黃酒多酚誘導(dǎo)沉默調(diào)節(jié)蛋白3表達(dá)減輕阿霉素心肌損傷研究

孫世民，孫珍珠，池菊芳，郭航遠(yuǎn)，4*

本研究價(jià)值：

（1）沉默調(diào)節(jié)蛋白3（SIRT3）是線粒體相關(guān)的重要蛋白，本研究通過SIRT3作為連接，提供了研究阿霉素（DOX）與心肌細(xì)胞線粒體的橋梁，并且進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了線粒體功能在心肌細(xì)胞中的重要作用；（2）黃酒多酚（YWPC）對(duì)緩解DOX所致心肌損傷的過程仍有不明晰的內(nèi)容，本研究提出了YWPC緩解DOX引起心肌損傷的新的可能途徑。

本研究局限性：

（1）未能通過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)增加SIRT3表達(dá)水平，進(jìn)一步證明SIRT3后續(xù)作用；（2）沒有深入探究線粒體功能改變對(duì)YWPC的影響。

自20世紀(jì)50年代第一個(gè)蒽環(huán)類藥物被發(fā)現(xiàn)以來，因其在各類腫瘤治療中的明顯效果而被廣泛應(yīng)用于臨床治療［1］。阿霉素（即多柔比星，Doxorubicin，DOX）是一種蒽環(huán)類藥物，對(duì)白血病及多種實(shí)體腫瘤均有較好的臨床治療效果，但在臨床應(yīng)用中常因其劑量依賴性、進(jìn)展性、不可逆性心肌損傷而受到限制，如DOX在兒童癌癥治療后會(huì)形成長期心肌損傷［2-3］。DOX誘導(dǎo)的心肌損傷機(jī)制十分復(fù)雜，包括線粒體功能障礙、DNA損傷、鐵代謝受損、細(xì)胞凋亡及自噬失調(diào)等多種途徑［4］，目前如何預(yù)防蒽環(huán)類藥物引起的心肌損傷仍無法形成共識(shí)。多酚類物質(zhì)是一類具有抗腫瘤、抗氧化、清除氧自由基和保護(hù)心血管作用的天然化學(xué)物，本研究團(tuán)隊(duì)前期研究以黃酒及其主要成分黃酒多酚（Yellow Wine Polyphenol Compounds，YWPC）為研究對(duì)象，探究其對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YWPC具有緩解DOX所致心臟毒性的作用。研究表明，YWPC可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的核易位水平緩解DOX引起的氧化應(yīng)激及心臟毒性［5-6］。除引起氧化應(yīng)激反應(yīng)外，破壞線粒體功能的完整性也是DOX引起心臟毒性的重要原因，而沉默調(diào)節(jié)蛋白3（SIRT3）是線粒體中的Ⅲ類組蛋白脫乙?；?，主要通過調(diào)節(jié)賴氨酸的乙酰化來調(diào)節(jié)線粒體網(wǎng)絡(luò)。SIRT3通過對(duì)細(xì)胞線粒體的代謝功能等進(jìn)行調(diào)節(jié)，減少心臟損傷過程中活性氧的生成，在與心肌損傷相關(guān)的許多通路中發(fā)揮著重要作用［7］。由于多酚類化合物表現(xiàn)出較好的線粒體保護(hù)作用［8-9］，因此推測(cè)YWPC可以通過調(diào)節(jié)SIRT3表達(dá)水平降低心肌細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)而降低DOX的心臟毒性。為進(jìn)一步探究YWPC在DOX心肌損傷中的作用機(jī)制，本研究擬通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)?zāi)MDOX心肌損傷，并由此觀察SIRT3在其中發(fā)揮的作用，為后期研究SIRT3在DOX心肌損傷中的作用及線粒體的功能打下基礎(chǔ)，為治療DOX心肌病提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，6～8周齡，體質(zhì)量（250±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供〔許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005〕。體外實(shí)驗(yàn)采用的大鼠心肌細(xì)胞H9C2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。本研究通過紹興市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（倫理批號(hào)：2020-012）。

1.2 研究試劑 DOX（貨號(hào)：HY-15142）、SIRT3抑制劑（3-TYP）（貨號(hào)：HY-108331） 購 自MCE公司；YWPC由上海中藥制藥技術(shù)有限公司分離提取，純度＞60%；胎牛血清（FBS）（貨號(hào)：10270-106）購自Gibco公司；抗SIRT3抗體（貨號(hào)：ab86671）、抗B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白（Bcl-2）抗體（貨號(hào)：ab32124）及抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（貨號(hào)：ab32503）均購自Abcam公司；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及二抗購自Cell Signaling Technology公司；原位末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒購自Roche公司；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或達(dá)到國產(chǎn)分析純（AR）級(jí)別。

1.3 研究方法

1.3.1 大鼠DOX心肌損傷模型的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組動(dòng)物適用性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、YWPC組、DOX組與DOX+YWPC組。DOX組及DOX+YWPC組大鼠每周通過尾靜脈注射1次2.5 mg/kg的DOX，共注射6周，累計(jì)劑量15 mg/kg；另外兩組大鼠每周通過尾靜脈注射等量的0.9%氯化鈉溶液。DOX+YWPC組及YWPC組大鼠每日中午12時(shí)通過灌胃給予30 mg/kg（總體積2 ml）的YWPC，另外兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液，每次灌胃后觀察30 min。實(shí)驗(yàn)大鼠均在6周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血清乳酸脫氫酶（LDH）水平檢測(cè) 動(dòng)物L(fēng)DH檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物公司，于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)結(jié)束后、大鼠心臟摘除前使用采血針刺入大鼠左心室取血，分離大鼠血清并用于LDH水平的檢測(cè)，按照試劑盒說明書將各項(xiàng)檢測(cè)液混合后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值。

1.3.3 心臟組織的獲取及保存 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)結(jié)束后，將大鼠心臟取出并橫向切分，其中上半部分心臟組織置于液氮中保存待Western Blot法檢測(cè)使用，下半部分用于組織切片的制備，浸泡于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)過常規(guī)脫水、浸蠟、包埋后制成切片。

1.3.4 MASSON染色和免疫組織化學(xué)染色 MASSON染色時(shí)取各組大鼠心肌新切片脫蠟處理至水，按照MASSON染色試劑盒說明書染色后封片，顯微鏡下觀察各組大鼠心肌切片的心肌纖維形態(tài)/結(jié)構(gòu)、藍(lán)色膠原纖維顯色水平；免疫組織化學(xué)染色時(shí)將各組大鼠心肌新切片脫蠟處理至水，按照一般流程進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加抗SIRT3抗體（抗體濃度為1∶200）后4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后滴加二抗孵育，按照二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒的使用方法進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色終止后使用蘇木素染色液將核染為藍(lán)色，染色結(jié)束后脫水、封片，觀察所顯棕黃色的面積與顏色深淺，即SIRT3表達(dá)水平。

1.3.5 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將各組大鼠心肌新切片脫蠟處理至水，用蛋白酶K 37 ℃孵育30 min，滴加TUNEL反應(yīng)液并37 ℃避光孵育1 h，用PBS沖洗后使用二氨基苯基吲哚（DAPI）進(jìn)行核染，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，其中綠色亮點(diǎn)代表細(xì)胞凋亡。

1.3.6 組織總蛋白提取及Western Blot法檢測(cè) 取保存在液氮中的新鮮、適量、等質(zhì)量的各組大鼠心肌組織，使用電動(dòng)勻漿器冰上勻漿裂解，提取組織總蛋白。使用喹啉甲酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)結(jié)果加入適量上樣緩沖液，稀釋配平后制成蛋白質(zhì)樣品以用于Western Blot法檢測(cè)。為測(cè)定凋亡水平（Bcl-2及Bax蛋白）和SIRT3表達(dá)水平的改變情況，分別使用抗Bcl-2、Bax、SIRT3和內(nèi)參GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，圖像處理分析軟件（Image J）對(duì)各組大鼠心肌Bcl-2、Bax、SIRT3及GAPDH條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.3.7 體外大鼠H9C2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 H9C2細(xì)胞在杜氏高糖培養(yǎng)基（DMEM）、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，同一代一批H9C2細(xì)胞被隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、DOX組、DOX+YWPC（1 mg/L）組、DOX+YWPC（10 mg/L）與DOX+YWPC（100 mg/L），不同濃度的YWPC在添加DOX 12 h前進(jìn)行預(yù)添加，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約70%融合時(shí)添加1 μmol/L的DOX，干預(yù)24 h得到體外DOX心肌損傷模型，采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性，采用Western Blot法測(cè)定蛋白表達(dá)情況，每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 H9C2細(xì)胞中3-TYP的應(yīng)用 在明確YWPC影響DOX引起H9C2細(xì)胞凋亡及SIRT3表達(dá)水平改變后，為進(jìn)一步明確SIRT3在實(shí)驗(yàn)過程中的作用，將同一代另一批H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、DOX組、DOX+YWPC組、DOX+3-TYP組及DOX+YWPC+3-TYP組。DOX干預(yù)濃度為1 μmol/L，干預(yù)時(shí)間為24 h；DOX+YWPC組與DOX+YWPC+3-TYP組在添加DOX 12 h前使用10 mg/L YWPC進(jìn)行預(yù)干預(yù)；DOX+3-TYP組與DOX+YWPC+3-TYP組在添加DOX 4 h前使用5μmol/L 3-TYP進(jìn)行預(yù)干預(yù)，采用Western Blot法測(cè)定蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9 CCK-8法 為檢測(cè)各干預(yù)條件對(duì)細(xì)胞活性的影響，將H9C2細(xì)胞種于96孔板中，每孔約5 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)復(fù)孔3個(gè)。細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，干預(yù)結(jié)束后按照CCK-8試劑盒說明書在每一個(gè)孔加入10 μl反應(yīng)液，37 ℃培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀讀取各孔450 nm處吸光度值，繪制吸光度值曲線，以吸光度值代表細(xì)胞活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件繪圖，SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YWPC緩解DOX引起的大鼠心肌細(xì)胞損傷 大鼠心肌切片通過MASSON染色后可見：DOX組大鼠心肌纖維排列紊亂，大量藍(lán)色膠原纖維貫穿心肌纖維；DOX+YWPC組大鼠心肌切片紋理部分恢復(fù)，藍(lán)色膠原纖維減少（圖1）。四組膠原纖維占比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組膠原纖維占比高于對(duì)照組、DOX+YWPC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。四組LDH水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組血清LDH水平高于對(duì)照組、DOX+YWPC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 YWPC緩解DOX引起的大鼠心肌細(xì)胞損傷Figure 1 Effect of YWPC in alleviating DOX-induced myocardial injury in the in vivo experiment with four groups of rats

2.2 YWPC緩解DOX引起的大鼠心肌細(xì)胞凋亡 將各組大鼠心臟組織制成蛋白樣品后進(jìn)行Western Blot法檢測(cè)。四組Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組Bcl-2/Bax比值低于對(duì)照組、DOX+YWPC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。將大鼠心肌切片進(jìn)行TUNEL染色，可見DOX組的大鼠心肌切片中代表凋亡的綠色亮點(diǎn)明顯增多，呈片狀分布，而經(jīng)YWPC治療后凋亡亮點(diǎn)減少，見圖2。

圖2 YWPC緩解DOX引起的大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況Figure 2 Effect of YWPC in alleviating myocardial cell apoptosis due to DOX-induced myocardial injury explored in the in vivo experiment with four groups of rats

表1 大鼠心肌損傷相關(guān)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Table 1 Results of YWPC in alleviating DOX-induced myocardial injury explored in the in vivo experiment with four groups of rats

表1 大鼠心肌損傷相關(guān)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Table 1 Results of YWPC in alleviating DOX-induced myocardial injury explored in the in vivo experiment with four groups of rats

注：a表示與DOX組比較，P＜0.05；YWPC=黃酒多酚，DOX=阿霉素，LDH=乳酸脫氫酶，Bcl-2=B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白，Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白，SIRT3=沉默調(diào)節(jié)蛋白3

S I R T 3表達(dá)水平對(duì)照組 6 2 5.7 4±0.7 9 a 3 7 7 3.7 9±2 0 1.6 1 a 1.0 4±0.1 0 a 0.9 9±0.0 8 a Y W P C 組 6 2 4.7 3±3.3 1 4 0 5 9.8 8±3 5.0 8 0.9 0±0.0 6 0.8 4±0.0 5 D O X組 6 3 8.5 0±1.1 9 5 5 4 6.9 1±1 3 7.3 7 0.1 9±0.0 1 0.2 9±0.0 8 D O X+Y W P C組 6 3 1.6 8±1.1 3 a 4 4 9 1.6 8±1 4 9.9 3 a 0.5 7±0.0 2 a 0.5 3±0.0 4 a F值 6 7.7 6 1 7 4.3 2 4 4.0 1 3 9.7 P 值 ＜0.0 1 ＜0.0 1 ＜0.0 1 ＜0.0 1組別 只數(shù) 膠原纖維占比（%）L D H（U/L）B c l-2/B a x比值

2.3 YWPC緩解DOX引起的H9C2細(xì)胞凋亡 通過CCK-8法比較DOX作用下各組H9C2細(xì)胞的存活率，五組吸光度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組吸光度值低于對(duì)照組、DOX+YWPC（1 mg/L）組、DOX+YWPC（10 mg/L）組、DOX+YWPC（100 mg/L）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過Western Blot法檢測(cè)H9C2細(xì)胞蛋白表達(dá)水平，五組Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組Bcl-2/Bax比值低于對(duì)照組、DOX+YWPC（1 mg/L）組、DOX+YWPC（10 mg/L）組、DOX+YWPC（100 mg/L）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 H9C2細(xì)胞CCK-8及Western Blot法檢測(cè)結(jié)果（±s，n=3）Table 2 Results of viability measured by CCK-8 assay，and levels of apoptosis and SIRT3 measured by Western blotting in DOX-injured H9C2 cells

表2 H9C2細(xì)胞CCK-8及Western Blot法檢測(cè)結(jié)果（±s，n=3）Table 2 Results of viability measured by CCK-8 assay，and levels of apoptosis and SIRT3 measured by Western blotting in DOX-injured H9C2 cells

注：a表示與DOX組比較，P＜0.05

SIRT3表達(dá)水平對(duì)照組 1.93±0.01a 1.08±0.09a 1.11±0.18a DOX 組 0.74±0.03 0.08±0.01 0.47±0.05組別 吸光度值 Bcl-2/Bax比值DOX+YWPC（1 mg/L）組 0.94±0.04a 0.27±0.02a 0.89±0.08a DOX+YWPC（10 mg/L）組 1.11±0.05a 0.30±0.05a 0.91±0.10a DOX+YWPC（100 mg/L）組 1.35±0.02a 0.50±0.01a 0.95±0.25a F值 605.1 256.2 8.142 P值 ＜0.01 ＜0.01 0.004

圖3 YWPC緩解DOX引起的H9C2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Figure 3 Effect of YWPC in alleviating apoptosis in DOX-injured H9C2 cells explored in the in vitro experiment

2.4 體內(nèi)外SIRT3表達(dá)情況 在動(dòng)物組織蛋白中，四組SIRT3表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組SIRT3表達(dá)水平低于對(duì)照組、DOX+YWPC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。利用免疫組織化學(xué)染色觀察到各組切片中SIRT3表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與大鼠心臟組織Western Blot法檢測(cè)結(jié)果變化趨勢(shì)基本一致。在H9C2細(xì)胞中，五組SIRT3表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組SIRT3表達(dá)水平低于對(duì)照組、DOX+YWPC（1 mg/L） 組、DOX+YWPC（10 mg/L） 組、DOX+YWPC（100 mg/L）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 4、表 1～2。

圖4 大鼠心臟組織、H9C2細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)情況Figure 4 Expression levels of SIRT3 in DOX-injured myocardial tissues of rat model and DOX-injured H9C2 cell model

2.5 3-TYP對(duì)YWPC作用的影響 對(duì)照組、DOX組、DOX+YWPC組、DOX+3-TYP組及DOX+YWPC+3-TYP組Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組及DOX+3-TYP組Bcl-2/Bax比值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DOX+YWPC+3-TYP組Bcl-2/Bax比值低于DOX+YWPC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。五組SIRT3表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中DOX組、DOX+3-TYP組SIRT3表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但DOX+YWPC組與DOX+YWPC+3-TYP組SIRT3表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5、表3。

表3 3-TYP作用下H9C2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及SIRT3表達(dá)水平變化（±s，n=3）Table 3 Changes of expression levels of apoptosis-related protein and SIRT3 in DOX-injured H9C2 cells intervened with 3-TYP

表3 3-TYP作用下H9C2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及SIRT3表達(dá)水平變化（±s，n=3）Table 3 Changes of expression levels of apoptosis-related protein and SIRT3 in DOX-injured H9C2 cells intervened with 3-TYP

注：a表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；b表示與DOX+YWPC組比較，P＜0.05

組別 Bcl-2/Bax比值 SIRT3表達(dá)水平對(duì)照組 1.06±0.18 1.03±0.08 DOX 組 0.15±0.01a 0.53±0.09a DOX+YWPC組 0.56±0.02 0.81±0.03 DOX+3-TYP 組 0.14±0.01a 0.40±0.16a DOX+YWPC+3-TYP 組 0.08±0.01b 0.63±0.23 F值 401.6 9.979 P值 ＜0.01 0.0016

圖5 3-TYP作用下H9C2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及SIRT3表達(dá)水平Figure 5 Expression levels of apoptosis-related proteins and SIRT3 in DOX-injured H9C2 cells intervened with 3-TYP

3 討論

DOX具有廣泛的抗癌譜和較高的臨床療效，是多種癌癥的一線化療藥物，然而DOX的嚴(yán)重心臟毒性作用較大，使其臨床應(yīng)用受到了一定限制［10］。DOX與心肌有較高的親和力，長期暴露在DOX中可能導(dǎo)致較為嚴(yán)重的心肌損傷，甚至引發(fā)心力衰竭，威脅患者生命［11］。目前臨床上控制DOX心臟毒性的常用策略有：限制劑量暴露、將藥物包裹在脂質(zhì)體中減少心肌攝取、與鐵螯合劑右雷佐生同時(shí)給藥以減少游離鐵催化的活性氧的形成以及改變藥物結(jié)構(gòu)等［12］。盡管如此，DOX引起的心力衰竭仍在繼續(xù)發(fā)生，部分原因是其分子和細(xì)胞作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議且尚未被完全理解［13］，目前如何有效防治DOX誘導(dǎo)的心肌損傷是許多研究的探索方向。各類天然化合物，如積雪草酸、α-亞麻酸、黃酮類、類黃酮類化合物以及酚類化合物等均可通過抗氧化、減少應(yīng)激及自噬調(diào)節(jié)等途徑起到緩解DOX誘導(dǎo)的心肌損傷的作用［14-17］。近年來，多酚類物質(zhì)的抗氧化活性成為研究熱點(diǎn)，研究證實(shí)其在控制心血管系統(tǒng)疾病方面有多種保護(hù)作用，例如SHAKERI等［18］提出姜黃素通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而在多種疾?。ò▌?dòng)脈粥樣硬化）中起著重要作用；SERGAZY等［19］提出葡萄多酚提取物可以增加血漿中的抗氧化劑水平并降低自由基水平，具有一定的逆轉(zhuǎn)DOX心肌損傷的能力和心臟保護(hù)作用。本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)黃酒及其主要成分YWPC也進(jìn)行了長期深入的研究，發(fā)現(xiàn)YWPC在心血管系統(tǒng)中在減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抑制平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等方面均有作用［20-22］，并且證實(shí)了YWPC可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Nrf2的核易位水平緩解DOX引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)及在DOX所致心臟毒性中的保護(hù)作用［6］，但仍有進(jìn)一步研究其他作用機(jī)制的必要。SIRT3通過對(duì)細(xì)胞線粒體的代謝等進(jìn)行調(diào)節(jié)而減少心臟毒性發(fā)生過程中的活性氧的生成，并通過對(duì)叉頭框蛋白O3（FOXO3）、P53及腺苷一磷酸（AMP）等信號(hào)通路的作用在許多心臟毒性機(jī)制的控制點(diǎn)發(fā)揮重要作用［7］。本研究作為對(duì)YWPC緩解DOX心肌損傷作用機(jī)制的補(bǔ)充，進(jìn)一步完善了YWPC在心肌細(xì)胞內(nèi)的作用途徑，同時(shí)也進(jìn)一步明確了心肌細(xì)胞中SIRT3改善心臟狀態(tài)的作用，為臨床及科研人員開發(fā)DOX新型保護(hù)劑提供了理論依據(jù)。

本研究采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過比較DOX組與DOX+YWPC組的Masson染色結(jié)果、血清LDH水平和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改變，發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中DOX組較對(duì)照組心肌損傷更嚴(yán)重，其中血清LDH水平上升提示心肌損傷程度加重，Bcl-2/Bax比值下降提示心肌細(xì)胞凋亡增加；與DOX組相比，DOX+YWPC組心肌損傷較輕，血清LDH水平部分恢復(fù)，Bcl-2/Bax比值上升，提示YWPC可以在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中降低心肌細(xì)胞凋亡水平，進(jìn)而緩解心肌損傷。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了細(xì)胞活性的比較和細(xì)胞模型中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較，其中DOX組較對(duì)照組吸光度值減少且Bcl-2/Bax比值下降，提示DOX引起細(xì)胞凋亡后降低了細(xì)胞活性，而使用不同濃度YWPC進(jìn)行干預(yù)后，與DOX組相比，DOX+YWPC組吸光度值上升且Bcl-2/Bax比值也上升，得到了與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相一致的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)YWPC可以降低心肌細(xì)胞凋亡水平，維持細(xì)胞存活，這些結(jié)論與早期YWPC相關(guān)研究結(jié)果一致［5，17］。通過對(duì)動(dòng)物切片免疫組織化學(xué)染色、動(dòng)物組織及H9C2細(xì)胞Western Blot法發(fā)現(xiàn)，在DOX及YWPC作用的過程中SIRT3表達(dá)水平發(fā)生了改變：與對(duì)照組相比，使用DOX會(huì)使動(dòng)物心臟內(nèi)和H9C2細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)水平下降；在YWPC的作用下，DOX+YWPC各組中SIRT3蛋白表達(dá)水平升高，提示SIRT3可能參與了DOX與YWPC作用的過程，對(duì)比其他研究者關(guān)于SIRT3在DOX引起的心肌毒性中作用的相關(guān)研究下如：YANG等［23］認(rèn)為高SIRT3表達(dá)水平及活性可以有效減輕DOX心肌毒性，SALEH等［24］也提出恢復(fù)氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）/SIRT3信號(hào)在治療DOX心肌毒性中具有重要作用，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符。由于YWPC相關(guān)研究較少，且SIRT3在其中的作用仍不明確，為了進(jìn)一步探究SIRT3在YWPC緩解DOX引起心肌損傷過程中的作用，本研究通過進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用3-TYP抑制SIRT3功能后，YWPC緩解DOX心肌凋亡的作用被抑制，提示YWPC可能通過調(diào)節(jié)SIRT3減輕心肌損傷，但這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，YWPC可能通過上調(diào)SIRT3的表達(dá)起到保護(hù)心肌免受DOX毒性影響的作用，而在DOX誘導(dǎo)的心肌損傷中SIRT3是一種重要的保護(hù)蛋白。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中，可以SIRT3為基點(diǎn)，深入探究YWPC在其中發(fā)揮作用的位點(diǎn)；同時(shí)，可以基于SIRT3相關(guān)的位點(diǎn)尋找能更加有效地緩解DOX誘導(dǎo)的心肌損傷的藥物。

作者貢獻(xiàn)：孫世民設(shè)計(jì)研究方案，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及后期數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制圖表等；孫珍珠負(fù)責(zé)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的造模、取材以及切片染色；池菊芳負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；郭航遠(yuǎn)提出研究思路，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。