO3的積累[4]。鹽堿地被認(rèn)為是生命的嚴(yán)酷棲息地，鹽堿地中的微生物群落尤其重要，因為它們在生態(tài)系統(tǒng)過程中起著至關(guān)重要的作用，而土壤鹽化和堿化會導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)遭到破壞，微生物多樣性減少，從而破壞土壤環(huán)境[5]。因此，緩解土地鹽堿化已經(jīng)成為新疆農(nóng)業(yè)開發(fā)及持續(xù)發(fā)展的重大任務(wù)。

高分子材料能夠吸收和保持大量水分，增強(qiáng)土壤的保水能力，穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)，因此，許多高分子土壤改良劑在農(nóng)業(yè)和生態(tài)修復(fù)土壤中應(yīng)用[6]。高分子土壤改良劑的應(yīng)用可以改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[7]，但它對土壤理化性質(zhì)和土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響尚不明確。大量研究表明土壤微生物群落受各種環(huán)境因素的影響，包括土壤pH值、電導(dǎo)率(EC)和鹽度等多種環(huán)境因素的影響[8-10]。因此，研究分析高分子土壤改良劑對改良鹽化和堿化土壤中微生物的分布及多樣性的影響，可以提高對高分子土壤改良劑在改變土壤理化性質(zhì)和土壤細(xì)菌群落等的認(rèn)識，進(jìn)而有利于更有效地把鹽堿土逐步地修復(fù)為可利用土壤。

本文研究利用高分子土壤改良劑探究鹽堿土中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，利用Illumina平臺的測序技術(shù)分析鹽堿土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，確定在鹽化和堿化土壤中添加高分子土壤改良劑后土壤細(xì)菌群落和土壤理化性質(zhì)的變化，明確土壤微生物群落是否隨土壤性質(zhì)的變化而變化，以及兩種高分子改良劑對土壤細(xì)菌群落的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2018年在新疆石河子市葡萄研究所進(jìn)行。供試土壤為灰漠土，土壤基本理化性質(zhì)為pH 7.72，CEC 17.32 mol/kg;土壤有機(jī)質(zhì)12.5 g/kg，堿解氮、速效磷、速效鉀分別為54、11.7、218 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采取桶栽控制試驗，供試品種為棉花。根據(jù)前人研究及預(yù)驗的結(jié)果，在試驗地桶(直徑50 cm，高60 cm)內(nèi)土壤中人為添加中性鹽(NaCl)和堿性鹽(Na2CO3)，使土壤鹽堿含量達(dá)8 g/kg，充分混勻后，將桶埋回大田中，以保持大田群體效應(yīng)。處理后鹽化土壤的pH值為8.24，堿化土壤pH值為9.78。

試驗共設(shè)置6個處理，均進(jìn)行常規(guī)施肥，其中4個是添加改良劑的處理，分別為OP-S(鹽脅迫+有機(jī)高分子復(fù)配材料)、FA-S(鹽脅迫+以黃腐酸為主的復(fù)合材料型)、OP-A(堿脅迫+有機(jī)高分子復(fù)配材料)、FA-A(堿脅迫+以黃腐酸為主的復(fù)合材料型)]，2種改良劑均為自主研發(fā)，其余2個為對照處理，分別為S(鹽脅迫)和A(堿脅迫)。采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，每處理重復(fù)3次。于2018年5月播種，出苗后定苗；于6月25日第1次灌水，灌水周期為10 d，全生育期共灌水9次；2種改良劑每次隨水施加，2018年10月初收獲。

表1 試驗處理

1.3 取樣與測定

1.3.1 取樣

在棉花花鈴期采集土壤樣品，先將棉花根系從土壤中挖出，輕輕地抖掉根系周圍松散的土壤，然后將附著在根表面的土壤作為根際土壤進(jìn)行收集。將土壤樣品密封在一新塑料袋內(nèi)后放入冰盒中，每個小區(qū)采3點混合并用“四分法”獲得1個土樣。一部分土樣自然風(fēng)干后過2 mm篩，保存?zhèn)溆糜跍y定土壤pH、EC值、K+、Na+的含量；另一部分過2 mm篩進(jìn)行徹底均勻化，置于-80 ℃冰箱中儲存，用于土壤細(xì)菌群落多樣性的測定。

1.3.2 土壤微生物總DNA的提取

采用DNA提取試劑盒提取土樣DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的長度和完整性。所有樣品基因組DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增與測序工作委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3.3 高通量測序

采用通用引物對土壤細(xì)菌16S rRNA基因的V3至V4區(qū)擴(kuò)增，通過HiSeq 2500 PE250(Illumina公司，美國)進(jìn)行高通量測序。

1.3.4 土壤理化性質(zhì)的測定

以水土質(zhì)量比5∶1制備土壤水浸提液，并用于土壤pH和鹽分指標(biāo)的測定，土壤pH用通用型pH計 (OHAUS Starter 3C,美國)測定，電導(dǎo)率(EC)用電導(dǎo)率儀 (OHAUS Starter 3C,美國)測定[11]。

1.3.5 土壤鉀鈉離子含量的測定

參照鮑士旦的方法[11]采用火焰光度法測定K+、Na+含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析方法

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2013軟件；采用SPSS 17.0進(jìn)行描述性統(tǒng)計和方差分析，其中方差分析選擇單因素方差分析(One-way ANOVA)；圖表繪制采用Excel 2013、Origin2018和RStudio。對物種之間的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖表達(dá)物種的相關(guān)性分析，根據(jù)鹽、堿處理下各個物種的豐度以及在樣品中的變化情況，使用Sparcc算法進(jìn)行相關(guān)分析(包括正相關(guān)和負(fù)相關(guān))，篩選出相關(guān)性大于0.1且P值小于0.05的數(shù)據(jù)組進(jìn)行統(tǒng)計檢驗，再篩選出相關(guān)性最高的屬，基于python繪制表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

從表2可以看出：鹽堿脅迫下，與對照(S、A)相比，添加改良劑后土壤的pH、EC均降低，堿脅迫下土壤pH均顯著大于鹽脅迫。鹽脅迫下，與對照(S)相比，OP-S和FA-S處理土壤的pH分別降低5.55%(P>0.05)、2.85%(P>0.05)，EC值分別降低9.32%(P>0.05)、12.43%(P>0.05)。堿脅迫下，與對照(A)相比，OP-A和FA-A處理的土壤pH分別降低1.60%(P>0.05)、1.10%(P>0.05)，EC值分別降低16.90%(P>0.05)、8.10%(P>0.05)。

表2 不同處理下土壤pH和EC值

2.2 土壤鉀鈉離子

從圖1可以看出：與對照(S、A)相比，添加改良劑(OP-S、FA-S、OP-A、FA-A)處理土壤的K+、Na+含量及K+/Na+比值均降低，并且各處理堿化土中Na+含量均顯著高于鹽化土，堿化土的K+/Na+比值均低于鹽化土。鹽脅迫下與對照(S)相比，改良劑(OP-S、FA-S)分別使土壤K+含量降低23.43%(P<0.05)、39.05%(P<0.05)，Na+含量分別降低了10.89%(P>0.05)、7.02%(P>0.05)；堿脅迫下添加改良劑(OP-A、FA-A)的處理與對照(A)相比，K+含量分別降低21.18%(P<0.05)、36.46%(P<0.05)，Na+含量分別降低了32.47%(P<0.05)、27.30%(P<0.05)(圖1a)。鹽脅迫下添加改良劑(OP-S、FA-S)的處理與對照(S)相比，土壤K+/Na+比值分別降低14.04%(P>0.05)、34.05%(P<0.05)；堿脅迫下添加改良劑(OP-A)的處理與對照(A)相比，土壤K+/Na+比值增加22.37%(P<0.05)，添加改良劑(FA-A)的處理與對照(A)相比降低12.51%(P>0.05)(圖1b)。

圖中小寫字母表示同一指標(biāo)分別在鹽脅迫和堿脅迫不同處理間差異達(dá)到P<0.05顯著水平。圖1 不同處理下土壤K+、Na+的含量

2.3 鹽堿脅迫對土壤細(xì)菌群落多樣性影響

從表3可以看出：OP-S處理和OP-A處理下Chaol和ACE指數(shù)相對較高，說明群落豐富較高，總體上體現(xiàn)在添加改良劑OP后可使鹽、堿處理的豐富度有所增加。從表3中Simpson和Shannon指數(shù)可以看出，群落多樣性變化規(guī)律不明顯，無法對群落多樣性進(jìn)行準(zhǔn)確分析。

表3 不同處理土壤微生物多樣性指數(shù)統(tǒng)計表

2.4 土壤細(xì)菌群落和結(jié)構(gòu)

從圖2可以看出：不同處理土壤細(xì)菌優(yōu)勢門類主要包括變形菌門(Proteobacteria)(27.76%～38.27%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(12.64%～15.23%)、放線菌門(Actinobacteria)(8.3%～19.35%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(9.43%～14.94%)是根際土壤的優(yōu)勢菌群，相對豐度最高。其次是綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)，而浮霉菌門(Planctomycetes)、六核桿菌門(Rokubacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和其他一些未能分類鑒定的微生物類群都以較低豐度分布在土壤中。

酸桿菌門(Acidobacteria)在S處理中比OP-S、FA-S處理的都高，分別高出8.53%和3.17%，說明鹽處理下不利于酸桿菌門的生長繁殖，而在堿脅迫下則相反。但對于放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)其在OP-S、FA-S處理下所占比例普遍高于S處理，而在堿脅迫下則相反。OP-A處理下變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對于A處理增加幅度分別為3.54%、2.12%、0.31%；FA-A處理下變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對于A處理增加幅度分別為9.79%、0.80%、0.75%。

圖中一種顏色代表一個物種，色塊長度(柱狀圖)；表示物種所占相對豐度比例。圖2 改良劑對根際土壤微生物門水平群落組成

2.5 物種豐度聚類熱圖

基于OTU結(jié)果用不同顏色變化來表示分類信息和處理間差異，結(jié)果(圖3)顯示：

不同處理間差異較大，與S處理相比，OP-S處理中纖維桿菌門(Fibrobacteres)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)豐度明顯增加，而酸桿菌門(Acidobacteria)、WS2、六核桿菌門(Rokubacteria)豐度明顯降低。與S處理相比，F(xiàn)A-S處理中藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、廣谷菌門(Euryarchaeota)、晚生菌門(Latescibacteria)豐度明顯增加，而硝化螺菌門(Nitrospirae)、酸桿菌門(Acidobacteria)和WS2豐度明顯降低。與A處理相比，OP-A處理中嗜熱球菌(Deinococcus-Thermus)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)豐度明顯增加，而放線菌門(Actinobacteria)豐度明顯降低。與A處理相比，F(xiàn)A-A處理中大腸桿菌(Epsilonbacteraeota)、桿菌門(Patescibateria)豐度明顯增加。

另外，從相似度可以看出，F(xiàn)A-A和OP-S處理可聚為一類，A和OP-A處理可聚為一類；FA-S處理在分支上位置較遠(yuǎn)，且FA-S處理與其余處理在顏色分布上差別較大。

綜上可知：鹽化處理下和堿化處理下的微生物聚集情況不相似。

圖中顏色代表物種豐度;縱向聚類表示不同物種在各處理間豐度的相似情況，兩物種間距離越近，枝長越短，說明這兩個物種在各處理間的豐度越相似；橫向聚類表示不同處理的各物種豐度的相似情況，與縱向聚類一樣，2個處理間距離越近，枝長越短，說明這2個處理的各物種豐度越相似。圖3 門水平物種豐度聚類熱圖

2.6 門水平物種生物網(wǎng)絡(luò)圖

由圖4可知：鹽處理下物種豐度最高的4個物種分別是放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)，篩選出相關(guān)性最高的26個門中表現(xiàn)正相關(guān)的線條有13條，表現(xiàn)負(fù)相關(guān)的線條有14條(圖4a)。堿處理下物種豐度最高的4個物種分別是變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，篩選出相關(guān)性最高的25個門中表現(xiàn)正相關(guān)的線條有14條，表現(xiàn)負(fù)相關(guān)的線條有18條(圖4b)。

用節(jié)點代表物種，節(jié)點大小代表豐度；線條代表兩物種間相關(guān)，黃色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)。圖4 鹽處理(a)和堿處理(b)的群落結(jié)構(gòu)(門水平)物種生物網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 土壤細(xì)菌多樣性與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

采用冗余分析方法(RDA)分析不同改良劑對土壤細(xì)菌群落多樣性和土壤理化性質(zhì)的影響，結(jié)果(圖5)顯示：土壤K+和K+/Na+比與浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺菌門(Nitrospirae)、酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度呈正相關(guān)，與擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度呈負(fù)相關(guān)，表明pH和K+/Na+比值對土壤微生物的影響最大。鹽脅迫下添加改良劑(OP-S)的處理與疣微菌門(Verrucomicrobia)密切相關(guān)，添加改良劑(FA-S)的處理與浮霉菌門(Planctomycetes)密切相關(guān)；堿脅迫下對照處理(A)與放線菌門(Actinobacteria)密切相關(guān)，添加改良劑(OP-A)的處理與綠彎菌門(Chloroflexi)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)密切相關(guān)，添加改良劑(FA-A)的處理與擬桿菌門(Bacteroidetes)密切相關(guān)。同時，pH、EC和K+/Na+對Firmicutes的影響較大，K+對綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和浮霉菌門(Planctomycetes)的影響較大，K+/Na+比值對硝化螺菌門(Nitrospirae)和酸桿菌門(Acidobacteria)的影響較大。

圖5 鹽堿處理對棉花根際土壤理化性質(zhì)與微生物群落(門水平)的冗余分析

3 討論

3.1 改良劑的應(yīng)用對土壤理化性質(zhì)的影響

鹽堿土壤中K+、Na+過多會對土壤結(jié)構(gòu)造成不良影響，易使土壤板結(jié)[12]；土壤改良劑不僅能影響土壤中K+、Na+含量，也會影響K+、Na+從土壤向植株中轉(zhuǎn)運。本研究結(jié)果表明堿脅迫對土壤中鹽基離子造成的影響大于鹽脅迫，另有研究發(fā)現(xiàn)添加外源腐殖酸類物質(zhì)可以疏松耕層土壤,腐殖酸對鈉離子、氯離子有很強(qiáng)的吸附作用，降低表層土壤的含鹽量,達(dá)到調(diào)節(jié)土壤鹽基離子含量，減輕土壤鹽堿化的效果[13]。

劉璐等研究發(fā)現(xiàn)添加土壤調(diào)理劑能降低土壤中水溶性鹽基離子的含量，有效改良鹽化和堿化土壤[14]，另外，施用脫硫石膏可降低土壤中Na+和K+含量[15]；龍明杰等[16]采用磺化木質(zhì)素和高分子材料復(fù)配能有效地改良堿土。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫和堿脅迫下添加改良劑可以降低土壤中K+和 Na+含量，可能是由于土壤中K+被根系迅速吸收運輸，促進(jìn)作物的營養(yǎng)生長和生殖生長，同時高分子材料中的Ca2+與土壤中Na+發(fā)生置換作用而造成Na+含量的降低。

此外，K+和Na+是與土壤EC值相關(guān)的主要可溶性鹽[17]，與土壤pH和EC呈顯著正相關(guān)[18]；本研究結(jié)果表明堿脅迫下土壤pH、EC值顯著高于鹽脅迫。為了調(diào)控鹽堿脅迫對土壤造成的污染，通過向土壤中添加外源物質(zhì)也可以改變土壤的理化性質(zhì)，趙金星等[19]研究發(fā)現(xiàn)添加改良劑處理后土壤的電導(dǎo)率顯著增加、pH值降低、土壤的物理性狀明顯改善；楊宇等[20]在鹽堿土壤上添加以黃腐酸為原料制成的土壤調(diào)理劑進(jìn)行改良試驗，發(fā)現(xiàn)土壤pH值明顯降低；本研究結(jié)果表明鹽脅迫和堿脅迫下施用改良劑后土壤pH、EC值降低，說明改良劑有降低鹽化、堿化土壤的作用，對鹽化土的改良主要是降低土壤的EC值，對堿化土壤的改良主要是降低土壤的pH值。

3.2 改良劑的應(yīng)用對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，能促進(jìn)土壤營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化，提高土體質(zhì)量，但對土壤環(huán)境的變化極其敏感[21]。鹽堿脅迫對微生物生長有抑制作用，造成微生物量減少[22]。羅俊等[23]試驗研究發(fā)現(xiàn)高分子材料對土壤微生物群落的影響最明顯，WU H P[24]等研究表明添加堆肥可提高細(xì)菌群落的豐度和多樣性，本研究的結(jié)果與之相似。

眾多研究發(fā)現(xiàn)土壤變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)通常是大多數(shù)土壤中最占優(yōu)勢的細(xì)菌門[25-27]。牛世全等[28]研究發(fā)現(xiàn)原生鹽堿土的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)，次生鹽堿土的優(yōu)勢菌門是放線菌門(Actinobacteria),且分布的細(xì)菌多嗜鹽堿細(xì)菌。本研究結(jié)果表明6個處理擁有相同的優(yōu)勢菌群,分別是變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和放線菌門(Actinobacteria)，說明在鹽化和堿化環(huán)境下土壤細(xì)菌類群的分布具有一定的相似性，這與前人研究結(jié)果[29]一致；此外，在優(yōu)勢菌門中，有機(jī)高分子復(fù)配型改良劑和黃腐酸為主的復(fù)合材料型改良劑可提高鹽脅迫下放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度，提高堿脅迫下變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度。

3.3 改良劑的應(yīng)用對土壤理化性質(zhì)和土壤微生物相關(guān)性的影響

鹽堿土壤作為一種極端環(huán)境，其中的微生物具有不同于一般微生物的生理功能和特殊結(jié)構(gòu)，并且這些微生物的生命活動決定了土壤的理化性質(zhì)，會影響土壤結(jié)構(gòu)和肥力[30]。同時，土壤pH和EC也是細(xì)菌群落多樣性的首要影響因子，它是決定細(xì)菌群落組成、系統(tǒng)類型豐富度的主要因素，對土壤微生物生長和繁殖影響較大[18,31-32]。除土壤pH和EC之外，K+和Na+含量也對土壤細(xì)菌群落組成有重要影響[18]。劉師敏等[33]試驗結(jié)果表明施用脫硫石膏處理下鹽堿地土壤的pH值下降、微生物活性提高；HO A[34]等通過在土壤中添加有機(jī)質(zhì)改變了土壤微生物群落的豐度、結(jié)構(gòu)組成和生物交互作用。本研究冗余分析結(jié)果表明，土壤pH、EC和K+/Na+比值對Firmicutes、Nitrospirae和Acidobacteria細(xì)菌群落的影響最大，添加改良劑的處理與Planctomycetes、Chloroflexi、Verrucomicrobia、Bacteroidetes四種優(yōu)勢菌群的關(guān)系最密切，這與DEMOLING F等[35]研究結(jié)果一致。

上述研究結(jié)果說明改良劑的添加主要是對土壤的影響，進(jìn)而對土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)造成影響。其原因可能是改良劑處理主要是通過提高土壤肥效、改變土壤pH、EC和降低鹽堿化來改善微生物的生存環(huán)境，進(jìn)而提高了土壤微生物多樣性。

4 結(jié)論

(1)鹽化和堿化土壤中施用高分子材料可以降低土壤理化性質(zhì)，使得土壤微生物活性提高，其中，以黃腐酸為主的復(fù)合材料型改良劑對降低土壤K+的效果更顯著，同時，以黃腐酸為主的復(fù)合材料型改良劑對土壤鹽脅迫處理的影響大于堿脅迫處理的。

(2)通過向鹽化和堿化土壤中添加兩種改良劑有助于改善鹽化和堿化土壤細(xì)菌群落多樣性。鹽脅迫下，不添加改良劑時酸桿菌門(Acidobacteria)豐度較高，平均含量達(dá)到19.10%；堿脅迫下，不添加改良劑時放線菌門(Actinobacteria)豐度較高。有機(jī)高分子復(fù)配型改良劑和黃腐酸為主的復(fù)合材料型改良劑使鹽脅迫下放線菌門(Actinobacteria)豐度增加，平均比例高達(dá)14.40%和16.94%，并使堿脅迫下變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)豐度增加，其中變形菌門(Proteobacteria)豐度的平均比例分別高達(dá)31.76%和38.01%，酸桿菌門(Acidobacteria)豐度的平均比例分別高達(dá)15.05%和13.73%。