血小板活化釋放因子在血小板功能測試中的應(yīng)用

曾俊玲，許小冰 綜述 陳煜森 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江 524000

血小板主要生理功能在于止血、維持血管內(nèi)皮完整性，同時是病理血栓形成的重要因素。通過血小板功能預(yù)測患者不良心血管事件的風(fēng)險等有著重要的臨床意義，目前臨床實驗室提供的血小板功能測試(platelet function tests，PFT)方法中，測量血小板聚集占主導(dǎo)地位，且大多數(shù)測試方法的結(jié)果存在顯著的異質(zhì)性，尚無明確的標(biāo)準(zhǔn)化測試。血小板活化觸發(fā)血栓形成，活化的血小板水平和能力是預(yù)測血栓形成事件的有用指標(biāo)[1]，深入了解測量血小板活化在PFT 中的應(yīng)用將有助于開發(fā)更具有標(biāo)準(zhǔn)化的測試。

1 血小板功能測試研究現(xiàn)狀

1910 年，Duke 將出血時間用于評估血栓形成能力，是歷史上第一個PFT 方法[2]。直至1963 年P(guān)FT 有了突破性的進展，BORN[3]推出了首個測量血小板聚集的方法-光學(xué)比濁法(light transmission aggregometry，LTA)，曾被認(rèn)為是PFT的金標(biāo)準(zhǔn)，但LTA不能顯示血小板的活化，受到血小板計數(shù)的影響，需要較多的血液標(biāo)本量，繁瑣的程序不允許同時自動測量或評估大量樣品[4-6]。近20 年來，PFT 得到了改進，根據(jù)不同的病理機制開展了許多測量血小板黏附、聚集的PFT方法，例如多電極聚集法、血小板功能檢測儀-100、血栓彈力圖等，這些方法不像LTA 那樣繁瑣，可用于床旁快速分析血小板功能，但也無法顯示血小板的體內(nèi)活化，高度依賴于血小板計數(shù)。目前，測量血小板活化的流式細(xì)胞術(shù)在減少血液消耗、血小板減少癥患者中的應(yīng)用有了重大改進，該方法分析單個血小板的功能，測量單個血小板上血小板活化標(biāo)志物的表達，這在很大程度上獨立于血小板計數(shù)，可作為基于血小板聚集測量的PFT 的首選替代方案[6-7]。流式細(xì)胞術(shù)作為量化血小板活化水平的可靠技術(shù)，使得血小板活化分析在PFT中的應(yīng)用顯示出了前景。

2 血小板活化在血栓形成中起關(guān)鍵作用

血小板活化是一個復(fù)雜的多因素過程，涉及黏附、釋放、聚集等多種途徑。首先，血小板黏附在受損的血管壁上，黏附蛋白和可溶性激動劑與其各自血小板膜受體的結(jié)合后傳導(dǎo)信號觸發(fā)血小板活化[8]。這些誘導(dǎo)血小板活化信號的傳導(dǎo)機制、放大網(wǎng)絡(luò)及各信號傳導(dǎo)之間串?dāng)_的確切性質(zhì)是一個值得深入探索的重要領(lǐng)域，有助于揭示血栓疾病的新治療靶點。其次，血小板活化后，血小板膜上的磷脂酶A2 分解花生四烯酸，釋放出血栓烷A2 (thromboxane A2，TXA2)，可將循環(huán)血小板募集到血凝塊中，并誘導(dǎo)血管平滑肌收縮，加速止血過程[9]。此外，血小板還從各種存儲顆粒、細(xì)胞外囊泡及血小板膜蛋白的水解脫落釋放生物活性因子。血小板包含三種主要類型的存儲顆粒：α-顆粒、δ-顆粒和溶酶體，當(dāng)顆粒膜與血小板表面或開放小管系統(tǒng)中的質(zhì)膜融合時，顆粒能夠?qū)⒖扇苄灶w粒分子釋放到細(xì)胞外液中，如5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、血小板因子-4 (platelet factor 4，PF4)、β-血栓球蛋白(βthromboglobulin，β-TG)等，一些膜結(jié)合顆粒分子則黏附在活化血小板表面表達，如P-選擇素(P-selectin，Psel)等[10]，這些釋放的因子能夠增強血小板活化信號，激活處于休眠狀態(tài)的血小板，極大地促進了血栓的形成[11]。血小板活化后通過血小板衍生的細(xì)胞外囊泡(platelet extracellular vesicle，PEVs)釋放的微粒、外泌體，能介導(dǎo)細(xì)胞通訊，具有促血栓形成活性[12]。長時間強烈刺激血小板活化后，金屬蛋白酶介導(dǎo)血小板膜蛋白受體的水解釋放出可溶性脫落蛋白，如可溶性糖蛋白VI (soluble glycoprotein VI，sGPVI)、可溶性糖蛋白V(soluble glycoprotein V，sGPV)等，可促進凝血因子與血小板的結(jié)合、凝血酶和纖維蛋白的形成[13]。近年來，血小板蛋白質(zhì)組的研究進展迅速，對血小板活化釋放的生物活性因子的研究越來越多，促進了血小板活化釋放因子在PFT中的發(fā)展。最終，激動劑激活血小板觸發(fā)的信號通路匯聚為共同通路，誘導(dǎo)“由內(nèi)而外”的信號傳導(dǎo)過程，激活糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 的配體結(jié)合功能，介導(dǎo)血小板聚集并觸發(fā)“由外向內(nèi)”信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致血小板擴散、凝塊收縮，形成穩(wěn)定血栓[14]。

3 血小板活化釋放因子在血小板功能測試中的臨床應(yīng)用

血栓形成由血小板活化觸發(fā)，血小板活化中的釋放反應(yīng)是關(guān)鍵步驟，血小板活化釋放因子在放大血小板活化、募集循環(huán)血小板聚集、穩(wěn)定血栓起著關(guān)鍵作用。血小板活化釋放因子水平變化與血小板功能密切相關(guān)，可作為PFT的生物標(biāo)志物。

3.1 血栓性疾病患者的血小板功能測試 血小板活化釋放因子水平的升高可用于早期識別血小板功能亢進，預(yù)測血栓形成趨勢，指導(dǎo)血栓治療或預(yù)防、改善患者臨床結(jié)局。血小板活化釋放因子中研究最多的是α-顆粒釋放在血小板表面膜上的P-sel，部分以可溶形式釋放到血漿中形成可溶性P-選擇素(solubleP-selectin，sP-sel)。暴露在血小板表面膜上的P-sel迅速與白細(xì)胞結(jié)合，形成的血小板-白細(xì)胞聚集體(platelet-leucocyte aggregates，PLA)是比P-sel更敏感的體內(nèi)血小板活化釋放標(biāo)志物，在晚期動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合征、急性腦梗死、新型冠狀病毒-感染并發(fā)血栓形成的患者中明顯升高[15-18]。與動脈血栓性疾病相比，盡管靜脈血栓性疾病傳統(tǒng)上認(rèn)為不是一種依賴于血小板激活的疾病，但血小板在靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)中的作用仍然是探索熱點，RIVA等[19]在隨機收取的100例急診就診患者樣本中顯示sP-sel 對VTE 有良好的預(yù)測價值，是僅次于D-二聚體最相關(guān)的生物標(biāo)志物。然而SCHORLING等[20]在癌癥患者中并未證明sP-sel 對VTE 的預(yù)測價值，造成這種差異的可能原因是基線患者特征的不同，有必要對不同人群開展sP-sel 與VET 風(fēng)險相關(guān)性的研究。P-sel 及其衍生物有望成為血栓性疾病中有吸引力的PFT 標(biāo)志物。測量儲存在血小板δ-顆粒中的5-HT釋放試驗(serotonin release assay，SRA)是專門用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥-Ⅱ(heparin-induced thrombocytopenia Ⅱ，HIT-Ⅱ)、新型冠狀病毒疫苗引起的免疫血栓性血小板減少癥的PFT 方法[21-22]，5-HT 的水平反映該類患者血小板活化程度，有助于早期識別繼發(fā)的血栓形成傾向。SRA 雖然視為HIT 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但技術(shù)要求高、耗時長，RUNSER 等[23]在85%的HIT-Ⅱ患者中發(fā)現(xiàn)P-sel水平增高，認(rèn)為是該類患者血小板活化的最佳標(biāo)志物，用流式細(xì)胞術(shù)測量P-sel水平替代SRA，是HIT-Ⅱ患者PFT 方法的新興領(lǐng)域。在過去幾十年中，血小板膜蛋白受體水解釋放的可溶性脫落蛋白得到了廣泛的研究。糖蛋白Ⅵ(glycoproteinⅥ，GPⅥ)和糖蛋白Ib/Ⅸ/V(glycoprotein Ib/Ⅸ/V，GPI b/Ⅸ/V)復(fù)合物是血小板黏附階段重要的血小板表面黏附受體，血小板活化后由酶介導(dǎo)受體脫落釋放sGPⅥ、sGPV，在血栓和凝血障礙疾病中升高。紅細(xì)胞和血小板計數(shù)、總膽固醇、吸煙和近期食物攝入量是sGP V水平的重要決定因素，作為PFT 標(biāo)志物的臨床研究中必須加以考慮[24]。相比，由于sGPⅥ血漿水平的穩(wěn)定性，不受年齡、性別或吸煙的影響，是血栓性疾病中PFT 的一個極好的候選標(biāo)志物，也可以作為陰性預(yù)測因子來排除異常血小板活化[25]。近年來，在血栓性疾病中尋找新的、可靠的PFT 標(biāo)志物的過程中，有研究發(fā)現(xiàn)PEVs 水平與動脈血栓形成、急性缺血性腦卒中等疾病之間存在關(guān)聯(lián)[26-27]，是血小板活化、血栓形成、炎癥和內(nèi)皮功能障礙的新興標(biāo)志物，備受關(guān)注。迄今為止，這種有前景的標(biāo)志物缺乏更標(biāo)準(zhǔn)化的測量，隨著PEVs分離和檢測技術(shù)的進步將在血栓性疾病的應(yīng)用中迎來發(fā)展。

3.2 出血性疾病患者的血小板功能測試 評估出血性疾病患者需先對出血史、家族史和體格檢查進行客觀的臨床評估，隨后進行血小板計數(shù)、凝血等實驗室檢查均不能完全解釋出血癥狀時，再進一步行血小板功能測試。測量存儲顆粒釋放因子可用于診斷遺傳性血小板功能障礙中的血小板顆粒含量或分泌異?；颊?，通過測量血小板δ-顆粒中ADP釋放和血小板聚集的Lumi-LTA 法，用作臨床懷疑血小板功能缺陷患者首選的PFT方法[28]，測量α-顆粒中的PF4 和β-TG 的釋放，有助于出血性疾病α-顆粒蛋白異常水解的魁北克血小板病的診斷[29]。通過ELISA 或蛋白質(zhì)印跡法測量α-顆粒蛋白的水平來評估α-顆粒釋放的技術(shù)相當(dāng)繁瑣，目前更廣泛使用的方法是通過流式細(xì)胞術(shù)測量α-顆粒釋放在血小板表面膜上P-sel，如灰色血小板綜合征的診斷[30]。此外，P-sel的測量還可以與其他血小板功能評估相結(jié)合，DOVLATOVAL 等[31]認(rèn)為P-sel 和CD63具有診斷疑似輕度出血性疾病的潛力。血小板膜蛋白受體的水解脫落除了在血栓性疾病的研究之外，另一方面，血小板表面的黏附受體過度水解脫落會降低受體的表面密度，從而減弱血小板信號傳導(dǎo)、活化，導(dǎo)致繼發(fā)性血小板功能障礙。有研究在左心室輔助裝置植入、肝素誘導(dǎo)血小板減少癥、創(chuàng)傷患者中發(fā)現(xiàn)出血并發(fā)癥與極高水平的sGPⅥ密切相關(guān)，病理性剪切力、病理性血小板活化和纖維蛋白沉積等是導(dǎo)致sGPⅥ過度脫落和血小板功能障礙的機制[32-34]，將sGPⅥ確定為該類出血性疾病的PFT標(biāo)志物，需要更多前瞻性的驗證。

3.3 血小板功能測試以監(jiān)測抗血小板治療的反應(yīng) 由于對抗血小板藥物治療的反應(yīng)存在個體差異，部分患者即使接受規(guī)律抗血小板治療后仍然會再發(fā)缺血性事件，血小板持續(xù)活化稱為治療后殘留血小板的高反應(yīng)性(hight treatment platelet reactivity，HPR)，通過PFT 可監(jiān)測抗血小板治療反應(yīng)以期指導(dǎo)個體化抗血小板方案，是提高治療效果的有效手段。阿司匹林通過不可逆地乙酰化血小板環(huán)氧化酶-1 從而抑制TXA2 的釋放來發(fā)揮其主要的抗血栓作用，因此，TXA2的下游代謝物尿11-脫氫血栓烷B2(11-dehydrothromboxane B2，11-dhTxB2)的測量是對阿司匹林的藥效反應(yīng)相對直接的PFT方法，規(guī)律服用阿司匹林后尿11-dhTxB2＞1 500 pg/mg被定義為阿司匹林HPR[35]，DHARMASAROJA 等[36]證明通過尿11-dhTxB2檢測的阿司匹林HPR患者與心血管不良事件的復(fù)發(fā)和死亡有關(guān)，但基于尿11-dhTxB2檢測結(jié)果制定的個體化抗血小板方案的效果仍不清楚，WANG等[37]尚未完成隨訪和數(shù)據(jù)驗證，后續(xù)將繼續(xù)追蹤。由于P-sel表達與血小板活化更直接相關(guān)，激動劑刺激血小板并測量產(chǎn)生的P-sel 可用于評估抗血小板治療反應(yīng)性的整體測量。規(guī)律抗血小板治療后P-sel 的中值熒光(median fluorescence，MF)＞500 U 定義為阿司匹林HPR，MF＞860 U 定義為氯吡格雷HPR，THOMAS等[38]證明基于P-sel 檢測的氯吡格雷HPR 與心血管缺血事件復(fù)發(fā)有關(guān)，然而APPLETON等[39]卻未在腦缺血事件復(fù)發(fā)患者中發(fā)現(xiàn)與氯吡格雷HPR的關(guān)聯(lián)，后續(xù)應(yīng)在更多不同患病群體中研究，還需進一步研究基于Psel 的檢測結(jié)果指導(dǎo)個體化抗血小板方案的有效性。此外，KLINKHARDT 等[40]在炎癥反應(yīng)起重要作用的外周動脈閉塞性疾病中認(rèn)為PLA 可作為監(jiān)測抗血小板治療反應(yīng)的PFT 標(biāo)志物，但它不適用于短期、急性事件中應(yīng)用。TOMANIAK 等[41]許多研究表明抗板藥物會影響PEVs釋放，使用標(biāo)準(zhǔn)化的方法檢測PEVs可能成為未來監(jiān)測抗血小板治療反應(yīng)性的另一種PFT實用標(biāo)志物。

3.4 輸血醫(yī)學(xué)、圍手術(shù)期的血小板功能測試 PFT在輸血醫(yī)學(xué)中的主要應(yīng)用是確定血小板濃縮物(platelet concentrates，PC)的質(zhì)量，評估血小板功能狀態(tài)，以保證其輸注后止血的能力。在PC儲存期間，血小板功能喪失與進行性血小板活化相關(guān)，因此，血小板活化后釋放因子可用于評估PC 質(zhì)量的PFT 標(biāo)志物。KICKEN 等[42]發(fā)現(xiàn)PC 質(zhì)量與P-sel 表達密切相關(guān)，與自發(fā)性P-sel 表達量呈負(fù)相關(guān)，與激動劑刺激Psel 表達量呈正相關(guān)。此外，越來越多的研究也將sGPV、sGPVI、PLA、PEVs作為PC的質(zhì)量評估標(biāo)志物，測量PC 中的PEVs 形成是新興領(lǐng)域，因為PEVs 除了是血小板活化的標(biāo)志物，還可以提供PC 老化和功能的定性信息[43]。盡管已經(jīng)提出了幾種不同的用于測量PC 質(zhì)量的標(biāo)志物，但尚無評估PC 的黃金標(biāo)準(zhǔn)，因此，需要更多的研究來準(zhǔn)確測量PC血小板功能。圍手術(shù)期血小板功能的測量似乎有助于術(shù)后止血控制，減少不必要的血小板輸注。KICKEN等[44]將P-sel用作PFT標(biāo)志物調(diào)查血小板功能對結(jié)直腸手術(shù)后的影響，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)血小板功能與術(shù)后出血的發(fā)生率、嚴(yán)重程度等無關(guān)。未來需要通過大型隨機試驗進一步研究P-sel及其他血小板活化釋放因子是否可以用作圍手術(shù)期PFT的生物標(biāo)志物。

4 展望

血小板活化釋放因子的測量可以判斷體內(nèi)血小板的基礎(chǔ)活化水平評估血小板功能，以更好地預(yù)測血栓或出血風(fēng)險，在檢測中加入外源性激動劑后測量還可以分析體外血小板的反應(yīng)性，以評估藥物治療反應(yīng)、PC 質(zhì)量監(jiān)測等?；谘“寤罨尫乓蜃拥臏y量是對現(xiàn)有常用PFT的有用補充，新測定法的潛在臨床效用正在顯現(xiàn)，但需要進一步的前瞻性研究來明確其應(yīng)用價值。相信隨著研究的不斷深入以及新興技術(shù)的發(fā)展，未來PFT 一定能夠更加規(guī)范化，改善臨床實踐。