基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對桂枝茯苓丸治療放射性肺炎的潛在作用機(jī)制初探

鄒航，李淼，何嘉寧，朱詩雨，翁文浩，趙春陽，蔡佳怡

1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122；2.中國醫(yī)科大學(xué)臨床一系，遼寧 沈陽 110122；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001

隨著放射治療在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，隨之引起的不良反應(yīng)也愈發(fā)嚴(yán)重。肺組織對放射線敏感性高，接收放射線后易發(fā)生損傷，導(dǎo)致放射性肺炎和長期肺纖維化的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者預(yù)后水平和生活質(zhì)量[1]。研究表明，肺癌、乳腺癌、食管癌、惡性淋巴瘤或胸部其他惡性腫瘤經(jīng)放射治療后，在放射野內(nèi)的正常肺組織受到損傷均會(huì)出現(xiàn)放射性肺炎相關(guān)癥狀[2]。因此，為了保證放射治療的順利進(jìn)行，對于放射性肺炎的預(yù)防、控制與治療顯得尤為重要。

中醫(yī)將放射性肺損傷歸為“肺瘺”，主要辯證理論為熱毒之邪[3]。采用放射線治療的多為腫瘤患者，本身免疫力低下，屬于正氣不足、瘀血內(nèi)結(jié)，因此應(yīng)在扶正的前提下益氣活血，疏通經(jīng)絡(luò)，逐淤散結(jié)。本文選擇具有臨床療效證據(jù)的理氣活血方劑桂枝茯苓丸，探索其在治療放射性肺損傷中的作用[4]。

桂枝茯苓丸出自《金匱要略》，臨床上已有其治療間質(zhì)性肺炎和放射性肺炎成功的案例。桂枝茯苓丸具有改善血液流變、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等作用。臨床研究證明，桂枝茯苓丸能夠降低放射性肺炎的發(fā)生率、緩解癥狀。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步探究其作用機(jī)制，為放射肺炎的預(yù)防與治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 活性成分檢索 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，檢索活性成分及其作用靶點(diǎn)(2021 年5 月31 日更新檢索)。檢索詞為“桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥”。檢索條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。初步篩選獲取活性成分，同時(shí)刪除無明確靶點(diǎn)的成分，然后進(jìn)一步通過UniProt數(shù)據(jù)庫做標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選 應(yīng)用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)和GeneCard 數(shù)據(jù)庫對放射性肺炎的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，檢索詞為“Radiation pneumonitis”。檢索獲得靶點(diǎn)，提取Score 值，按照由高到低排列；合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，去除重復(fù)數(shù)據(jù)。

1.3 活性成分與疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 應(yīng)用R語言中的VennDiagram程序包對成分與疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理。同時(shí)將成分、靶點(diǎn)、疾病相互作用的關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化分析。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將桂枝茯苓丸與放射性肺炎交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫中，生物類型設(shè)定為Homo Sapiens，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO、KEGG 富集與分析 通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫對篩選獲得的交集基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集。應(yīng)用R 語言中DOSE[5]、ClusterProfiler[6]和Pathview[7]程序包，進(jìn)行富集分析。

1.6 分子對接 應(yīng)用AutoDock Vina對小分子與蛋白進(jìn)行分子對接，應(yīng)用Pymol 對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸活性成分及其靶點(diǎn)檢索 應(yīng)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索獲取活性成分：桂枝7 個(gè)，茯苓15個(gè)，牡丹皮11個(gè)，桃仁23個(gè)，芍藥29個(gè)。刪除重復(fù)項(xiàng)和沒有明確靶點(diǎn)的化合物后，剩余共計(jì)85個(gè)活性成分。其中生物利用度最高的是白楊糖苷(populoside，OB=108.89%)，最低為芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin，OB=30.25%)。DL 值分布在0.19 到0.83 之間，其中去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)類藥性最高。

2.2 放射性肺炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 應(yīng)用GeneCard獲得放射性肺炎相關(guān)基因靶點(diǎn)531個(gè)，Score值分布在0.22～46.32。最大值46.32為TP53。同時(shí)，檢索OMIM，得到相關(guān)基因6個(gè)，合并獲得基因537個(gè)。

2.3 疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 應(yīng)用R 語言的VennDiagram程序包對成分與疾病網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，得到桂枝茯苓丸與疾病有64 個(gè)交集基因，如表1所示。其中桂枝有3個(gè)活性成分作用在3個(gè)交集基因上，茯苓有4 個(gè)活性成分作用在18 個(gè)交集基因上，牡丹皮僅有1個(gè)活性成分作用在37個(gè)交集基因上，桃仁中12個(gè)活性成分作用在同一個(gè)靶點(diǎn)上，芍藥7個(gè)活性成分作用在11個(gè)靶點(diǎn)上。

表1 益氣活血中藥與放射性肺炎基因交集

應(yīng)用Cytoscape 對活性成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系進(jìn)行分析(圖1)，本研究共納入放射性肺炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)85 個(gè)，中藥活性成分30 個(gè)，中藥5 味，搭建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)214 個(gè)，其中包括疾病與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與活性成分、活性成分與中藥之間的關(guān)系。其中，槲皮素(Quercetin)與37 個(gè)基因靶點(diǎn)相關(guān)，常春藤皂甙元(Hederagenin)與17個(gè)基因靶點(diǎn)相關(guān)，鞣花酸(Ellagic acid)與8個(gè)基因靶點(diǎn)相關(guān)，兒茶酸(Catechin)與4 個(gè)基因靶點(diǎn)相關(guān)，β-谷甾醇(beta-sitosterol)與3 個(gè)基因靶點(diǎn)相關(guān)。靶點(diǎn)與活性成分關(guān)聯(lián)數(shù)排首位的是PTGS2，其與23個(gè)成分存在著相關(guān)性；VEGFA、PGR、NR3C2、MPO、MMP9、GSTM1和GSTP1均與2個(gè)成分存在相關(guān)性。

圖1 桂枝茯苓丸中藥治療放射性肺炎的活性成分-靶點(diǎn)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于String數(shù)據(jù)庫的文本挖掘，共檢索到蛋白與蛋白之間的互作關(guān)系共計(jì)947 條，其中實(shí)驗(yàn)論證的相互關(guān)系167 條(粉色)，來源于數(shù)據(jù)庫證據(jù)89 條(藍(lán)色)，共表達(dá)462 對(紫色)，基因同線7對(淺藍(lán)色)，其余黃色線為文本挖掘的基因相關(guān)性，見圖2。

圖2 桂枝茯苓丸中藥與放射性肺炎的PPI網(wǎng)絡(luò)

在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)基因中，核心基因出現(xiàn)在IL-6和AKT1，分別有57 和53 個(gè)相互作用。除此之外，MMP9、CXCL8、VEGFA、IL1B、CCL2 和PTGS2 也具有較多的相關(guān)基因，分別有52、51、51、50、49 和49 個(gè)相互作用。這些靶點(diǎn)的預(yù)測對放射性肺炎的防治具有關(guān)鍵的指導(dǎo)作用。

2.5 GO富集與KEGG富集分析 通過生物活性GO 富集初步得到相關(guān)性排名前30 的生理過程，按照相關(guān)性(P值)排序，排名前十的生理活性分別為：細(xì)胞因子生理活性(cytokine activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合生理活性(cytokine receptor binding)、血紅素結(jié)合(heme binding)、四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、信號受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)、磷酸酶結(jié)合活性(phosphatase binding)、生長因子受體結(jié)合活性(growth factor receptor binding)、整合素結(jié)合活性(integrin binding)。為了明確桂枝茯苓丸的生物活性對應(yīng)的來源，對五味中藥組分進(jìn)行GO 富集，闡明其在治療放射性肺炎中可能產(chǎn)生的影響，見圖3。

圖3 桂枝茯苓丸中藥生物活性GO富集柱狀圖

對得到的交集基因結(jié)果進(jìn)行KEGG富集，并同時(shí)對五味中藥組分進(jìn)行富集分析，按P 值排名，前十的通路依次為：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、膀胱癌(bladder cancer)、HIF-1 信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17 信號通路(IL-17 signaling pathway)、恰加斯病相關(guān)通路(Chagas disease)、瘧疾相關(guān)通路(malaria)、前列腺癌相關(guān)通路(Prostate cancer)，見圖4。

圖4 桂枝茯苓丸中藥相關(guān)通路KEGG富集柱狀圖

2.6 分子對接 將篩選出來的小分子和蛋白分別通過AutoDock Vina 軟件進(jìn)行篩選，通過計(jì)算機(jī)輔助模擬分子對接，得到8 對親和力較高的小分子與蛋白的相互作用(表2)。其中，親和力最大的是槲皮素(Quercetin)與ICAM1，親和力可達(dá)-8.9；鞣花酸(Ellagicacid)與GSTM1，親和力為-8.7；這兩個(gè)小分子與GSTP1 也有較好的相互作用。黃芩素(Baicalein)與HIF1的親和力為-7.6；Taxifolin與ICAM1和PTGS2相互作用，親和力分別為-7.6和-6.7，見圖5。

圖5 分子對接可視化圖

表2 分子對接結(jié)果

3 討論

桂枝茯苓丸出自我國著名醫(yī)學(xué)古籍《金匱要略》，由5味中藥組成，含85個(gè)活性成分。放射性肺炎共計(jì)537 個(gè)相關(guān)基因，疾病與桂枝茯苓丸活性成分相交基因64個(gè)。其中PTGS2為相互作用最多的靶點(diǎn)，可能為作用機(jī)制中的重要靶點(diǎn)。其中活性成分槲皮素、常春藤皂甙和鞣花酸與較多的靶點(diǎn)相關(guān)，可能為此方劑的主要活性成分。桂枝茯苓丸主要通過細(xì)胞因子生理活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合生理活性和血紅素結(jié)合活性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)放射性肺炎相關(guān)生理過程。其機(jī)制主要通過糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號通路和脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路等進(jìn)行調(diào)控。

關(guān)于放射性肺炎的研究仍處于初步階段，目前放射治療后產(chǎn)生肺炎和肺纖維化的機(jī)制尚不明確，但關(guān)注度隨著放療患者的增加而逐年增加。2002 年XAVIER等[8]和CHEN等[9]在研究中證明了放射性肺損傷，特別是放療后期的肺纖維化與TGF-β通路有關(guān)，論證了損傷再修復(fù)機(jī)制在放射性肺炎中的重要地位。2011年YANG等[10]在International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics 中提出了基因多態(tài)性與放射性肺炎的關(guān)系。這些關(guān)系缺少進(jìn)一步的論證，大多停留在假說的階段。為了更好的探索中藥復(fù)方在放射性肺炎中的作用，本文通過數(shù)據(jù)庫檢索篩選出所有的潛在靶點(diǎn)，并對不同的蛋白相互作用進(jìn)行評分。但與其他常見疾病相比，本文得到的靶點(diǎn)Score值較低，原因可能與相關(guān)研究較少，沒有充足的證據(jù)支持有關(guān)。

中醫(yī)辨證理論在解釋放射性肺炎時(shí)存在不確定性。中醫(yī)認(rèn)為放射性肺炎的主要辨證思想為熱毒，可分為以下證型：氣陰兩虛型、熱毒陰虛型、肺燥津虧型、熱毒內(nèi)蘊(yùn)型、肺絡(luò)血瘀型及肺腎陰虛型[11]，并沒有一個(gè)完全對應(yīng)的中醫(yī)傳統(tǒng)理論，較為接近的是“肺痹”，因而在中醫(yī)用藥選擇上分歧較多。益氣類中藥在預(yù)防放射性肺炎的方劑中經(jīng)常出現(xiàn)，以提高免疫力為主要功效，如參芪扶正注射液[12]。放射性肺炎本身為熱毒，有學(xué)者提出清熱解毒方劑可能存在治療意義[13]。由于放射性肺炎常表現(xiàn)出郁結(jié)癥狀，因而活血化瘀類藥物也成為方劑中重要組成部分，例如川芎、丹參等[14]。

桂枝茯苓丸為理氣活血方劑，主要成分為桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和芍藥。其中桂枝為主藥，可溫通血脈，扶正固本，起到調(diào)節(jié)免疫力的作用。茯苓同為主藥，可滲利下行、益心脾之氣，有助于改善瘀血癥狀。桃仁和芍藥可清熱解毒。在成方的過程中往往加入白蜜作為輔料成丸，具有祛痰祛瘀的功效。因此，桂枝茯苓丸的功效與放射性肺炎的中醫(yī)辨證理論相一致[15]。

通過對桂枝茯苓丸-放射性肺炎通路相關(guān)性的分析，提示其藥理機(jī)制可能與細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性通路、血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)信號通路以及乏氧因子相關(guān)靶點(diǎn)有著密切的關(guān)系。細(xì)胞因子在非感染性炎癥疾病的發(fā)病初始階段起到關(guān)鍵的作用[16]，血細(xì)胞黏附及血流動(dòng)力學(xué)改變是放射性肺炎后期肺纖維化形成的重要過程[17]，低氧誘導(dǎo)因子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞對于射線的敏感度、降低肺部由于放射線引起的損傷[18]，通過調(diào)控上述過程，可能會(huì)有效抑制放射性肺炎的進(jìn)展。

放射性肺炎的發(fā)生發(fā)展存在多個(gè)階段以及多個(gè)影響因素，本文首次對放射性肺炎已知研究的全貌進(jìn)行總結(jié)。通過建立中藥經(jīng)典復(fù)方桂枝茯苓丸的小分子庫，放射性肺炎的疾病基因庫，進(jìn)一步搭建小分子、靶點(diǎn)、活性成分以及中藥復(fù)方之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，探討各組分的作用靶點(diǎn)及通路。目前針對放射性肺炎的中藥研究依然較少，主要集中在綜述以及文獻(xiàn)整理，針對機(jī)制的研究較少。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法首次進(jìn)行探索，旨在為放射性肺炎的中藥預(yù)防以及治療機(jī)制的探究提供新的依據(jù)。